第十一章固相膜免疫测定课件

第十一章固相膜免疫第十一章固相膜免疫测定定第十一章固相膜免疫测定第十一章固相膜免疫测定第十一章固相膜免4.ELISA4.ELISA双抗体夹心法是双抗体夹心法是 ()()A.A.酶标记特异抗体用于抗原的检测酶标记特异抗体用于抗原的检测B.B.先将待测抗原包被于固相载体先将待测抗原包被于固相载体C.C.标记一种抗体可检测多种抗原标记一种抗体可检测多种抗原D.D.能用于半抗原的测定能用于半抗原的测定E.E.属竞争结合测定属竞争结合测定5.5.捕获法主要用于何种物质的测定捕获法主要用于何种物质的测定 A.IgM B.IgG C.IgA D.IgDA.IgM B.IgG C.IgA D.IgD ()()AA2021/4/2724.ELISA双抗体夹心法是()AA2021/4/26 6、下列哪种方法用一种标记物可检测多种被测物、下列哪种方法用一种标记物可检测多种被测物 ()()A.ELISA双抗体夹心法 B.ELISA竞争法C.ELISA间接法 D.ELISA捕获法E.放射免疫测定法7.7.关于关于ELISAELISA竟争法竟争法,正确的是正确的是 ()()A.A.用于检测抗原 B.被测物与酶标记物的免疫活性各不相同 C.被测物多则标记物被结合的机会少 D.待测管的颜色比参照管的淡表示被测物量少E.结合于固相的酶标抗原量与样品中被测抗原量成正比CC2021/4/2736、下列哪种方法用一种标记物可检测多种被测物 ()C1.1.每个亲和素能结合多少个分子的生物素每个亲和素能结合多少个分子的生物素A.1 B.2 C.3 D.4 A.1 B.2 C.3 D.4 2.2.生物素分子中与亲和素结合的主要部位是生物素分子中与亲和素结合的主要部位是 ()()A.A.噻吩环噻吩环 B.B.咪唑酮环咪唑酮环 C.C.苯环苯环 D.D.羰基羰基 E.-NH-E.-NH-3.3.在用生物素标记酶时在用生物素标记酶时,酶活性会降低的是酶活性会降低的是A.HRP B.A.HRP B.葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 C.-Gal D.AP ()C.-Gal D.AP ()BD2021/4/2741.每个亲和素能结合多少个分子的生物素A.1 B.2第十一章第十一章固相膜免疫分析技术固相膜免疫分析技术2021/4/275第十一章固相膜免疫分析技术2021/4/275l掌握：掌握：免疫印迹试验免疫印迹试验l熟悉：熟悉：胶体金免疫技术的方法胶体金免疫技术的方法学种类与原理学种类与原理l了解：了解：胶体金与免疫金的制备、胶体金与免疫金的制备、其他膜载体免疫分析技术其他膜载体免疫分析技术2021/4/276掌握：免疫印迹试验2021/4/276一一 概述概述二二 免疫层析试验免疫层析试验三三 免疫渗滤试验免疫渗滤试验四四 斑点酶联免疫吸附试验斑点酶联免疫吸附试验五五 免疫印迹试验免疫印迹试验六六 影响固相膜免疫试验的主要因素影响固相膜免疫试验的主要因素七七 固相膜免疫分析技术的临床应用固相膜免疫分析技术的临床应用2021/4/277一 概述2021/4/277概述概述l固相膜免疫分析技术固相膜免疫分析技术(solid phase membrane-based immunoassay)l特点特点:以以微孔膜微孔膜作为固相载体作为固相载体 多孔性多孔性,非共价键高度吸附抗原或抗体非共价键高度吸附抗原或抗体 易于漂洗易于漂洗2021/4/278概述2021/4/278第二节第二节 免疫层析试验免疫层析试验免疫层析试验原理：免疫层析试验原理：以以NCNC膜膜等为固相载体，等为固相载体，样品样品溶液借助毛细溶液借助毛细作用在层析条上作用在层析条上泳动泳动，同时样品中的待测物与，同时样品中的待测物与层析材料上待测物的受体（层析材料上待测物的受体（抗原或抗体）发生抗原或抗体）发生高特异性、高亲和性的免疫反应高特异性、高亲和性的免疫反应，层析过程中，层析过程中免疫复合物被富集或截留免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区在层析材料的一定区域，通过域，通过目测或仪器检测目测或仪器检测标记物，在短时间内标记物，在短时间内得到直观的实验结果。得到直观的实验结果。