遗传病的诊断修改课件

遗传病的诊断修改遗传病的诊断修改1 第一第一节 现症患者症患者诊断断 (symptomatic diagnosis)(symptomatic diagnosis)第一节 现症患者诊断2 一、常规临床诊断一、常规临床诊断 1.1.病史的收集病史的收集一般病史：患者的一般发病情况。一般病史：患者的一般发病情况。家族史：本病在家族中的发病情况。家族史：本病在家族中的发病情况。婚姻史：婚龄、有无近亲结婚等。婚姻史：婚龄、有无近亲结婚等。生育史：生育年龄；子女健康状况；有无流产、生育史：生育年龄；子女健康状况；有无流产、死产、早产；有无药物接触史、放射死产、早产；有无药物接触史、放射 线接触史等。线接触史等。3 2.2.症状和体征的了解症状和体征的了解 遗传病的症状和体征有和其它疾病的共同遗传病的症状和体征有和其它疾病的共同性，亦有遗传病本身的特殊性。性，亦有遗传病本身的特殊性。除注意遗传病的特异性征候群，还应注意除注意遗传病的特异性征候群，还应注意身体发育、智力发育、性器官发育情况。身体发育、智力发育、性器官发育情况。3 3.临床辅助检查临床辅助检查 包括实验室检查、包括实验室检查、X X线、超声、心电图、线、超声、心电图、脑电图、脑电图、CTCT等。等。2.症状和体征的了解4 二、系谱分析（二、系谱分析（pedigree analysispedigree analysis）系谱分析往往是由先证者的症状、体征、实验系谱分析往往是由先证者的症状、体征、实验室检查和其它辅助检查作出疾病的诊断后，追溯到室检查和其它辅助检查作出疾病的诊断后，追溯到家系中其他成员，写出系谱图。家系中其他成员，写出系谱图。二、系谱分析（pedigree analysis）5 在绘制系谱过程中要注意：在绘制系谱过程中要注意：1.1.系统、完整系统、完整 *系谱成员应调查三代以上，（包括死者）系谱成员应调查三代以上，（包括死者）*凡有近亲婚配、死胎、流产和婴儿死亡等，凡有近亲婚配、死胎、流产和婴儿死亡等，也须询问清楚，记录在系谱中。也须询问清楚，记录在系谱中。2.2.去伪存真去伪存真 注意区别病人和家属所提供信息的真伪。注意区别病人和家属所提供信息的真伪。在绘制系谱过程中要注意：6 3.3.注意新的基因突变注意新的基因突变 没有家族史的先没有家族史的先证者者应考考虑是新的基因突是新的基因突变。例如：假肥大型肌例如：假肥大型肌营养不良（养不良（DMDDMD）约有有1/31/3的病例的病例为新的基因突新的基因突变引起的。一般引起的。一般认为是由于患者母是由于患者母亲卵子形成卵子形成过程中程中X X染色体上染色体上DMDDMD基因突基因突变所致。所致。3.注意新的基因突变7 对系系谱的分析要注意区的分析要注意区别：1.1.孟德孟德尔遗传病病 包括包括ADAD遗传病、病、ARAR遗传病、病、XDXD遗传病、病、XRXR遗传病、病、YLYL疾病等。疾病等。系系谱分析分析对这类疾病的分析非常有用，分析疾病的分析非常有用，分析时要考要考虑到某些疾病的到某些疾病的遗传异异质性、不性、不规则外外显、外、外显不全和延不全和延迟显性等情况，可能会造成一些性等情况，可能会造成一些临床假床假象，由于象，由于遗传的异的异质性可能将不同的性可能将不同的遗传病病误认为同一种同一种遗传病病进行分析。行分析。对系谱的分析要注意区别：1.孟德尔遗传病8 2.2.非孟德非孟德尔遗传病病 (1)(1)线粒体粒体遗传病：病：线粒体基因突粒体基因突变所致的所致的遗传病只通病只通过母系母系遗传，女性患者的子女都可能患病。，女性患者的子女都可能患病。线粒体粒体遗传病表病表现为晚晚发、进行性加重。行性加重。(2)(2)多基因病：多基因病：其家族性聚集性可能其家族性聚集性可能类似于孟德似于孟德尔遗传，但，但不不严格遵循孟德格遵循孟德尔分离分离规律。律。2.非孟德尔遗传病9 3.3.具有特殊具有特殊遗传学学现象的疾病象的疾病 (1)(1)基因基因组印印记 部分来自双部分来自双亲的等位基因和染色体区域的的等位基因和染色体区域的表达不是等同的，表达不是等同的，这些等位基因在些等位基因在传递上符合上符合孟德孟德尔规律，但在表达方面受律，但在表达方面受传递的双的双亲性性别影响，因而影响，因而产生母源印生母源印记或父源印或父源印记时，在系，在系谱分析中要加以注意。分析中要加以注意。3.具有特殊遗传学现象的疾病10 1.父系印父系印记基因基因:来自父系的等位基因的表达被抑制来自父系的等位基因的表达被抑制来自母系的等位基因表达来自母系的等位基因表达(mono-allelic)2.母系印母系印记基因基因:来自母系的等位基因的表达被抑制来自母系的等位基因的表达被抑制来自父系的等位基因表达来自父系的等位基因表达(mono-allelic)基因印记基因印记 1.父系印记基因:基因印记11 (2)(2)动态突突变 在孟德在孟德尔遗传疾病中，突疾病中，突变后的基因在后的基因在世代世代传递中中稳定存在，但在三核苷酸重复序定存在，但在三核苷酸重复序列列扩展所致的展所致的遗传病中，病中，处于突于突变状状态的基的基因在世代因在世代传递中表中表现为不不稳定，其重复定，其重复单元元的数目的数目发生改生改变。