绿茶对S荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫功能的影响课件

对对S180S180荷瘤小鼠肿瘤生长及免荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫功能的影响疫功能的影响 绿茶绿茶对S180荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫功能的影响 绿茶1 1绿茶是历史上最早的茶类,也是我国茶量最大的茶类,在国际市场上,我国绿茶占国际贸易量的70%以上,销量遍及北非、西非各国及法、美、阿富汗等 50多个国家和地区。绿茶是历史上最早的茶类,也是我国茶量最大的茶类,在国际市场2 2 联合国卫生组织颁布的“世界六大种保健饮品”依次是：第一绿茶、第二红葡萄酒、第三豆浆、第四酸奶、第五蘑菇汤、第六骨头汤。绿茶为六大保健饮品之首，被誉为“世界第一大种保健饮品”。绿茶有益健康是自古以来人们普遍认同的一种养生之道1随着生活水平的提高,人们越来越注重生活质量,具有养生作用的绿茶也越来越受欢迎。联合国卫生组织颁布的“世界六大种保健饮品”依次是：第一绿3 3 近年来，恶性肿瘤严重威胁着人类的健康，并且国内外对肿瘤的治疗及愈后较差，其原因可能是患者的免疫功能显著下降2。很多资料建议在治疗期间饮用绿茶来增强机体抵抗力，临床上应用绿茶多酚化合物以防癌的优点有：也经大量动物实验证明其有效性：无严重之副作用等3，本组对此很感兴趣，本研究旨在某点验证绿茶增强机体免疫力防癌的机制。近年来，恶性肿瘤严重威胁着人类的健康，并且国内外对肿瘤的4 41 1 材料与方法材料与方法1.1主要试剂 绿茶，刀豆蛋白A（ConA），环磷酰胺。1.2瘤源和细胞株 S180细胞和TAC-1细胞，P815细胞和CTLL-2细胞。1 材料与方法5 5 1.31.3实验动物分组实验动物分组 将昆明小鼠随机分为6组，即正常盐水对照组、荷瘤对照组、环磷酰胺对照组和三个绿茶实验组，每组10只小鼠，后五组小鼠于右腋皮下接种S180细胞（每只2106）。每日3个实验组开始经腹腔注射绿茶溶液，剂量分别为10,30,50mg/kg，荷瘤对照组注射等量生理盐水0.2ml，环磷酰胺对照组注射环磷酰20mg/kg。每日1次，连续14天后处死小鼠取实体瘤称重，同时取脾细胞测定增值反应，IL-2生长能力，NK细胞活性。1.3实验动物分组6 61.41.4试验方法试验方法1.4.1测肿瘤抑制率 停药后处死小鼠，剥离完整肿瘤组织，电子天平停药后处死小鼠，剥离完整肿瘤组织，电子天平称量瘤体湿重（精确到称量瘤体湿重（精确到0.0010.001）并计算肿瘤生长抑）并计算肿瘤生长抑制率。制率。抑制率（抑制率（）=（荷瘤对照组平均瘤重（荷瘤对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）给药组平均瘤重）/荷瘤对照荷瘤对照组平均瘤重组平均瘤重100100。注意：肿瘤组动物平均质量注意：肿瘤组动物平均质量注意：肿瘤组动物平均质量注意：肿瘤组动物平均质量 1 1表示肿瘤生长不良，实验组表示肿瘤生长不良，实验组表示肿瘤生长不良，实验组表示肿瘤生长不良，实验组小鼠死亡率超过小鼠死亡率超过小鼠死亡率超过小鼠死亡率超过2020表示药物所致毒性。表示药物所致毒性。表示药物所致毒性。表示药物所致毒性。