第二章基因工程制药(一)课件

第二章第二章 基因工程制药基因工程制药(一）一）1 1第二章第二章 基因工程制药基因工程制药第二章 基因工程制药(一）1第二章 基因工程制药一、概述一、概述n n生物技术的核心就是基因工程，基因工程生物技术的核心就是基因工程，基因工程技术最成功的应用就是用于生物治疗的新技术最成功的应用就是用于生物治疗的新型生物药物的研制。型生物药物的研制。n n传统生物药物由于来源及制备上的困难、传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素的影响，此外在制备过程可能价格等因素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等问题，促使人们寻求安全、实用、疗效可问题，促使人们寻求安全、实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物。靠的新方法来制备生物药物。2 2第二章第二章 基因工程制药基因工程制药一、概述生物技术的核心就是基因工程，基因工程技术最成功的应用 n n应用基因工程技术可十分方便且有应用基因工程技术可十分方便且有效地解决上述提到的问题，从量、效地解决上述提到的问题，从量、质上都可以得到改进，且可以创造质上都可以得到改进，且可以创造全新物质。全新物质。n n癌症、病毒性疾病、心血管疾病以癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊及内分泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基因工程技术获得。断已可通过基因工程技术获得。3 3第二章第二章 基因工程制药基因工程制药 应用基因工程技术可十分方便且有效地解决上述提到的问题，从量利用基因工程技术生产的药物利用基因工程技术生产的药物 包括医用活性蛋白和多肽：包括医用活性蛋白和多肽：n n免疫性蛋白，各种抗原和单克隆抗体；免疫性蛋白，各种抗原和单克隆抗体；n n细胞因子，干扰素、白介素、生长因细胞因子，干扰素、白介素、生长因子；子；n n激素激素:胰岛素、生长激素；胰岛素、生长激素；n n酶类酶类:尿激酶、链激酶、蚓激酶、超氧尿激酶、链激酶、蚓激酶、超氧化物歧化酶。化物歧化酶。4 4第二章第二章 基因工程制药基因工程制药利用基因工程技术生产的药物 包括医用活性蛋白和多肽：4利用基因工程技术生产药物的优点利用基因工程技术生产药物的优点 n n可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障；等），为临床使用提供有效的保障；n n可以提供足够数量的生理活性物质，以便可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；从而扩大这些物质的应用范围；n n利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；内源性生理活性物质；5 5第二章第二章 基因工程制药基因工程制药利用基因工程技术生产药物的优点 可以大量生产过去难以获得的生利用基因工程技术生产药物的优点利用基因工程技术生产药物的优点n n内源生理活性物质在作为药物使用时存在内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；程进行改造和去除；如白细胞介素如白细胞介素如白细胞介素如白细胞介素-2-2-2-2的第的第的第的第125125125125位半胱氨酸是游离的，位半胱氨酸是游离的，位半胱氨酸是游离的，位半胱氨酸是游离的，有可能引起有可能引起有可能引起有可能引起-S-S-S-S-S-S-S-S-键的错配而导致活性下降，如将键的错配而导致活性下降，如将键的错配而导致活性下降，如将键的错配而导致活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素-2-2-2-2的活性以及热稳定性均有提高；的活性以及热稳定性均有提高；的活性以及热稳定性均有提高；的活性以及热稳定性均有提高；n n可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。6 6第二章第二章 基因工程制药基因工程制药利用基因工程技术生产药物的优点内源生理活性物质在作为药物使用二、基因工程药物生产的基本过程二、基因工程药物生产的基本过程 基因工程技术就是将重组对象的目基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。