(2)动态突变 12 （一）染色体检查（一）染色体检查 又称核型分析（又称核型分析（karyotape analysis)karyotape analysis)，即，即通过血液或组织培养制备染色体标本，进而显带、通过血液或组织培养制备染色体标本，进而显带、显微摄影，分组排列对比分析。显微摄影，分组排列对比分析。是确诊染色体病的主要方法。随着显带技术是确诊染色体病的主要方法。随着显带技术的应用以及高分辩率染色体显带技术的出现和改的应用以及高分辩率染色体显带技术的出现和改进，能更准确地判断和发现更多的染色体数目和进，能更准确地判断和发现更多的染色体数目和结构异常综合征，还可以发现新的微畸变综合征。结构异常综合征，还可以发现新的微畸变综合征。三、细胞遗传学检查三、细胞遗传学检查 （一）染色体检查 三、细胞遗传学检查13遗传病的诊断修改课件14 1.1.标本来源：标本来源：现症病人外周血和身体的各种组织。现症病人外周血和身体的各种组织。2.2.染色体检查适应证：染色体检查适应证：(1)(1)智能低下、生长迟缓或伴有其他先天畸形者。智能低下、生长迟缓或伴有其他先天畸形者。(2)(2)夫妇中有染色体异常，如平衡结构重排、嵌夫妇中有染色体异常，如平衡结构重排、嵌合体等。合体等。(3)(3)家族中已有染色体异常或先天畸形个体。家族中已有染色体异常或先天畸形个体。(4)(4)多发性流产的妇女及其丈夫。多发性流产的妇女及其丈夫。(5)(5)原发闭经和男女不育症者。原发闭经和男女不育症者。(6)35 (6)35岁以上的高龄孕妇。岁以上的高龄孕妇。(7)(7)有两性内外生殖器畸形者。有两性内外生殖器畸形者。1.标本来源：15 （二）性染色质检查（二）性染色质检查 利用发根鞘细胞，皮肤或口腔上皮细胞，利用发根鞘细胞，皮肤或口腔上皮细胞，绒毛和羊水细胞检查绒毛和羊水细胞检查X X染色质或染色质或Y Y染色质。用于染色质。用于两性畸形或性染色体数目异常疾病的诊断。两性畸形或性染色体数目异常疾病的诊断。优点是方法简单，有一定价值，但确认仍优点是方法简单，有一定价值，但确认仍需依靠染色体检查。需依靠染色体检查。（二）性染色质检查16染色质检查染色质检查 用于由于用于由于X X染色体数目异常而引起的性染色染色体数目异常而引起的性染色体畸变综合征检测。体畸变综合征检测。如：如：TurnerTurner综合征综合征 X X染色质为阴性。染色质为阴性。KlinefelterKlinefelter综合征综合征 X X染色质为阳性染色质为阳性。2 2 2 2个个个个X X X X染色染色染色染色质质染色质检查 2个X染色质17 2.Y染色质检查染色质检查 利用荧光染料盐酸喹吖因等染料进行利用荧光染料盐酸喹吖因等染料进行Y染染色质的数目检查。这种检查适用于具有一个或色质的数目检查。这种检查适用于具有一个或一个以上一个以上Y染色体的个体或细胞群。如正常男染色体的个体或细胞群。如正常男性只有一个性只有一个Y小体，而小体，而XYY男性有男性有2个个Y小体。小体。可用于性别的鉴定。可用于性别的鉴定。2.Y染色质检查18 （三）染色体原位杂交（三）染色体原位杂交 应用生物素、地高辛或应用生物素、地高辛或荧光染料标记的特异性荧光染料标记的特异性DNADNA探针与玻片上的细胞中期探针与玻片上的细胞中期染色体或间期核的染色体或间期核的DNADNA进行进行杂交检测。在这些核酸不杂交检测。在这些核酸不改变原来结构的情况下，改变原来结构的情况下，研究核酸片段的位置、相研究核酸片段的位置、相互关系，因此称为原位杂互关系，因此称为原位杂交。交。（三）染色体原位杂交 应用生物素、地高辛或荧19 荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISHFISH）：）：用生物素、地高辛配基等标记物标记的用生物素、地高辛配基等标记物标记的DNADNA探针进行原位杂交后，用荧光标记的生物素亲和探针进行原位杂交后，用荧光标记的生物素亲和蛋白和抗亲和蛋白的抗体进蛋白和抗亲和蛋白的抗体进行免疫检测和放大，使探行免疫检测和放大，使探针杂交的区域发出荧光，针杂交的区域发出荧光，这种原位杂交称为荧光原这种原位杂交称为荧光原位杂交。位杂交。可完成非整倍体的检测。可完成非整倍体的检测。荧光原位杂交（FISH）：20 四、生物化学检查四、生物化学检查 单基因遗传病往往是由于基因突变导致酶单基因遗传病往往是由于基因突变导致酶和蛋白质的改变或缺如，使一些器官的发育和和蛋白质的改变或缺如，使一些器官的发育和正常的代谢发生改变，并在临床上表现出一系正常的代谢发生改变，并在临床上表现出一系列症状。列症状。因此，酶和蛋白质的定性和定量分析可反因此，酶和蛋白质的定性和定量分析可反映基因结构的改变，是诊断单基因病的主要方映基因结构的改变，是诊断单基因病的主要方法之一，由于主要采用生化手段故称之为生物法之一，由于主要采用生化手段故称之为生物化学检查。化学检查。四、生物化学检查 单基因遗传病往往是由于基21 生化检查主要是对由于基因突变引起的蛋生化检查主要是对由于基因突变引起的蛋白质和酶结构或功能活性的检测。此外还包括白质和酶结构或功能活性的检测。此外还包括反应底物、中间产物或终产物和受体的结合能反应底物、中间产物或终产物和受体的结合能力检查。