1.4试验方法7 71.4.21.4.2小鼠脾细胞悬液的制备小鼠脾细胞悬液的制备 将小鼠处死，取脾脏，研磨，沙网过滤(200目)，加入红细胞裂解液裂解3分钟，1500r/min离心8分钟，取出淋巴细胞，生理盐水冲洗2次，800r/min离心10分钟,RP-MI1640 培养液调细胞浓度为5106 ml-1，37，5%CO2饱和湿度培养，备用。1.4.2小鼠脾细胞悬液的制备8 8 1.4.3 ConA1.4.3 ConA诱导的脾细胞增值反应诱导的脾细胞增值反应 采用常规采用常规H-TdRH-TdR掺入法掺入法。将制备的小鼠脾细胞悬液用。将制备的小鼠脾细胞悬液用RP-MI1640RP-MI1640培养液制成培养液制成2102107 7mlml-1-1细胞悬液，每孔细胞悬液，每孔1ml1ml分装到分装到2424孔培养板中，每孔加入孔培养板中，每孔加入ConA3gConA3g于于COCO2 2培养箱培养箱3737孵育孵育5656小时后，加入小时后，加入3 3H-TdRH-TdR达到终浓度达到终浓度37KBq/ml37KBq/ml后继续置后继续置COCO2培养箱培养箱3737孵育孵育1616小时后，将各孔细胞收小时后，将各孔细胞收集到玻璃纤维纸上，置于集到玻璃纤维纸上，置于FJ-2100FJ-2100型液体闪烁计数器测型液体闪烁计数器测定并计算定并计算dpmdpm值。值。1.4.3 ConA诱导的脾细胞增值反应9 9 1.4.4 IL-21.4.4 IL-2的诱生和活性测定的诱生和活性测定 将制备的小鼠脾细胞悬液用含将制备的小鼠脾细胞悬液用含10%10%小牛血清的小牛血清的RP-RP-MI1640MI1640培养液培养液调整浓度为调整浓度为5105106 6mlml-1-1，接种于，接种于2424孔培养孔培养板，每孔板，每孔500ml500ml，每孔再加入终浓度，每孔再加入终浓度5g/ml5g/ml的的ConAConA，500g/500g/孔，孔，3737 5%CO 5%CO2 2培养箱没培养培养箱没培养2424小时后离心取小时后离心取上清，备用。取传代培养上清，备用。取传代培养4848小时的小时的CTLL-2CTLL-2细胞，用培养细胞，用培养液离心洗涤液离心洗涤2 2次，每次次，每次1000r/min1000r/min离心离心5 5分钟，再用含分钟，再用含10%10%小牛血清的小牛血清的RP-MI1640RP-MI1640培养液调整浓度为培养液调整浓度为1101106 6mlml-1 1，接种于，接种于9696孔培养板孔培养板100l/100l/孔，同时将待测样品也加孔，同时将待测样品也加入培养板入培养板100l/100l/孔，置于孔，置于COCO2 2培养箱培养箱3737孵育孵育5656小时后，小时后，加入加入3 3H-TdRH-TdR达到终浓度达到终浓度37KBq/ml37KBq/ml后继续置后继续置COCO2 2培养箱培养箱3737孵育孵育1616小时后，将各孔细胞收集到玻璃纤维纸上，小时后，将各孔细胞收集到玻璃纤维纸上，置于置于FJ-2100FJ-2100型液体闪烁计数器测定并计算型液体闪烁计数器测定并计算dpmdpm值。值。