在工程菌内进行复制和表达的技术。7 7第二章第二章 基因工程制药基因工程制药二、基因工程药物生产的基本过程 基因工程技术就是将重组对象基因工程药物制造的主要程序基因工程药物制造的主要程序 获得目的基因获得目的基因组建重组质粒组建重组质粒构建基因工程菌或细胞构建基因工程菌或细胞培养工程菌培养工程菌产物分离纯化产物分离纯化除菌过滤除菌过滤半成品检验半成品检验成品检验成品检验原料包装原料包装8 8第二章第二章 基因工程制药基因工程制药基因工程药物制造的主要程序 获得目的基因组建重组质粒构建基因9 9第二章第二章 基因工程制药基因工程制药9第二章 基因工程制药基因工程药物生产的上游和基因工程药物生产的上游和下游技术下游技术n n上游技术上游技术：主要指的是目的基因分：主要指的是目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成；阶段的工作主要在实验室内完成；n n下游技术下游技术：主要指的是从工程菌：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。品的分离纯化、质量控制等。1010第二章第二章 基因工程制药基因工程制药基因工程药物生产的上游和下游技术上游技术：主要指的是目的基三、目的基因的获得三、目的基因的获得 n n对于原核生物，其基因总量不大，可以选用合适对于原核生物，其基因总量不大，可以选用合适的限制性核酸内切酶切下目的基因。的限制性核酸内切酶切下目的基因。n n对于真核生物不能进行直接分离。真核细胞中基对于真核生物不能进行直接分离。真核细胞中基因总量较大，从染色体中直接分离纯化目的基因因总量较大，从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难。极为困难。n n另外，真核基因一般都有内含子，如果以原核细另外，真核基因一般都有内含子，如果以原核细胞作为表达系统，即使分离出真核基因，由于原胞作为表达系统，即使分离出真核基因，由于原核细胞缺乏核细胞缺乏mRNA mRNA 转录后的加工系统，真核基因转转录后的加工系统，真核基因转录的录的mRNA mRNA 也不能被加工、拼接成为成熟的也不能被加工、拼接成为成熟的mRNA mRNA，因此不能直接克隆真核基因。，因此不能直接克隆真核基因。1111第二章第二章 基因工程制药基因工程制药三、目的基因的获得 对于原核生物，其基因总量不大，可以选用合克隆真核基因的方法克隆真核基因的方法 逆转录法 化学合成法1212第二章第二章 基因工程制药基因工程制药克隆真核基因的方法 逆转录法12第二章 基因工程什么是逆转录法什么是逆转录法n n先分离纯化目的基因的先分离纯化目的基因的先分离纯化目的基因的先分离纯化目的基因的mRNAmRNAmRNAmRNA，再反转录成互补，再反转录成互补，再反转录成互补，再反转录成互补cDNAcDNAcDNAcDNA，然后进行互补，然后进行互补，然后进行互补，然后进行互补cDNA cDNA cDNA cDNA 的克隆表达。的克隆表达。的克隆表达。的克隆表达。n n从产生该蛋白质的真核细胞中提取从产生该蛋白质的真核细胞中提取从产生该蛋白质的真核细胞中提取从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNAmRNAmRNAmRNA，以其为，以其为，以其为，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质质质质mRNAmRNAmRNAmRNA的互补的互补的互补的互补DNA(complementary DNA)DNA(complementary DNA)DNA(complementary DNA)DNA(complementary DNA)，再以互，再以互，再以互，再以互补补补补DNA DNA DNA DNA 为模板，在逆转录酶或为模板，在逆转录酶或为模板，在逆转录酶或为模板，在逆转录酶或DNA DNA DNA DNA 聚合酶作用下，聚合酶作用下，聚合酶作用下，聚合酶作用下，最终合成编码该蛋白质的双链最终合成编码该蛋白质的双链最终合成编码该蛋白质的双链最终合成编码该蛋白质的双链DNA DNA DNA DNA 序列。序列。序列。序列。n n该序列不含内含子。该序列不含内含子。该序列不含内含子。该序列不含内含子。