该方法特别适用于分子病、先天性代力检查。该方法特别适用于分子病、先天性代谢缺陷、免疫缺陷等遗传病的检查。谢缺陷、免疫缺陷等遗传病的检查。该方法所用的材料主要有血液、活检组织、该方法所用的材料主要有血液、活检组织、尿、粪、阴道分泌物、脱落细胞和培养细胞等。尿、粪、阴道分泌物、脱落细胞和培养细胞等。生化检查主要是对由于基因突变引起的蛋白质和酶结构22 （一）酶和蛋白质的分析（一）酶和蛋白质的分析 利用血液和特定的组织、细胞对酶的活性和利用血液和特定的组织、细胞对酶的活性和蛋白质的含量进行检测。主要方法有：电泳技术，蛋白质的含量进行检测。主要方法有：电泳技术，酶活性检测，层析技术，免疫技术，氨基酸顺序酶活性检测，层析技术，免疫技术，氨基酸顺序分析技术等。分析技术等。（二）代谢产物的检测（二）代谢产物的检测 利用血液、尿液和羊水对代谢产物进行质和利用血液、尿液和羊水对代谢产物进行质和量的检测。主要方法有：血液滤纸片法，显色反量的检测。主要方法有：血液滤纸片法，显色反应。应。（一）酶和蛋白质的分析 利用血液和特定的组织、23第二第二节 症状前症状前诊断断（pre-symptomatic diagnosispre-symptomatic diagnosis）指在遗传病的临床症状出现前所作的诊断。指在遗传病的临床症状出现前所作的诊断。是针对一些常染色体显性是针对一些常染色体显性(AD)(AD)遗传病的杂合子遗传病的杂合子个体的一种诊断方法。这些个体往往发病年龄延迟，个体的一种诊断方法。这些个体往往发病年龄延迟，并已经生育后代，有并已经生育后代，有1/21/2的可能性将致病基因传给的可能性将致病基因传给子代，造成子代发病。如果能在杂合子个体生育之子代，造成子代发病。如果能在杂合子个体生育之前或出现症状之前就作出诊断，可以避免他将致病前或出现症状之前就作出诊断，可以避免他将致病基因传递给后代，减少遗传病的发病率。基因传递给后代，减少遗传病的发病率。第二节 症状前诊断24 常染色体显性杂合子个体的症状前诊断方法常染色体显性杂合子个体的症状前诊断方法有三种：有三种：1 1家系分析法和风险估计家系分析法和风险估计 2 2生化检查生化检查 3 3基因分析基因分析 新生儿筛查（新生儿筛查（neonatal screeningneonatal screening）也是一）也是一种症状前的诊断。是对已出生的新生儿进行某些种症状前的诊断。是对已出生的新生儿进行某些遗传病的诊断，是出生后预防和治疗某些遗传病遗传病的诊断，是出生后预防和治疗某些遗传病的有效方法。的有效方法。常染色体显性杂合子个体的症状前诊断方法有三种：25第三第三节 产前前诊断断（prenatal diagnosisprenatal diagnosis）产前诊断又称宫内诊断（产前诊断又称宫内诊断（intrauterine intrauterine diagnosisdiagnosis）是对胚胎或胎儿在出生前是否患有）是对胚胎或胎儿在出生前是否患有某种遗传病或先天畸形作出准确的诊断。某种遗传病或先天畸形作出准确的诊断。第三节 产前诊断 产前诊断又称宫内诊断（intrau26 一、产前诊断的适应征一、产前诊断的适应征 1 13535岁以上的高龄孕妇或夫妇一方有明显岁以上的高龄孕妇或夫妇一方有明显致畸因素接触史；致畸因素接触史；2 2夫妇之一有染色体数目或结构异常者；夫妇之一有染色体数目或结构异常者；或曾生育过染色体病患儿的孕妇；或曾生育过染色体病患儿的孕妇；3 3已知或推测孕妇是已知或推测孕妇是ARAR或或XRXR携带者；曾生携带者；曾生育过某种单基因遗传病患儿的孕妇；育过某种单基因遗传病患儿的孕妇；一、产前诊断的适应征 135岁以上的27 4曾生育过先天畸形（尤其是神经管畸形）曾生育过先天畸形（尤其是神经管畸形）的孕妇；的孕妇；5有原因不明的自然流产，畸胎，死产及有原因不明的自然流产，畸胎，死产及新生儿死亡的孕妇。新生儿死亡的孕妇。6.有遗传病家族史，又系近亲结婚的孕妇。有遗传病家族史，又系近亲结婚的孕妇。4曾生育过先天畸形（尤其是神经管畸28二、产前诊断的方法二、产前诊断的方法 仪器诊断仪器诊断 包括：包括：X X线检查线检查 超声波检查超声波检查 胎儿镜检查胎儿镜检查 细胞学方法（染色体检查；染色质检查）细胞学方法（染色体检查；染色质检查）生化方法（蛋白质或酶检查；代谢产物检查）生化方法（蛋白质或酶检查；代谢产物检查）分子生物学方法（基因分析）分子生物学方法（基因分析）利利用用限限制制酶酶酶酶切切技技术术、分分子子杂杂交交技技术术、PCRPCR技技术术等等分分子子生生物物学学手手段段，对对羊羊水水细细胞胞、绒绒毛毛或或其其他他胎胎儿儿组组织织中提取的中提取的DNADNA进行基因诊断。进行基因诊断。二、产前诊断的方法 仪器诊断29 三、产前诊断的标本及采集技术三、产前诊断的标本及采集技术可用于检测的标本：可用于检测的标本：羊水上清液、羊水细胞羊水上清液、羊水细胞 绒毛绒毛 脐带血、孕妇外周血中胎儿细胞脐带血、孕妇外周血中胎儿细胞 孕妇血清和尿液孕妇血清和尿液 受精卵、胚胎组织受精卵、胚胎组织 三、产前诊断的标本及采集技术可用于检测的30 羊膜穿刺术羊膜穿刺术（amniocentesisamniocentesis）羊羊膜膜穿穿刺刺术术一一般般在在妊妊娠娠16161818周周时时进进行行。