方血红蛋白的提取和分离培训课件

6/27/20241方血红蛋白的提取和分离根据课题背景回答下列问题：根据课题背景回答下列问题：6/27/20242方血红蛋白的提取和分离2003年年4月月14日宣布人类基因组序列图完成日宣布人类基因组序列图完成这标志着进入了这标志着进入了_和和时代。时代。人类基因组：人类基因组：蛋白质组蛋白质组：_主要是对主要是对_后基因组后基因组蛋白质组蛋白质组指指DNA分子所携带的全部遗传信息。分子所携带的全部遗传信息。生物个体表达的蛋白质分子的总和生物个体表达的蛋白质分子的总和蛋白质功能的研究蛋白质功能的研究血红血红蛋白质的主要功能是蛋白质的主要功能是：_。负责血液中负责血液中O2和和CO2的运输的运输6/27/20243方血红蛋白的提取和分离思考思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的选用一定的的方法，分离具有的方法，分离具有不同不同的生物大分子。的生物大分子。思考思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种根据蛋白质各种_，如，如_、和和、3、溶解度、溶解度、4、吸附的性质和、吸附的性质和等等，等等，可以用来分离不同蛋白质。可以用来分离不同蛋白质。特性的差异特性的差异1、分子的形状、分子的形状大小大小物理或化学物理或化学物理或化学性质物理或化学性质2、所带电荷的性质和多少、所带电荷的性质和多少5、对其他分子的亲和力、对其他分子的亲和力6/27/20244方血红蛋白的提取和分离思考思考3 高温灭菌和酒精消毒分别利用蛋白质高温灭菌和酒精消毒分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性变性思考思考4 人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNA，用人，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有鸡的红细胞具有_，含有，含有DNA，便于进行，便于进行DNA的提取；人的红细胞的提取；人的红细胞无无_，结构简单，结构简单，_含含量丰富便于提取血红蛋白。量丰富便于提取血红蛋白。变性变性空间结构空间结构细胞核细胞核细胞核细胞核血红蛋白血红蛋白6/27/20245方血红蛋白的提取和分离一、基础知识：一、基础知识：凝胶色谱法（也叫分配色谱法）：凝胶色谱法（也叫分配色谱法）：2、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体一些微小多孔的球体-分子筛（分子筛（内含许内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖琼脂糖）根据被根据被，利用具有网状结构的，利用具有网状结构的_（分子筛）的（分子筛）的作用，来进行分离。作用，来进行分离。1、概念：、概念：分离物质的蛋白质相对分子质量的大小分离物质的蛋白质相对分子质量的大小凝胶凝胶6/27/20246方血红蛋白的提取和分离3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相当不同的蛋白质通过凝胶时，相对对_的蛋白质容易进入的蛋白质容易进入凝胶内部的通道凝胶内部的通道，路程，路程_，移动速度，移动速度_，而，而_的蛋白质无的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在法进入凝胶内部的通道，只能在_移动，路程移动，路程_，移动速度，移动速度_，相对，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。分子质量不同的蛋白质因此得以分离。4、具体过程、具体过程相对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快6/27/20247方血红蛋白的提取和分离洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。促使蛋白质分子的差速流动。混合物混合物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子流动慢小分子流动慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子 6/27/20248方血红蛋白的提取和分离6/27/20249方血红蛋白的提取和分离也称：洗脱瓶也称：洗脱瓶6/27/202410方血红蛋白的提取和分离 1、概念：由、概念：由溶解于水中，溶解于水中，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液：缓冲溶液：2、缓冲作用：、缓冲作用：在一定范围内，能够抵制在一定范围内，能够抵制对溶液对溶液的影响，维持的影响，维持PH基本不变。基本不变。外界的酸、碱或稍加稀释外界的酸、碱或稍加稀释PH值值12种缓冲剂种缓冲剂调节缓冲剂的调节缓冲剂的就可以制得就可以制得使用的缓冲液。使用的缓冲液。使用比例使用比例在不同在不同PH范围内范围内6/27/202411方血红蛋白的提取和分离3、缓冲溶液的正确配制和、缓冲溶液的正确配制和PH的准确测定的准确测定的重要性的重要性生物体进行的各种生物化学反应都是在一定的生物体进行的各种生物化学反应都是在一定的PH下进下进行的，为了能够在实验条件下行的，为了能够在实验条件下的过的过程，就必须保持程，就必须保持的的基本一致基本一致。