1313第二章第二章 基因工程制药基因工程制药什么是逆转录法先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成互补c逆转录法的步骤逆转录法的步骤n nmRNAmRNA的纯化的纯化n ncDNAcDNA第一链的合成第一链的合成n ncDNAcDNA第二链的合成第二链的合成n ncDNAcDNA克隆克隆n n将重组体导入宿主细胞将重组体导入宿主细胞n ncDNAcDNA文库的鉴定文库的鉴定n n目的目的cDNAcDNA克隆的分离和鉴定克隆的分离和鉴定1414第二章第二章 基因工程制药基因工程制药逆转录法的步骤mRNA的纯化14第二章 基因工程制药mRNA 的纯化的纯化 n n 细胞内含有三种细胞内含有三种RNARNA，mRNA mRNA 占占RNA RNA 总量的总量的2%-5%2%-5%，相对分子量大小不一致，分离也有很大的困难。，相对分子量大小不一致，分离也有很大的困难。n n 但是但是mRNA mRNA 的的33末端常含有一多聚腺苷酸末端常含有一多聚腺苷酸（polyApolyA）组成的末端，长达）组成的末端，长达20-250 20-250 个腺苷酸，个腺苷酸，足以吸附于寡聚胸苷酸（足以吸附于寡聚胸苷酸（Oligo dTOligo dT）-纤维素上，纤维素上，从而可以用亲和层析法将从而可以用亲和层析法将mRNA mRNA 从细胞总从细胞总RNA RNA 上分上分离出来，可得到纯度较高的离出来，可得到纯度较高的mRNAmRNA。mRNA(messengerRNA)，信使，信使RNA rRNA(（ribosomal RNA），核糖体），核糖体RNA，tRNA(（tranfer RNA），转移），转移tRNA）、）、1515第二章第二章 基因工程制药基因工程制药mRNA 的纯化 细胞内含有三种RNA，mRNA 占RNmRNA 的纯化的纯化n n用高浓度盐溶液使用高浓度盐溶液使mRNA特异结合于特异结合于寡聚寡聚dT。n n再以低盐溶液和蒸馏水将其洗脱，经再以低盐溶液和蒸馏水将其洗脱，经过两次寡聚过两次寡聚dT，可得到较纯的，可得到较纯的mRNA。1616第二章第二章 基因工程制药基因工程制药mRNA 的纯化用高浓度盐溶液使mRNA特异结合于寡聚dT。cDNA第一链的合成第一链的合成n n一般一般mRNA都带有都带有3-polyA，所以可用，所以可用寡聚寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化作为引物，在逆转录酶的催化下，开始下，开始cDNA链的合成。链的合成。n n在合成反应体系中加入一种放射性标在合成反应体系中加入一种放射性标记的记的dNTP，在反应中以及反应后可通，在反应中以及反应后可通过测定放射性标记的过测定放射性标记的dNTP掺入量，计掺入量，计算出算出cDNA的合成效率。的合成效率。1717第二章第二章 基因工程制药基因工程制药cDNA第一链的合成一般mRNA都带有3-polyA，所以cDNA第一链的合成第一链的合成n n在凝胶电泳后，进行放射自显影分在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分子大小，探索最佳反应析产物的分子大小，探索最佳反应条件。条件。n n一次好的逆转录反应可使寡聚一次好的逆转录反应可使寡聚dT选出的选出的mRNA有有5%30%被拷贝。被拷贝。1818第二章第二章 基因工程制药基因工程制药cDNA第一链的合成在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分cDNA第二链的合成第二链的合成n n先用碱解或先用碱解或RNaseH酶解酶解的方法除去的方法除去cDNA-mRNA杂交链中的杂交链中的mRNA链，然链，然后以后以cDNA第一链为模板第一链为模板合成第二链。合成第二链。n n由于第一链由于第一链cDNA链链3末端末端往往形成一个发夹形结构，往往形成一个发夹形结构，所以，可以从这一点开始所以，可以从这一点开始合成合成cDNA第二链。第二链。核糖核酸酶核糖核酸酶H(RNase H)是一种核是一种核糖核酸内切酶，它能糖核酸内切酶，它能够特异性地水解杂交够特异性地水解杂交DNA链上的链上的RNA磷磷酸二酯键，故能分解酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系杂交体系中的中的RNA链。该酶链。该酶不能消化单链或双链不能消化单链或双链DNA。1919第二章第二章 基因工程制药基因工程制药cDNA第二链的合成先用碱解或RNaseH酶解的方法除去cDcDNA第二链的合成第二链的合成n n此反应是在此反应是在DNA聚合酶聚合酶I催化下完催化下完成的。