因因为为此此时时羊羊水水量量多多、胎胎儿儿浮浮动动，穿穿刺刺时时容容易易进进针针，且不易伤及胎儿。取材最好是在且不易伤及胎儿。取材最好是在B B超监视下进行。超监视下进行。对抽取的羊水及对抽取的羊水及其中的胎儿脱落细胞其中的胎儿脱落细胞进行细胞培养，分析进行细胞培养，分析染色体以及生化和基染色体以及生化和基因的检测。因的检测。羊膜穿刺术（amniocentesis）31 绒毛吸取术绒毛吸取术 （chorionic villus aspiration sampling,CVSchorionic villus aspiration sampling,CVS）绒绒毛毛吸吸取取术术一一般般可可在在妊妊娠娠早早期期7 79 9周周时时进进行行。取取样样最最好好在在B B超超监监视视下下进进行行。通通过过该该技技术术获获得得绒绒毛毛，可可作作为为胎胎儿儿性性别别鉴鉴定定、核核型型分分析析、生化检查和生化检查和DNADNA分析。分析。绒毛吸取术 绒毛吸取术一般可在妊娠早期732 脐带穿刺术脐带穿刺术（cordocentesiscordocentesis）脐脐带带穿穿刺刺术术可可在在B B超超监监视视下下进进行行。用用一一细细针针经孕妇腹壁进入胎儿的脐带，抽取胎儿脐静脉血。经孕妇腹壁进入胎儿的脐带，抽取胎儿脐静脉血。一般在孕中期（妊娠一般在孕中期（妊娠1818周）进行。周）进行。脐血可作染色体或血液学各种检查，亦可用脐血可作染色体或血液学各种检查，亦可用于因羊水细胞培养失败、于因羊水细胞培养失败、DNADNA分析无法诊断而能分析无法诊断而能用胎儿血浆或血细胞进行生化检测的疾病、或在用胎儿血浆或血细胞进行生化检测的疾病、或在错过绒毛和羊水取样时机时进行。错过绒毛和羊水取样时机时进行。脐带穿刺术（cordocentesis）33 孕妇外周血分离胎儿细胞分离孕妇外周血分离胎儿细胞分离 孕孕妇妇外外周周血血分分离离胎胎儿儿细细胞胞是是一一项项非非创创伤伤性性产产前前诊诊断断技技术术，并并易易于于被被孕孕妇妇接接受受。孕孕妇妇外外周周血血中中的的胎胎儿儿细细胞胞至至少少有有3 3种种，即即滋滋养养叶叶细细胞胞、有有核核红红细胞和淋巴细胞。细胞和淋巴细胞。目目前前许许多多学学者者都都致致力力于于解解决决胎胎儿儿细细胞胞的的识识别别、富富集集和和如如何何排排除除母母血血的的“污污染染”等等。此此方方法法将将以以简便、经济的特点在遗传病的预防中发挥作用。简便、经济的特点在遗传病的预防中发挥作用。孕妇外周血分离胎儿细胞分离34四、植入前诊断四、植入前诊断（preimplantation diagnosispreimplantation diagnosispreimplantation diagnosispreimplantation diagnosis）植入前诊断是利用微操作技术和植入前诊断是利用微操作技术和DNADNA扩增技术扩增技术对胚泡植入前进行检测。对胚泡植入前进行检测。植入前遗传学诊断植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis,PGDpreimplantation genetic diagnosis,PGD）是指用分子或细胞是指用分子或细胞遗传学技术对体外受精遗传学技术对体外受精的胚胎进行遗传学诊断，的胚胎进行遗传学诊断，确定正常后再将胚胎植确定正常后再将胚胎植入子宫。入子宫。四、植入前诊断（preimplantation diagno35 获得植入前胚胎的主要方法：获得植入前胚胎的主要方法：子宫冲洗子宫冲洗 体外授精体外授精 植入前诊断的基本技术：植入前诊断的基本技术：（1 1）胚胎组织微活检：胚胎组织微活检：目目前前多多采采用用在在6 68 8个个细细胞胞期期，通通过过显显微微操操作作技技术术取取出出1 12 2个个细细胞胞进进行行染染色色体体或或基基因因的的检检查。查。获得植入前胚胎的主要方法：36 （2 2）PCRPCR技术：技术：单细胞单细胞PCRPCR技术主要用于单基因遗传病的诊技术主要用于单基因遗传病的诊断。采用引物延伸预扩增技术，以随机引物对断。采用引物延伸预扩增技术，以随机引物对单个细胞单个细胞基因组进行全基因扩增基因组进行全基因扩增，使单个细胞，使单个细胞的多位点分析成为可能。荧光的多位点分析成为可能。荧光PCRPCR也是常用的技也是常用的技术。术。（3 3）FISHFISH技术：技术：该技术利用荧光标记的特定探针与固定在该技术利用荧光标记的特定探针与固定在玻片上的卵裂球细胞核进行杂交，在显微镜下玻片上的卵裂球细胞核进行杂交，在显微镜下鉴定鉴定染色体是否存在单体、三体等异常染色体是否存在单体、三体等异常。（2）PCR技术：37第四第四节 基因基因诊断断 （gene diagnosisgene diagnosis）采用分子生物学方法在采用分子生物学方法在DNADNA水平或水平或RNARNA水平水平对某一基因进行分析，从而对特定的疾病进行对某一基因进行分析，从而对特定的疾病进行诊断。诊断。