2021/4/279第二节 免疫层析试验免疫层析试验原理：2021/4/27l毛细作用l是指浸润液体在细管里升高的现象和不浸润液体在细管里降低的现象2021/4/2710毛细作用2021/4/2710第二节第二节 免疫层析试验免疫层析试验免疫层析试验分为：免疫层析试验分为：l胶体金免疫层析试验（胶体金免疫层析试验（ICAICA）l荧光免疫层析试验（荧光免疫层析试验（GICAGICA）2021/4/2711第二节 免疫层析试验免疫层析试验分为：2021/4/27 二、二、测定模式测定模式（一）胶体金免疫层析试验（一）胶体金免疫层析试验l1、双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原l2 2、竞争法测小分子抗原、竞争法测小分子抗原l3 3、间接法测抗体、间接法测抗体 2021/4/2712 二、测定模式（一）胶体金免疫层析试验1、l胶体金免疫层析试胶体金免疫层析试验验A AG GC CB B双抗体夹心法测大分子抗原双抗体夹心法测大分子抗原（阳性，（阳性，2个条带）个条带）2021/4/2713胶体金免疫层析试验AGCB双抗体夹心法测大分子抗原2021/l胶体金免疫层析试验胶体金免疫层析试验A AG GC CB B竞争法测小分子抗原（阴性，竞争法测小分子抗原（阴性，2个条带）个条带）2021/4/2714胶体金免疫层析试验AGCB竞争法测小分子抗原（阴性，2个条带 三三 技术要点技术要点l操作要点：操作要点：（1 1）将试剂条标记线一端浸入待测标本中）将试剂条标记线一端浸入待测标本中2-5s,2-5s,或或在标本加样处加一定量待检标本在标本加样处加一定量待检标本,平放于水平桌平放于水平桌面上面上（2 2）在）在5-205-20分钟内观察结果分钟内观察结果结果判断结果判断 夹心法：阴性夹心法：阴性:1:1条棕红色指控条带条棕红色指控条带 阳性阳性:出现出现2 2条棕红色条带条棕红色条带 无棕红色条带出现为试剂失效无棕红色条带出现为试剂失效竞争法：竞争法：阴性阴性:出现出现2 2条棕红色条带。条棕红色条带。阳性阳性:1:1条棕红色指控条带条棕红色指控条带2021/4/2715 三 技术要点2021/4/2715 第三节第三节 免疫渗滤试验免疫渗滤试验1 1 原理原理l在在硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜为载体并为载体并包被了抗原或包被了抗原或抗体抗体的渗滤装置中，的渗滤装置中，依次滴加标本、免依次滴加标本、免疫金及洗涤液疫金及洗涤液，因微孔滤膜贴置于吸水，因微孔滤膜贴置于吸水材料上故溶液流经渗滤装置时与膜上的材料上故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到检测目的。达到检测目的。2 2 方法类型方法类型双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原间接法测特异性抗体间接法测特异性抗体2021/4/2716 第三节 免疫渗滤试验1 原理2021/4/2716三、试剂盒组成和技术要点三、试剂盒组成和技术要点 渗滤装置渗滤装置胶体金标志物胶体金标志物洗涤液洗涤液AgAg参照参照品品2021/4/2717三、试剂盒组成和技术要点 渗滤装置2021/4/2717技术要点：技术要点：1 1、平放反应板，于小孔内滴加含待测、平放反应板，于小孔内滴加含待测AgAg标本标本1-21-2滴，与膜上的滴，与膜上的AbAb反应而结合在膜上反应而结合在膜上2 2、于小孔内滴加胶体金标记、于小孔内滴加胶体金标记AbAb试剂试剂1-21-2滴，滴，使胶体金标记使胶体金标记AbAb与结合在膜上的与结合在膜上的AgAg反应反应3 3、于小孔内滴加洗涤液、于小孔内滴加洗涤液2-32-3滴，待完全渗入，滴，待完全渗入，洗去未结合的胶体金标记洗去未结合的胶体金标记AbAb。4 4、结果观察：、结果观察：阳性阳性 膜中央有淡红色或红色斑点膜中央有淡红色或红色斑点 2021/4/2718技术要点：1、平放反应板，于小孔内滴加含待测Ag标本1-2滴第四节第四节.斑点酶免疫吸斑点酶免疫吸附试验附试验 (Dot-ELISA)(Dot-ELISA)2021/4/2719第四节.斑点酶免疫吸附试验(Dot-ELISA)2021/l技术要点：技术要点：1 1、抗原包被、抗原包被 NCNC膜吸附力强，包被后封闭。膜吸附力强，包被后封闭。