核酸酶成的。核酸酶S1专一性切除单链专一性切除单链DNA，因此用它可以切除发夹结构。，因此用它可以切除发夹结构。n n发夹结构结构切除后，双链发夹结构结构切除后，双链cDNA分子的大小常用变性琼脂糖凝胶电分子的大小常用变性琼脂糖凝胶电泳进行测定。泳进行测定。2020第二章第二章 基因工程制药基因工程制药cDNA第二链的合成此反应是在DNA聚合酶I催化下完成的。核cDNA克隆克隆n n用于用于cDNA克隆的载体有两类：质粒克隆的载体有两类：质粒DNA（如（如pUC、pBR322等）和噬菌体等）和噬菌体DNA（如（如 gt10、gt11等）。等）。n n根据重组后插入的根据重组后插入的cDNA是否能够表达、是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白质，又将能否经转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为表达型和非表达型载体。载体分为表达型和非表达型载体。n npUC及及 gt11为表达型载体，在为表达型载体，在cDNA插入位置的上游具有启动基因顺序；插入位置的上游具有启动基因顺序；而而pBR322及及 gt10为非表达型载体。为非表达型载体。2121第二章第二章 基因工程制药基因工程制药cDNA克隆用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA（如pUcDNA克隆克隆n n在在cDNA克隆操作中应该根据不同的需克隆操作中应该根据不同的需要选择适当的载体。要选择适当的载体。n ncDNA插入片段小于插入片段小于10kb，可选质粒载，可选质粒载体，如大于体，如大于10kb则应选用噬菌体则应选用噬菌体DNA为载体。为载体。n n选用表达型载体可以增加目的基因的选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的筛选。筛选方法，有利于目的基因的筛选。2222第二章第二章 基因工程制药基因工程制药cDNA克隆在cDNA克隆操作中应该根据不同的需要选择适当的将重组体导入宿主细胞将重组体导入宿主细胞n n体外包装的体外包装的 噬菌体，感染感受噬菌体，感染感受态大肠杆菌形成噬菌斑。态大肠杆菌形成噬菌斑。n n或转化感受态大肠杆菌使质粒进或转化感受态大肠杆菌使质粒进入细胞内。入细胞内。2323第二章第二章 基因工程制药基因工程制药将重组体导入宿主细胞体外包装的噬菌体，感染感受态大肠杆菌形cDNA文库的鉴定文库的鉴定n n根据重组体的表型进行筛选，主要根据重组体的表型进行筛选，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑颜色改变法。颜色改变法。n n然后采用凝胶电泳、分子杂交、然后采用凝胶电泳、分子杂交、DNADNA序列分析测定等方法进行进一序列分析测定等方法进行进一步筛选和鉴定。步筛选和鉴定。2424第二章第二章 基因工程制药基因工程制药cDNA文库的鉴定根据重组体的表型进行筛选，主要有抗性基因失目的目的cDNA克隆的分离和鉴定克隆的分离和鉴定 从从从从cDNAcDNA文库中分离特异的文库中分离特异的文库中分离特异的文库中分离特异的cDNAcDNA克隆主要采用：克隆主要采用：克隆主要采用：克隆主要采用：n n核酸探针杂交法核酸探针杂交法核酸探针杂交法核酸探针杂交法：用层析和高分辨电泳等技术纯：用层析和高分辨电泳等技术纯：用层析和高分辨电泳等技术纯：用层析和高分辨电泳等技术纯化微克量的目的蛋白质。化微克量的目的蛋白质。化微克量的目的蛋白质。化微克量的目的蛋白质。根据目的蛋白质纯品的氨基酸序列分析结果，根据目的蛋白质纯品的氨基酸序列分析结果，根据目的蛋白质纯品的氨基酸序列分析结果，根据目的蛋白质纯品的氨基酸序列分析结果，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从cDNAcDNA文库中分离特异文库中分离特异文库中分离特异文库中分离特异cDNAcDNA克隆。克隆。克隆。克隆。2525第二章第二章 基因工程制药基因工程制药目的cDNA克隆的分离和鉴定 从cDNA文目的目的cDNA克隆的分离和鉴定克隆的分离和鉴定n n免疫反应鉴定法免疫反应鉴定法：在既无可供选择的基因：在既无可供选择的基因表型特征，又无合适探针的情况下，本法表型特征，又无合适探针的情况下，本法是重要途径。是重要途径。