第四节 基因诊断 38脐带血、孕妇外周血中胎儿细胞来发展十分迅速的大规模、PKU家系PAH基因STR连锁分析DMD基因缺失的多重PCR系谱分析对这类疾病的分析非常有用，分析时要考虑到某些疾病的遗传异质性、不规则外显、外显不全和延迟显性等情况，可能会造成一些临床假象，由于遗传的异质性可能将不同的遗传病误认为同一种遗传病进行分析。Klinefelter综合征植入前诊断是利用微操作技术和DNA扩增技术对胚泡植入前进行检测。ASO HybridizationNormal probeRFLP、VNTR、SSCP、AMPFLP等技术均可用于连锁分析。一般在孕中期（妊娠18周）进行。此外还包括反应底物、中间产物或终产物和受体的结合能力检查。Western印迹杂交（molecular hybridization）产前诊断又称宫内诊断（intrauterine diagnosis）是对胚胎或胎儿在出生前是否患有某种遗传病或先天畸形作出准确的诊断。基因诊断的特点基因诊断的特点:(1)(1)针对直接病因诊断。针对直接病因诊断。(2)(2)特异性强，灵敏度高。特异性强，灵敏度高。(3)(3)适应性强适应性强,诊断范围广，因基因探针可为任诊断范围广，因基因探针可为任何来源、任何种类，其探针序列可为未知或已知，何来源、任何种类，其探针序列可为未知或已知，待检测的目的基因可为一个特定基因或基因组合。待检测的目的基因可为一个特定基因或基因组合。(4)(4)目的基因是否处于活化状态均可，无组织目的基因是否处于活化状态均可，无组织和发育特异性，因此可用于检测一些具有组织表达和发育特异性，因此可用于检测一些具有组织表达特异性和分化阶段表达特异性的基因。特异性和分化阶段表达特异性的基因。脐带血、孕妇外周血中胎儿细胞 基因诊断的特点:39 基因诊断的样本：基因诊断的样本：可以是任何有核细胞，包括：可以是任何有核细胞，包括：(1)(1)外周血白细胞、口腔黏膜细胞。外周血白细胞、口腔黏膜细胞。(2)(2)活检标本、石蜡包埋的组织块。活检标本、石蜡包埋的组织块。(3)(3)沉淀细胞（唾液、痰液、尿液）。沉淀细胞（唾液、痰液、尿液）。(4)(4)羊水细胞、绒毛细胞、进入母体循环的胎羊水细胞、绒毛细胞、进入母体循环的胎儿细胞。儿细胞。基因诊断的样本：40 （一）基因诊断的基本技术（一）基因诊断的基本技术 分子杂交技术分子杂交技术 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)(PCR)技术技术 DNADNA序列测定技术序列测定技术 基因芯片技术基因芯片技术 （一）基因诊断的基本技术41 1.1.分子杂交技术分子杂交技术 （molecular hybridizationmolecular hybridization）原原理理：双双链链DNADNA在在加加热热到到一一定定温温度度以以上上或或在在碱碱性性溶溶液液中中会会变变性性成成为为两两条条单单链链，互互补补的的两两条条DNADNA单单链链在在一一定定条条件件下下结结合合成成为为双双链链。即即能能够够进进行行杂杂交交。这这种种结结合合是是特特异异的的，即即严严格格按按照照碱碱基基互互补补的的原原则则进进行行，它它不不仅仅能能在在DNADNA和和DNADNA之之间间进进行，也能在行，也能在DNADNA和和RNARNA之间进行。之间进行。1.分子杂交技术 42 因此因此 ，当一段已知基因的核酸序列作为探，当一段已知基因的核酸序列作为探针，与变性后的单链针，与变性后的单链DNADNA接触时，如果两者的碱接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组表明被测基因组DNADNA中含有已知的基因序列。中含有已知的基因序列。因此，当一段已知基因的核酸序列作为探针，与变43 基因探针基因探针（probe）：）：是是一一段段带带有有标标记记的的，与与待待测测基基因因有有关关的的核苷酸序列。核苷酸序列。探针探针种类种类:基因组探针基因组探针（genomic probe）cDNA cDNA探针探针（cDNA probe）寡核苷酸探针寡核苷酸探针（oligonucleotide probe）基因探针（probe）：44杂交方法：杂交方法：斑点杂交斑点杂交 Southern Southern杂交杂交 Northern Northern杂交杂交 Western Western印迹杂交印迹杂交 原位杂交原位杂交 寡核苷酸探针杂交寡核苷酸探针杂交杂交方法：45 2.2.聚合酶链反应聚合酶链反应 （polymerase chain reactionpolymerase chain reaction，PCRPCR）聚合酶链反应技术是在体外迅速的选择扩增聚合酶链反应技术是在体外迅速的选择扩增特定的靶特定的靶DNADNA的方法。又称体外的方法。又称体外DNADNA克隆技术。克隆技术。PCRPCR的原理：的原理：（1 1）按靶）按靶DNADNA片段的片段的5 5和和3 3端的碱基顺序各端的碱基顺序各合成两条引物（长约合成两条引物（长约2020个碱基的寡核苷酸）；个碱基的寡核苷酸）；（2 2）将待测）将待测DNADNA变性后，加入四种单核苷变性后，加入四种单核苷 （dNTPdNTP），），引物和耐热引物和耐热DNADNA聚合酶（聚合酶（Taq Taq 酶）；酶）；2.