思考：说出人体血液中缓冲对。思考：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4 /Na2HPO4H2CO3 /NaHCO3准确模拟生物体内准确模拟生物体内体外溶液的体外溶液的PH与体内环境中与体内环境中6/27/202412方血红蛋白的提取和分离电泳：电泳：1、概念：、概念：_ _思考：在血红蛋白提取和分离的整个实验中思考：在血红蛋白提取和分离的整个实验中使用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是使用的是_，目的是利用缓冲液，目的是利用缓冲液模拟模拟_，保证血红蛋白的，保证血红蛋白的_。）。）磷酸缓冲液磷酸缓冲液细胞内的细胞内的PH环境环境正常结构和功能正常结构和功能只有血红蛋白只有血红蛋白_才能才能保证的材料保证的材料的科学研究；材料为的科学研究；材料为_色色便于便于_。指带电粒子在电场作用下发指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。生迁移的过程。仍具有活性仍具有活性观察观察红红6/27/202413方血红蛋白的提取和分离 2、原理：许多重要的生物大分子，如、原理：许多重要的生物大分子，如_等都具有等都具有_ 在在 _下下，这些基团会带上，这些基团会带上_。在电场的作用下，这些带电分子会向着。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其与其_移动。电泳利移动。电泳利用了待分离样品中各种分子用了待分离样品中各种分子_以及分子本身的以及分子本身的_、_的不同使带电分子产生不同的的不同使带电分子产生不同的_，从而实现样品中各种分子的，从而实现样品中各种分子的分离。分离。多肽、核酸多肽、核酸可解离的基团可解离的基团正电或负电正电或负电所带电荷所带电荷相反相反的电极的电极带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状的形状的迁移速度迁移速度一定的一定的PH6/27/202414方血红蛋白的提取和分离6/27/202415方血红蛋白的提取和分离电泳方法分类：电泳方法分类：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳：是用琼脂或琼脂糖作支持介是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品分子量较大的样品，如，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。脂糖凝胶进行电泳分离。聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳(PAGE)6/27/202416方血红蛋白的提取和分离聚丙稀酰胺凝胶电泳：聚丙稀酰胺凝胶电泳：测定测定_通常用：通常用：（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量聚丙稀酰胺凝胶：聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂（是由单体丙烯酰胺和交联剂（N,NN,N-亚甲亚甲基双丙烯酰胺）在基双丙烯酰胺）在引发剂引发剂(过硫酸铵）和过硫酸铵）和催化剂催化剂（四甲基己二胺）的作用下（四甲基己二胺）的作用下聚合交聚合交联成三维网状结构的联成三维网状结构的凝胶凝胶6/27/202417方血红蛋白的提取和分离电泳方法分类：电泳方法分类：SDS是一种是一种蛋白质变性剂蛋白质变性剂十二烷基十二烷基硫酸钠硫酸钠SDS的作用是什么呢？的作用是什么呢？6/27/202418方血红蛋白的提取和分离为了为了消除消除_对迁移率的影响可以在凝胶对迁移率的影响可以在凝胶中加入中加入_，它它能使能使_。由。由几条肽链组成的蛋白质复合体在几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下的作用下会解聚成单条肽链，会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是因此测定的结果只是_。SDS能与各种蛋白质形能与各种蛋白质形成蛋白质成蛋白质SDS复合物，复合物，SDS所所带负电荷带负电荷的量的量_蛋白质分子原有电荷量。蛋白质分子原有电荷量。因而因而掩盖了不同种蛋白质间的掩盖了不同种蛋白质间的_，使电泳，使电泳迁移率完全取决于迁移率完全取决于_。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它它_以及以及_等因素。等因素。SDS单条肽链的分子量单条肽链的分子量分子的大小分子的大小所带静电荷的多少所带静电荷的多少分子的大小分子的大小静电荷静电荷蛋白质发生完全变性蛋白质发生完全变性大大超过了大大超过了电荷差别电荷差别6/27/202419方血红蛋白的提取和分离二二 实验操作实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：1.