1.4.4 IL-2的诱生和活性测定10101.4.5 NK1.4.5 NK细胞活性测定细胞活性测定 将制备的小鼠脾细胞悬液用含将制备的小鼠脾细胞悬液用含10%10%小牛血清的小牛血清的RP-RP-MI1640MI1640培养液培养液调整浓度为调整浓度为5105106 6mlml-1-1于于9696孔培养板，每孔培养板，每孔中分别加入孔中分别加入100g100g脾细胞悬液和脾细胞悬液和YAC-1YAC-1细胞，靶细胞细胞，靶细胞（YAC-1YAC-1细胞，浓度细胞，浓度11051105个个/ml/ml，效靶比值，效靶比值50:1150:11，设，设靶细胞自然释放组和最大释放对照组（靶细胞自然释放组和最大释放对照组（YAC-1YAC-1细胞细胞100g+1%NP-40 100g100g+1%NP-40 100g）。每样本是）。每样本是3 3个重复孔，培个重复孔，培养养1616小时后，吸出各孔上清小时后，吸出各孔上清100g100g加入另一细胞培养板加入另一细胞培养板中置于中置于3737培养箱中培养培养箱中培养1010分钟，每孔加入新鲜配制的分钟，每孔加入新鲜配制的底物液底物液100l100l室温，避光反应室温，避光反应10101515分钟，再加入柠檬分钟，再加入柠檬终止液终止液30l30l酶标分析仪酶标分析仪570nm570nm波长处测定波长处测定A A值。按一下值。按一下公式计算公式计算NKNK细胞杀伤靶细胞活性。细胞杀伤靶细胞活性。NKNK细胞活性（细胞活性（%）=（实验组（实验组A-A-自然释放组自然释放组A A）/(/(最大释放组最大释放组A-A-自然释放组自然释放组A)A)100%100%。1.4.5 NK细胞活性测定11112 结果预测结果预测2 结果预测12122.1 2.1 绿茶对绿茶对S180S180肉瘤抑制作用肉瘤抑制作用 不同剂量的绿茶对荷瘤小鼠的肿瘤具有明显的抑制作用，不同剂量的绿茶对荷瘤小鼠的肿瘤具有明显的抑制作用，与荷瘤对照组、环磷酰胺比较有显著的差异。与荷瘤对照组、环磷酰胺比较有显著的差异。2.2 2.2 绿茶对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖和绿茶对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖和IL-2IL-2产生能力的产生能力的影响影响 荷瘤对照组小鼠脾细胞增值能力和荷瘤对照组小鼠脾细胞增值能力和IL-2IL-2产生能力均较正产生能力均较正常对照组小鼠明显下降，不同剂量绿茶治疗组小鼠淋巴常对照组小鼠明显下降，不同剂量绿茶治疗组小鼠淋巴细胞增值和细胞增值和IL-2IL-2水平均显著高于荷瘤对照组，且呈剂量水平均显著高于荷瘤对照组，且呈剂量依赖性依赖性。2.3 绿茶对荷瘤小鼠脾NK细胞活性的影响 荷瘤对照组脾荷瘤对照组脾NKNK细胞活性显著低于正常对照组，体内细胞活性显著低于正常对照组，体内注释绿茶组小鼠的注释绿茶组小鼠的NKNK细胞活性明显高于荷瘤对照组，细胞活性明显高于荷瘤对照组，且能达到正常对照组水平。且能达到正常对照组水平。绿茶对S荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫功能的影响课件13133 讨论分析讨论分析3 讨论分析1414 绿茶绿茶是众所周知的健康饮品是众所周知的健康饮品,它具有多种治疗它具有多种治疗和保健功效和保健功效,越来越受人们的欢迎。茶多酚越来越受人们的欢迎。茶多酚(GTP)是是从绿茶中提取的主要活性成分从绿茶中提取的主要活性成分,占茶叶干重的占茶叶干重的 30%,包括黄烷醇类、黄烷双醇、黄酮类和酚酸包括黄烷醇类、黄烷双醇、黄酮类和酚酸4。目前。