聚合酶链反应 46 （3 3）反应液进）反应液进行热循环，每一周行热循环，每一周期经过变性（期经过变性（92929595），），复性复性（40406060）和）和延伸延伸（65657272）三个阶段产生倍增三个阶段产生倍增的的DNADNA。一般进行一般进行20204040个周期。个周期。PCRPCRPCRPCR原理示意原理示意原理示意原理示意图图 （3）反应液进行热循环，每一周期经过变性（929547 Maxan Maxan和和GilbertGilbert首先建立了化学方法，首先建立了化学方法，SangerSanger建立了建立了DNADNA测序的酶学方法。测序的酶学方法。最新的最新的DNADNA自动测序法以不同荧光色素标自动测序法以不同荧光色素标记的四种不同脱氧核苷酸为原料进行酶促合成记的四种不同脱氧核苷酸为原料进行酶促合成反应，经过凝胶电泳分离，应用激光分析及计反应，经过凝胶电泳分离，应用激光分析及计算机处理就能直接读出碱基顺序。极大地推进算机处理就能直接读出碱基顺序。极大地推进了生命科学的发展和人类基因组计划的进程，了生命科学的发展和人类基因组计划的进程，而且测序的长度可以达到而且测序的长度可以达到1000bp1000bp以上。以上。测序技序技术(DNA sequencing(DNA sequencing）Maxan和Gilbert首先建立了化学方法，San48 DNADNA测序（测序（DNA Sequencing)是检测未知突变是检测未知突变和已知突变基因的最基本和最重要的实验手段。和已知突变基因的最基本和最重要的实验手段。DNADNADNADNA荧荧光自光自光自光自动测动测序法示意序法示意序法示意序法示意图图 DNA测序（DNA Sequencing)是检测未知49 基因芯片技术是近年基因芯片技术是近年来发展十分迅速的大规模、来发展十分迅速的大规模、高通量分子检测技术。其高通量分子检测技术。其基本原理是核酸杂交，其基本过程是将许多基本原理是核酸杂交，其基本过程是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，形成矩阵点。有规律地排列固定于支持物上，形成矩阵点。现在的技术可以做到在现在的技术可以做到在1cm1cm2 2上排列成千上万上排列成千上万个个“点点”。4.4.基因芯片技术基因芯片技术(gene chip)(gene chip)基因芯片技术是近年 4.基因芯片技术(gene 50 样品样品DNA/RNADNA/RNA通过通过PCRPCR扩增、体外转录等技术扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，然后按碱基配对原理进行杂掺入荧光标记分子，然后按碱基配对原理进行杂交，再通过荧光检测系统等交，再通过荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探以计算机系统对每一探针上的荧光信号做出比针上的荧光信号做出比较和检测，得出所要的较和检测，得出所要的信息。信息。基因芯片工作流程示意基因芯片工作流程示意基因芯片工作流程示意基因芯片工作流程示意图图 样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入51 （二）基因诊断的途经（二）基因诊断的途经 1.1.直接诊断直接诊断 检测突变基因检测突变基因 直接诊断是直接检测致病突变的基因。它直接诊断是直接检测致病突变的基因。它通常使用基因本身或紧邻的通常使用基因本身或紧邻的DNADNA序列作为探针，序列作为探针，或通过或通过PCRPCR扩增产物，以探查基因无突变、缺失扩增产物，以探查基因无突变、缺失等异常及其性质，这称为直接基因诊断，它适等异常及其性质，这称为直接基因诊断，它适用已知基因异常的疾病。用已知基因异常的疾病。（二）基因诊断的途经52 当致病基因的某种突变类型与发病有直当致病基因的某种突变类型与发病有直接的因果关系接的因果关系,或者对致病基因以及分子机或者对致病基因以及分子机制已完全了解制已完全了解,或者对致病基因以及分子机或者对致病基因以及分子机制部分了解但已知其中规律制部分了解但已知其中规律,可应用此途径。可应用此途径。当致病基因的某种突变类型与发病有直接的因果关系,53 2.2.间接诊断间接诊断 基因连锁分析基因连锁分析 当致病基因虽然已知但其异常尚属未知或当致病基因虽然已知但其异常尚属未知或突变类型较多时；或致病基因本身尚属未知时，突变类型较多时；或致病基因本身尚属未知时，但被检测基因有紧密连锁的但被检测基因有紧密连锁的DNADNA多态标记，可以多态标记，可以通过对受检者及其家系进行连锁分析，以推断通过对受检者及其家系进行连锁分析，以推断前者是否获得了带有致病基因的染色体。前者是否获得了带有致病基因的染色体。2.间接诊断 基因连锁分析54 连锁分析多使用基因组中广泛存在的各种连锁分析多使用基因组中广泛存在的各种DNADNA多态性位，特别是基因突变部位或紧邻的多多态性位，特别是基因突变部位或紧邻的多态性位点作为标记。态性位点作为标记。RFLPRFLP、VNTRVNTR、SSCPSSCP、AMPAMPFLPFLP等技术均可用于连锁分析。等技术均可用于连锁分析。