用表达型载体构建的用表达型载体构建的cDNA文库，可用免疫文库，可用免疫学方法分组逐一鉴定各学方法分组逐一鉴定各cDNA的表达产物，的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的特异即以某种蛋白质的抗体寻找相应的特异cDNA克隆。克隆。2626第二章第二章 基因工程制药基因工程制药目的cDNA克隆的分离和鉴定免疫反应鉴定法：在既无可供选择的目的目的cDNA克隆的分离和鉴定克隆的分离和鉴定n n分离得到含有目的基因的阳性克隆后，必分离得到含有目的基因的阳性克隆后，必须对其作进一步的验证和鉴定，主要是进须对其作进一步的验证和鉴定，主要是进行限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定行限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序以及确定基因的转录方向、位、基因测序以及确定基因的转录方向、转录起始点等。转录起始点等。n n1985，PCR发明以后，发明以后，RT-PCR得到了广泛得到了广泛的应用。的应用。2727第二章第二章 基因工程制药基因工程制药目的cDNA克隆的分离和鉴定分离得到含有目的基因的阳性克隆后化学合成法化学合成法n n较小的蛋白质或多肽的编码基因可以采用人工化较小的蛋白质或多肽的编码基因可以采用人工化较小的蛋白质或多肽的编码基因可以采用人工化较小的蛋白质或多肽的编码基因可以采用人工化学合成法合成。学合成法合成。学合成法合成。学合成法合成。n n其先决条件是已知目的基因的核苷酸序列，或已其先决条件是已知目的基因的核苷酸序列，或已其先决条件是已知目的基因的核苷酸序列，或已其先决条件是已知目的基因的核苷酸序列，或已知蛋白质的氨基酸序列，按相应的密码子推导出知蛋白质的氨基酸序列，按相应的密码子推导出知蛋白质的氨基酸序列，按相应的密码子推导出知蛋白质的氨基酸序列，按相应的密码子推导出DNA DNA 的碱基序列。的碱基序列。的碱基序列。的碱基序列。n n用化学方法合成目的基因不同部位的两条链的寡用化学方法合成目的基因不同部位的两条链的寡用化学方法合成目的基因不同部位的两条链的寡用化学方法合成目的基因不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘末端的核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘末端的核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘末端的核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘末端的DNA DNA 双链片段，然后将这些双链片段按正确的次双链片段，然后将这些双链片段按正确的次双链片段，然后将这些双链片段按正确的次双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的序进行退火使连接成较长的序进行退火使连接成较长的序进行退火使连接成较长的DNA DNA 片段，再用连接片段，再用连接片段，再用连接片段，再用连接酶连接成完整的基因。酶连接成完整的基因。酶连接成完整的基因。酶连接成完整的基因。2828第二章第二章 基因工程制药基因工程制药化学合成法较小的蛋白质或多肽的编码基因可以采用人工化学合成法人工化学合成的限制人工化学合成的限制n n不能合成太长的基因，不能合成太长的基因，5060bp。n n人工合成时，遗传密码的简并性可人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变，为选择密码子带来导致中性突变，为选择密码子带来很大的困难很大的困难。n n费用较高。费用较高。同一种氨基酸具有两个同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象或更多个密码子的现象称为密码子的简并性称为密码子的简并性 2929第二章第二章 基因工程制药基因工程制药人工化学合成的限制不能合成太长的基因，5060bp。同一种四、基因表达四、基因表达n n基因表达是指结构基因在生物体中的基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。转录、翻译以及所有加工过程。n n基因工程中基因高效表达研究是指外基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。活性又可高产的表达产物。