目前,国内外学者对茶多酚进行了大量的研究国内外学者对茶多酚进行了大量的研究,表明茶多表明茶多酚具有增强机体抵抗力，诱导动物免疫系统的多种酚具有增强机体抵抗力，诱导动物免疫系统的多种细胞因子细胞因子,促进干扰素、白细胞介素等的合成促进干扰素、白细胞介素等的合成,具有具有清除体内自由基、抗脂质过氧化作用清除体内自由基、抗脂质过氧化作用,能激活巨噬能激活巨噬细胞细胞(M )、自然杀伤、自然杀伤(NK)细胞和细胞和B、T 淋巴细胞，淋巴细胞，激活补体系统，提高抗体水平激活补体系统，提高抗体水平5。15 本实验通过用环磷酰胺作用阳性对照组，本实验通过用环磷酰胺作用阳性对照组，来分析绿茶的抗瘤效果。来分析绿茶的抗瘤效果。环磷酰胺是临床常环磷酰胺是临床常用的化疗药物用的化疗药物，其能有效地杀伤癌细胞，但，其能有效地杀伤癌细胞，但与此同时也对人体产生不同程度的毒副作用，与此同时也对人体产生不同程度的毒副作用，其中主要有骨髓抑制、免疫功能低下和白细其中主要有骨髓抑制、免疫功能低下和白细胞减少症。本实验即使之与荷瘤对照组进行胞减少症。本实验即使之与荷瘤对照组进行比较易于分析。比较易于分析。本实验通过用环磷酰胺作用阳性对照组，来分析绿茶的抗瘤16 IL-2是由活化的是由活化的Th细胞分泌的一种细胞增细胞分泌的一种细胞增殖因子，具有多种生物学活性，如能够促进殖因子，具有多种生物学活性，如能够促进T细胞、细胞、B细胞增殖分化和刺激细胞增殖分化和刺激NK细胞的生长，细胞的生长，激活巨噬细胞，促进激活巨噬细胞，促进CTL功能，在集体功能，在集体的免的免疫应答和调节中起到重要的作用。疫应答和调节中起到重要的作用。另有研究另有研究表明表明，IL-2能促进外周血单核细胞产生能促进外周血单核细胞产生TNF，从而增强抗肿瘤的作用从而增强抗肿瘤的作用6。由于。由于IL-2的含量与的含量与细胞免疫功能密切相关，因此可将细胞免疫功能密切相关，因此可将IL-2产生产生作为细胞免疫应答的主要指标。作为细胞免疫应答的主要指标。IL-2是由活化的Th细胞分泌的一种细胞增殖因子，具17 NK细胞不需预先致敏即能分泌细胞毒性因细胞不需预先致敏即能分泌细胞毒性因子杀伤肿瘤细胞，抗瘤谱广，无肿瘤特异性子杀伤肿瘤细胞，抗瘤谱广，无肿瘤特异性和和MHC限制性，也能释放限制性，也能释放IFN-、IL-1、IL-2等细胞因子来发挥天然防疫系统。等细胞因子来发挥天然防疫系统。有研究表有研究表明明，随着，随着NK细胞活性的降低，肿瘤发生率增细胞活性的降低，肿瘤发生率增加加7。因此提高机体。因此提高机体NK细胞活性，对于肿瘤细胞活性，对于肿瘤的预防和预测都有重要的价值。的预防和预测都有重要的价值。NK细胞不需预先致敏即能分泌细胞毒性因子杀伤肿瘤细18【参考文献】【参考文献】1赵春颂.绿茶的营养保健功能J.营养,2003,17(2):17.2艾今霞，刘良.艾迪针剂对和瘤小鼠免疫功能的影响J.中国免疫学杂志，2010,26（3）：224227.3山根哲郎.绿茶儿茶素的药理作用及其临床应用J.日本医学介绍,2001,22(3):100101.4雷蕾.绿茶药理研究进展J.海峡药学,2007,19(6):1517.5李振,陈现伟.茶多酚的免疫调节作用及应用J.中国兽药杂志,2004,38(4):3335.6 苗立成，王立强等.芦荟凝胶对小鼠免疫及抗肿瘤作用的实验研究J.解放军药学学报，2002,19（2）：8789.7 宁安红，曹倩等.灵芝多糖对荷瘤小鼠免疫系统的影响J.中国微生态学杂志,2004,16(1):1314.【参考文献】19Thank you!Thank you!2020