连锁分析多使用基因组中广泛存在的各种DNA多态性55 （三）基因诊断的方法选择：（三）基因诊断的方法选择：各种遗传病的基因异常是不同的，同一遗传各种遗传病的基因异常是不同的，同一遗传病也可以有不同的基因异常，但这些异常大体可病也可以有不同的基因异常，但这些异常大体可分为基因缺失和突变两大类型。根据对基因异常分为基因缺失和突变两大类型。根据对基因异常类型的了解，可以采用不同的诊断方法。类型的了解，可以采用不同的诊断方法。（三）基因诊断的方法选择：各种遗传病的基因异常是56Mutation probe如果能在杂合子个体生育之前或出现症状之前就作出诊断，可以避免他将致病基因传递给后代，减少遗传病的发病率。荧光PCR也是常用的技术。2夫妇之一有染色体数目或结构异常者；该方法特别适用于分子病、先天性代谢缺陷、免疫缺陷等遗传病的检查。(3)适应性强,诊断范围广，因基因探针可为任何来源、任何种类，其探针序列可为未知或已知，待检测的目的基因可为一个特定基因或基因组合。（pre-symptomatic diagnosis）PAH基因Sph切点 Sph酶对PKU的RFLP分析也须询问清楚，记录在系谱中。(1)基因组印记植入前遗传学诊断(4)羊水细胞、绒毛细胞、进入母体循环的胎儿细胞。如果能在杂合子个体生育之前或出现症状之前就作出诊断，可以避免他将致病基因传递给后代，减少遗传病的发病率。PCR的原理：(symptomatic diagnosis)cDNA探针（cDNA probe）（chorionic villus aspiration sampling,CVS）52外显子区段缺失；子宫冲洗 遗传的基因的基因诊断方法断方法基因异常基因异常 方法方法 探针、引物或限制酶探针、引物或限制酶基因缺失基因缺失 基因组基因组DNADNA印迹杂交印迹杂交 缺失基因的探针缺失基因的探针 PCRPCR扩增扩增 引物包括缺失或在缺失部位内引物包括缺失或在缺失部位内点突变点突变 RFLPRFLP分析分析 突变导致其切点消失的限制酶突变导致其切点消失的限制酶 ASO ASO杂交杂交 正常和异常的正常和异常的ASOASO探针探针 PCRPCR产物的多态性分析产物的多态性分析 引物包括突变部位引物包括突变部位 （RFLPRFLP、SSCPSSCP、DGGEDGGE）基因已知基因已知 基因内或旁侧序列多态性基因内或旁侧序列多态性 基因内或旁基因内或旁但异常不明但异常不明 （RFLPRFLP、SSCPSSCP、AMP-FLPAMP-FLP）侧序列探针或引物侧序列探针或引物 连锁分析连锁分析 基因未知基因未知 与疾病连锁的多态性，与疾病连锁的多态性，与疾病连锁的多态与疾病连锁的多态 如如SSCPSSCP、AMP-FLPAMP-FLP连锁分析，连锁分析，位点探针或引物位点探针或引物 RFLPRFLP位点单体型连锁分析位点单体型连锁分析Mutation probe 57 （三）基因诊断在遗传病诊断中的应用（三）基因诊断在遗传病诊断中的应用 1.1.对单基因病的基因诊断对单基因病的基因诊断 （1 1）点突变型遗传病的基因诊断点突变型遗传病的基因诊断 镰状细胞性贫血的基因诊断镰状细胞性贫血的基因诊断 （三）基因诊断在遗传病诊断中的应用 镰状细58镰状细胞贫血镰状细胞贫血镰状细胞贫血镰状细胞贫血(HbS)HbS)：第第第第5 57 7位密码子位密码子位密码子位密码子MstMstMstMst：CCTNAGG CCTNAGG CCTNAGG CCTNAGG A A A A：CCTGAGGAG CCTGAGGAG CCTGAGGAG CCTGAGGAG S S S S：CCTGTGGAG CCTGTGGAG CCTGTGGAG CCTGTGGAG A A A A A A S S S S S S 1.2 1.2 Kb Kb 0.2Kb 0.2Kb1.40 1.40 KbKb1.20 Kb1.20 Kb0.20 Kb0.20 Kb镰状细胞贫血(HbS)：第57位密码子Mst59ASO HybridizationPKU,ARPKU,ARNormal probeMutation probeASO HybridizationPKU,ARNormal60 无无过氧化氧化氢酶血症血症（acatalasemia)acatalasemia)是一种常染色体隐性遗传病，患者过氧化氢酶活是一种常染色体隐性遗传病，患者过氧化氢酶活性只有正常人的性只有正常人的0.2%0.2%0.4%0.4%，杂合体血液中过氧化氢，杂合体血液中过氧化氢酶活性则处于中间水平。过氧化氢酶基因由酶活性则处于中间水平。过氧化氢酶基因由1313个外显个外显子和子和1212个内含子组成。个内含子组成。应用应用32P32P标记标记PCRPCR反应中底物反应中底物方法，扩增第方法，扩增第4 4个外显子和内个外显子和内含子附近的含子附近的203bp203bp片段，应用片段，应用SSCPSSCP法可清楚地判断患者和法可清楚地判断患者和杂合体。杂合体。