3030第二章第二章 基因工程制药基因工程制药四、基因表达基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所什么是最佳的基因表达体系什么是最佳的基因表达体系n目的基因的表达产量高目的基因的表达产量高n表达产物稳定表达产物稳定n生物活性高生物活性高n表达产物容易分离纯化表达产物容易分离纯化3131第二章第二章 基因工程制药基因工程制药什么是最佳的基因表达体系目的基因的表达产量高31第二章 基因宿主细胞的选择宿主细胞的选择 适合目的基因表达的宿主细胞应满足以下要求:n n 容易获得较高浓度的细胞n n能利用廉价易得的原料n n不致病、不产生内毒素3232第二章第二章 基因工程制药基因工程制药宿主细胞的选择 适合目的基因表达的宿主细胞应满足以下要宿主细胞的选择宿主细胞的选择n n发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态n n容易进行代谢调控n n容易进行DNA重组技术操作n n产物的产量、产率高，产物容易提取3333第二章第二章 基因工程制药基因工程制药宿主细胞的选择发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态33基因表达的微生物宿主细胞基因表达的微生物宿主细胞n n原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌；n n真核细胞：酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞。3434第二章第二章 基因工程制药基因工程制药基因表达的微生物宿主细胞原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链原核细胞大肠杆菌原核细胞大肠杆菌n n因为大肠杆菌的分子遗传学研究深入，生长迅速，所以目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。n n特点：表达基因工程产物的形式多种多样，有细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达等，极少数还可以分泌到细胞外表达。3535第二章第二章 基因工程制药基因工程制药原核细胞大肠杆菌因为大肠杆菌的分子遗传学研究深入，生长迅速大肠杆菌大肠杆菌限制：n n没有信号肽，所以产品多为细胞内产物，提取时需破碎细胞，这样细胞质内其他蛋白质也释放出来，造成提取困难。n n因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。n n蛋白质不能糖基化。n n产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。n n其内毒素很难除去。3636第二章第二章 基因工程制药基因工程制药大肠杆菌限制：36第二章 基因工程制药枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌n n分泌能力强，蛋白质不形成包含体n n产物蛋白质不能糖基化n n有很强的胞外蛋白酶n n对产物降解3737第二章第二章 基因工程制药基因工程制药枯草芽胞杆菌分泌能力强，蛋白质不形成包含体37第二章 基因工链霉菌链霉菌 n n作为外源性基因表达受到重视作为外源性基因表达受到重视n n不致病、使用安全不致病、使用安全n n分泌能力强分泌能力强n n表达产物可糖基化表达产物可糖基化3838第二章第二章 基因工程制药基因工程制药链霉菌 作为外源性基因表达受到重视38第二章 基因工程制药真核细胞酵母真核细胞酵母n n酵母菌是研究基因表达最有效的单细酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。胞真核微生物。n n其基因组小，世代时间短，有单倍体其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。n n能外分泌，产物可糖基化。能外分泌，产物可糖基化。n n已有不少真核基因成功表达。已有不少真核基因成功表达。3939第二章第二章 基因工程制药基因工程制药真核细胞酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。丝状真菌丝状真菌n有很强的蛋白质分泌能力。有很强的蛋白质分泌能力。n能正确进行翻译后加工。能正确进行翻译后加工。