2 2、抗原抗体反应、抗原抗体反应 抗原抗体反应后再加二抗抗原抗体反应后再加二抗3 3、确定酶结合物最佳稀释度、确定酶结合物最佳稀释度阴性样品不显色，阳性显色最强时的酶结合物稀释度阴性样品不显色，阳性显色最强时的酶结合物稀释度4 4、显色反应、显色反应 pH值值5.8-6.0时反应最灵敏时反应最灵敏强阳性蓝黑色斑点强阳性蓝黑色斑点 弱阳性淡绿色半点弱阳性淡绿色半点2021/4/2720技术要点：2021/4/2720l方法学评价：方法学评价：1 1、NCNC吸附力强，吸附力强，灵敏度较灵敏度较ELISAELISA高高6 68 8倍；倍；2 2、可同时检测多种抗体；、可同时检测多种抗体；3 3、操作简便不需特殊仪器设备、操作简便不需特殊仪器设备4 4、吸附抗原（抗体）或已有结果的、吸附抗原（抗体）或已有结果的NCNC膜可长期保存，不影响期活性。膜可长期保存，不影响期活性。2021/4/2721方法学评价：2021/4/2721 第五节第五节.免疫印迹试验免疫印迹试验 （immunoblot test,IBT）l免疫印迹试验免疫印迹试验将凝胶电泳的高分辨率与抗原抗体将凝胶电泳的高分辨率与抗原抗体反应的高特异性结合反应的高特异性结合.又称又称Western blot.是检测蛋白质特性、表达及分是检测蛋白质特性、表达及分布的一种最常用的方法。布的一种最常用的方法。l蛋白免疫印迹试验蛋白免疫印迹试验l重组免疫印迹试验重组免疫印迹试验2021/4/2722 第五节.免疫印迹试验 （immun 二二 Western blot技术要点技术要点 :1.1.抗原印迹与包被抗原印迹与包被（SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳）电转移电转移 2.2.抗原抗体反应抗原抗体反应 （间接法）（间接法）3.3.检测检测2021/4/2723 二 Western blot技术要点:动画2021/lSDS-PAGESDS-PAGE 抗原等蛋白样品经抗原等蛋白样品经SDSSDS处理后带处理后带阴电荷，在聚丙烯胺凝胶中从阴极阴电荷，在聚丙烯胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区可见（只有在染色后才显出电泳区带）带）2021/4/2724SDS-PAGE2021/4/27242021/4/27252021/4/2725l电转移电转移 将在凝胶中已经分离的条带转将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V100V）和大电流（）和大电流（1-2A1-2A），通电），通电45min45min转移即可完成。此分阶段分离转移即可完成。此分阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。的蛋白质条带肉眼仍不可见。2021/4/2726电转移2021/4/27262021/4/27272021/4/2727l酶免疫定位酶免疫定位 将印有蛋白质条带的硝酸纤维素将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体和酶标第二抗体膜依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。阳性反应酶反应底物，使区带染色。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGESDS-PAGE加入的分子量标准，确定各组分的分加入的分子量标准，确定各组分的分子量。子量。2021/4/2728酶免疫定位2021/4/2728免免 疫疫 印印 迹迹 法法 2021/4/2729免 疫 印 迹 法 2021/4/27292021/4/27302021/4/2730l（三）方法学评价：（三）方法学评价：1 1、特异性强、特异性强2 2、吸附蛋白能力强、吸附蛋白能力强3 3、可同时检测多种抗体、可同时检测多种抗体4 4、膜条的重复检测应用、膜条的重复检测应用2021/4/2731（三）方法学评价：2021/4/2731第六节第六节 影响固相膜免疫试验的主要因素影响固相膜免疫试验的主要因素一一 试剂方面试剂方面二二 标本方面标本方面三三 实验过程实验过程第七节第七节 固相膜免疫分析技术的临床应用固相膜免疫分析技术的临床应用 激素、自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤、激素、自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤、心血管疾病、过敏原和毒品。心血管疾病、过敏原和毒品。2021/4/2732第六节 影响固相膜免疫试验的主要因素2021/4/2732谢谢谢谢