PCR-SSCPPCR-SSCPPCR-SSCPPCR-SSCP法法法法检测检测无无无无过过氧化氧化氧化氧化氢酶氢酶血症血症血症血症 无过氧化氢酶血症（acatalasemia)PC61aa/aa aa/-aa/a-a-/-/-14kb10kb10kb 4kbBamH IBamH I左左侧：1616号染色体上携有数目不同的基因号染色体上携有数目不同的基因右右侧：a a基因探基因探针杂交的交的结果果1)-地地贫基因缺失的基因缺失的诊断断正常正常贫血贫血症状症状携带携带者者HbH（2 2）基因缺失型）基因缺失型遗传病的病的诊断断aa/aa aa/-aa/a-a-/-622)DMD2)DMDBMDBMD的缺失型的缺失型诊断：断：DMD DMD DMD DMD基因缺失的多重基因缺失的多重基因缺失的多重基因缺失的多重PCRPCRPCRPCRPrn.Prn.Prn.Prn.启启启启动动子；子；子；子；1.1.1.1.正常，九条正常，九条正常，九条正常，九条带带；2.2.2.2.基因全缺失；基因全缺失；基因全缺失；基因全缺失；3.3.3.3.启启启启动动子区缺失；子区缺失；子区缺失；子区缺失；4.4.4.4.第第第第3 3 3 3外外外外显显子缺失；子缺失；子缺失；子缺失；5.5.5.5.第第第第13131313外外外外显显子缺失；子缺失；子缺失；子缺失；6.6.6.6.第第第第47474747外外外外显显子缺失；子缺失；子缺失；子缺失；52525252外外外外显显子区段缺失；子区段缺失；子区段缺失；子区段缺失；8.8.8.8.第第第第52525252外外外外显显子缺失子缺失子缺失子缺失 2)DMDBMD的缺失型诊断：DMD基63 （3 3）基因异常不明的）基因异常不明的遗传病的病的诊断断 以苯丙以苯丙酮尿症尿症(PKU)(PKU)的基因的基因诊断断为例。例。RFLPRFLPRFLPRFLP分析：分析：分析：分析：PAHPAH基因基因SphSph切点切点 SphSph酶对PKUPKU的的RFLPRFLP分析分析 示意示意图 A.A.系系谱；图 （3）基因异常不明的遗传病的诊断 PAH基因Sph切64一个一个PKUPKU家家系的系的RFLPRFLP单体型分体型分析析 一个PKU家系的RFLP单体型分析 65DMD家系家系单体型体型分析分析图解解DMD家系66单体型分析体型分析PKU，AR1 21 2 35.6 Kb5.2 Kb4.2 Kb4.0 KbHind Sph11.0 Kb 9.7 Kb 7.0 Kb单体型分析PKU，AR1 21 67PKUPKU家系家系PAHPAH基因基因STRSTR连锁分析分析 PKU家系PAH基因STR连锁分析 68 2.2.多基因遗传病的基因诊断多基因遗传病的基因诊断 人类基因组多态性是多基因病基因诊断的人类基因组多态性是多基因病基因诊断的基础，易感基因多态性的检测能帮助我们理解基础，易感基因多态性的检测能帮助我们理解多基因病发生的机制，有助于对疾病的诊断和多基因病发生的机制，有助于对疾病的诊断和分类。分类。目前已经发现一些多基因病相关基因，如目前已经发现一些多基因病相关基因，如载脂蛋白载脂蛋白E E基因（基因（ApoEApoE）的多态性与阿尔茨海默）的多态性与阿尔茨海默病（病（ADAD）有高度相关性，血管紧张肽转换酶基）有高度相关性，血管紧张肽转换酶基因的多态性与原发性高血压和心肌梗死高度相因的多态性与原发性高血压和心肌梗死高度相关。关。2.多基因遗传病的基因诊断69 （1 1）rasras基因突变的检测基因突变的检测 rasras基因突变的检测可采用基因突变的检测可采用PCR-ASOPCR-ASO方法进行，方法进行，已知已知rasras基因突变的热点在基因突变的热点在1212、1313及及6161密码子。密码子。（2 2）p p5353基因的检测基因的检测 目前常用目前常用PCRPCR法进行检测法进行检测p p5353突变的热点是外显突变的热点是外显子子5 58 8，一般可先选用外显子，一般可先选用外显子5 58 8的引物进行扩增，的引物进行扩增，其后再进行突变位点的详尽分析，甚至测序。另一其后再进行突变位点的详尽分析，甚至测序。另一初步检测初步检测p p5353基因突变的方法为基因突变的方法为PCR-SSCPPCR-SSCP，然后测序。，然后测序。3.3.对肿瘤的基因瘤的基因诊断断 （1）ras基因突变的检测 3.对肿瘤的基因诊断70 （四）基因诊断的（四）基因诊断的意义：意义：1.1.现症患者诊断：争取有效、针对性治疗。现症患者诊断：争取有效、针对性治疗。2.2.产前诊断：意义更为重要，预防遗传病产前诊断：意义更为重要，预防遗传病患儿的出生。患儿的出生。（四）基因诊断的意义：71 未来的基因诊断主要发展方向：未来的基因诊断主要发展方向：(1)(1)胚胎着床前诊断胚胎着床前诊断在囊胚在囊胚8 8个细胞期，个细胞期，通过对其中一个细胞的染色体核型分折和原位杂通过对其中一个细胞的染色体核型分折和原位杂交，从而将人类的遗传缺陷控制在最早期阶段；交，从而将人类的遗传缺陷控制在最早期阶段；(2)(2)母体外周血中胎儿细胞分析技术；母体外周血中胎儿细胞分析技术；(3)(3)对常见病、多发病如心血管系统疾病、糖对常见病、多发病如心血管系统疾病、糖尿病、精神疾病、神经系统疾病、恶性肿瘤、哮尿病、精神疾病、神经系统疾病、恶性肿瘤、哮喘、近视眼等进行分子诊断喘、近视眼等进行分子诊断。（五）疾病基因（五）疾病基因诊断的展望断的展望 未来的基因诊断主要发展方向：（五）疾病72遗传病的诊断修改课件73