n糖基化方式与高等真核生物糖基化方式与高等真核生物相似。相似。4040第二章第二章 基因工程制药基因工程制药丝状真菌有很强的蛋白质分泌能力。40第二章 基因工程制药哺乳动物细胞哺乳动物细胞n优点优点：表达产物可由重组转化表达产物可由重组转化细胞分泌到培养液中，纯化容细胞分泌到培养液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然易。产物是糖基化的接近天然物。物。n缺点缺点：生长慢，生产率低，培生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液养条件苛刻，费用高，培养液浓度稀。浓度稀。4141第二章第二章 基因工程制药基因工程制药哺乳动物细胞优点：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养液中，目前的状况目前的状况n n目前使用最广泛的宿主仍然是大肠目前使用最广泛的宿主仍然是大肠杆菌和酿酒酵母。杆菌和酿酒酵母。n n因为对它们的遗传背景研究得比较因为对它们的遗传背景研究得比较清楚，建立了许多适合于它们的克清楚，建立了许多适合于它们的克隆载体和隆载体和DNA DNA 导入方式。导入方式。n n并且许多外源在这两种宿主菌中得并且许多外源在这两种宿主菌中得到表达成功。到表达成功。4242第二章第二章 基因工程制药基因工程制药目前的状况目前使用最广泛的宿主仍然是大肠杆菌和酿酒酵母。42大肠杆菌中的基因表达大肠杆菌中的基因表达n n基因工程的目的和基本手段，是选基因工程的目的和基本手段，是选用合适的用合适的载体（载体（vector)vector)把供把供体体DNADNA（外源基因）运载到受体细（外源基因）运载到受体细胞内，从而复制扩增大量的目的胞内，从而复制扩增大量的目的DNADNA分子或转录表达为相应的产物。分子或转录表达为相应的产物。4343第二章第二章 基因工程制药基因工程制药大肠杆菌中的基因表达基因工程的目的和基本手段，是选用合适的载理想载体的条件理想载体的条件 根据真核基因在原核细胞中表达的特点，根据真核基因在原核细胞中表达的特点，表达载体应具备下列条件：表达载体应具备下列条件：n n载体能够独立复制，有复制起点，有严紧载体能够独立复制，有复制起点，有严紧型和松弛型，严紧型伴随宿主染色体的复型和松弛型，严紧型伴随宿主染色体的复制而复制，在宿主细胞中拷贝少（制而复制，在宿主细胞中拷贝少（1-3）；）；松弛型的复制可不依赖与宿主细胞，在宿松弛型的复制可不依赖与宿主细胞，在宿主细胞中拷贝多达主细胞中拷贝多达3000 个。个。4444第二章第二章 基因工程制药基因工程制药理想载体的条件 根据真核基因在原核细胞中表达的特点，表达载 n n 应有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，应有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，利于外源基因的克隆、鉴定和筛选。利于外源基因的克隆、鉴定和筛选。n n应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA RNA 聚合酶所识别。聚合酶所识别。n n应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。当诱导时才能进行转录。n n应具有很强的终止子，以便使应具有很强的终止子，以便使RNA RNA 聚合酶聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时很强的终止子所产其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的生的mRNA mRNA 较为稳定。较为稳定。n n所产生的所产生的mRNA mRNA 必须有翻译的起始信号。必须有翻译的起始信号。4545第二章第二章 基因工程制药基因工程制药 应有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，利于外源基因的克隆、基因工程载体基因工程载体n n克隆载体n n转录载体n n表达载体 克隆载体克隆载体 转录载体转录载体 DNA DNA RNA 蛋白质 表达载体表达载体 4646第二章第二章 基因工程制药基因工程制药基因工程载体克隆载体46第二章 基因工程制药原核细胞的基因组特点原核细胞的基因组特点n n染色质为环状双股DNA分子n n具有操纵子结构n n结构基因多为单拷贝n n特定区域分布特异DNA顺序 因此外源因此外源DNA分子可以插入原核细分子可以插入原核细胞胞DNA复制体系的特定区段。复制体系的特定区段。4747第二章第二章 基因工程制药基因工程制药原核细胞的基因组特点染色质为环状双股DNA分子47第二章 基4848第二章第二章 基因工程制药基因工程制药48第二章 基因工程制药基因工程克隆载体的特点基因工程克隆载体的特点n n具有复制具有复制n n有单一限制内切酶切位点或多克隆有单一限制内切酶切位点或多克隆位点位点n n有选择性遗传标记如抗药基因有选择性遗传标记如抗药基因n n拷贝数高拷贝数高n n生物安全性好生物安全性好4949第二章第二章 基因工程制药基因工程制药基因工程克隆载体的特点具有复制49第二章 基因工程制药5050第二章第二章 基因工程制药基因工程制药50第二章 基因工程制药目前使用的载体目前使用的载体 按特性可分为：按特性可分为：n n质粒质粒n n噬菌体噬菌体n n黏性质粒黏性质粒n nM13噬菌体噬菌体n n酵母酵母n n真核细胞病毒载体真核细胞病毒载体5151第二章第二章 基因工程制药基因工程制药目前使用的载体 按特性可分为：51第二章 基因工程制药细菌质粒细菌质粒 质粒质粒是存在于细菌等微生物细是存在于细菌等微生物细胞染色质以外的共价闭环的双胞染色质以外的共价闭环的双股股DNADNA分子，具有独立自主复制分子，具有独立自主复制和调控能力，可赋予宿主细胞和调控能力，可赋予宿主细胞一定的生物性状。一定的生物性状。5252第二章第二章 基因工程制药基因工程制药细菌质粒 质粒是存在于细菌等微生物细胞染色质以外的共价闭环的质粒的生物学特性质粒的生物学特性n n大小大小 小型质粒小型质粒1.515kb,大型质粒大型质粒60120kbn n复制类型复制类型:严紧型质粒严紧型质粒,松弛型质粒松弛型质粒n n拷贝数拷贝数n n电泳特点电泳特点n n不相容性不相容性5353第二章第二章 基因工程制药基因工程制药质粒的生物学特性大小 小型质粒1.515kb,大型质质粒的分类质粒的分类n按复制型式：严紧型按复制型式：严紧型 、松弛型、松弛型n按基因转移性：传递性质粒、按基因转移性：传递性质粒、非传递性质粒非传递性质粒n按遗传性状产物分类：抗生素按遗传性状产物分类：抗生素抗性抗性 、限制酶修饰酶系统、限制酶修饰酶系统5454第二章第二章 基因工程制药基因工程制药质粒的分类按复制型式：严紧型、松弛型54第二章 基因工程制常用表达载体系统质粒常用表达载体系统质粒pBV220的结构的结构 5555第二章第二章 基因工程制药基因工程制药常用表达载体系统质粒pBV220的结构 55第二章 基因工程pBV220质粒载体组成质粒载体组成pBV220系统国内使用最多的载体系统国内使用最多的载体,其组其组成成:n n来源于来源于来源于来源于pUC8pUC8pUC8pUC8多克隆位点多克隆位点多克隆位点多克隆位点n n核糖体核糖体核糖体核糖体rRNArRNArRNArRNAn n基因终止信号基因终止信号基因终止信号基因终止信号n npBR322pBR322pBR322pBR322第第第第42254225422542253735373537353735位位位位n npUC18pUC18pUC18pUC18第第第第2066206620662066680680680680位位位位n n噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体cIts857cIts857cIts857cIts857抑制子基因及抑制子基因及抑制子基因及抑制子基因及P P P PR R R R启动子启动子启动子启动子n npRC23pRC23pRC23pRC23的的的的P P P PL L L L启动子及启动子及启动子及启动子及SDSDSDSD序列序列序列序列5656第二章第二章 基因工程制药基因工程制药pBV220质粒载体组成pBV220系统国内使用最多的载体,pBV220质粒载体的优点质粒载体的优点n n宿主菌可以是大肠杆菌宿主菌可以是大肠杆菌HB101、JM103、C600；n n质粒拷贝数较多，因此小量简便快速质粒拷贝数较多，因此小量简便快速提取即可满足需要；提取即可满足需要；n n为温度诱导，外源基因表达量可达细为温度诱导，外源基因表达量可达细胞总蛋白的胞总蛋白的20%30%；n n产物以包含体形式存在、不易降解、产物以包含体形式存在、不易降解、均一性好；均一性好；5757第二章第二章 基因工程制药基因工程制药pBV220质粒载体的优点宿主菌可以是大肠杆菌HB101、J