样品处理样品处理血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红血红蛋白蛋白（）两个两个a a肽链肽链两个两个一肽链肽链样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定共四条肽链共四条肽链90906/27/202420方血红蛋白的提取和分离6/27/202421方血红蛋白的提取和分离血红素血红素基团基团6/27/202422方血红蛋白的提取和分离每个肽链环绕每个肽链环绕_，此基团，此基团可携带可携带_。血红蛋白。血红蛋白因含有因含有_而呈红色。本课题可选用猪、而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。一个亚铁血红素基团一个亚铁血红素基团一分子氧或一分子二氧化碳一分子氧或一分子二氧化碳血红素血红素(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤血液血液100mL3g柠檬酸钠柠檬酸钠红细胞红细胞血血 浆浆 红细胞红细胞 搅拌搅拌10min重复洗涤重复洗涤3次，次，直至直至表明：表明：红细胞已洗涤干净红细胞已洗涤干净上清液没有黄色上清液没有黄色低速低速短时间短时间离心离心2 min吸出血浆吸出血浆5倍体积生理盐水倍体积生理盐水6/27/202423方血红蛋白的提取和分离洗涤洗涤目的：去除目的：去除_洗涤洗涤方法：方法：_离心（洗涤速度离心（洗涤速度过高过高和时间和时间过长过长会使会使_等一同沉淀达不到分离的效果），然后用等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的胶头吸管吸出上层透明的_，将，将下层下层_的红细胞液体倒入的红细胞液体倒入_再再加入加入用用_的的_质量分数为质量分数为_溶液洗涤。溶液洗涤。杂质蛋白杂质蛋白低速短时间低速短时间黄色血浆黄色血浆暗红色暗红色烧杯烧杯白细胞和淋巴细胞白细胞和淋巴细胞五倍体积五倍体积生理盐水生理盐水0.9的氯化钠的氯化钠洗涤次数过少洗涤次数过少：无法除去血浆蛋白无法除去血浆蛋白6/27/202424方血红蛋白的提取和分离(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放 加加_到到_体积，再加体积，再加40体积的体积的_，置于，置于_上充分搅拌上充分搅拌10分分钟钟,细胞破裂释放出血红蛋白细胞破裂释放出血红蛋白.原血液原血液甲苯甲苯磁力搅拌器磁力搅拌器蒸馏水蒸馏水目的分析：目的分析：1.蒸馏水蒸馏水的作用是的作用是_。2.加入加入甲苯甲苯的作用是的作用是_。3.充分搅拌充分搅拌10分钟分钟的目的是的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂为什么加入甲苯而不是其他的无机溶剂？为什么加入甲苯而不是其他的无机溶剂？6/27/202425方血红蛋白的提取和分离 (3)分离分离血红蛋白溶液：血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转将搅拌好混合液转移到离心管内，以移到离心管内，以2000r/min的速度离心的速度离心10 min，试管中的溶液分为，试管中的溶液分为4层层:脂脂溶性沉溶性沉淀层淀层分离过程分离过程红细胞红细胞混合液混合液离心管离心管烧杯烧杯有机溶有机溶剂剂甲苯甲苯高速离心高速离心10min 10min 滤纸滤纸过滤过滤血红血红蛋白蛋白6/27/202426方血红蛋白的提取和分离第第1层（最上层）：层（最上层）：（）甲苯层）甲苯层第第2层（中上层）：层（中上层）：（）的沉淀层，的沉淀层，（）色薄层固体）色薄层固体第第3层（中下层）：层（中下层）：（）的水溶液层的水溶液层 （）的液体）的液体 第第4层（最下层）：层（最下层）：其它杂质（其它杂质（）的沉淀层）的沉淀层无色透明无色透明脂溶性物质脂溶性物质白白血红蛋白血红蛋白红色透明红色透明暗红色暗红色6/27/202427方血红蛋白的提取和分离用湿滤纸过滤，除用湿滤纸过滤，除去去_，于于中静中静置片刻后，置片刻后，分出下分出下层的红色透明液体层的红色透明液体,即为即为。脂溶性沉淀层脂溶性沉淀层血红蛋白血红蛋白分液漏斗分液漏斗6/27/202428方血红蛋白的提取和分离取取ml的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入中，中，将透析袋放入盛有将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度的物质的量浓度为为20mmol/L的的中，中，pH为为，透析，透析12小时，目的是小时，目的是或用于更换样品中的或用于更换样品中的。透析袋一般用。透析袋一般用硝酸纤维素硝酸纤维素制成，又制成，又称玻璃纸。称玻璃纸。除去样品中小分子量的杂质除去样品中小分子量的杂质透析袋透析袋磷酸缓冲液磷酸缓冲液7.0缓冲液缓冲液(4)透析透析1血红蛋白的粗分离血红蛋白的粗分离6/27/202429方血红蛋白的提取和分离6/27/202430方血红蛋白的提取和分离2.凝胶色谱制作凝胶色谱制作1）凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作取长取长4040厘米（不超过厘米（不超过1m1m），内径），内径1.61.6厘米厘米（不超过（不超过2cm2cm）的玻璃管，两端需用砂纸磨平）的玻璃管，两端需用砂纸磨平底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔 挖出凹穴挖出凹穴 安装移液管头部安装移液管头部 覆盖尼龙网覆盖尼龙网，再用，再用100100目尼龙纱包好。目尼龙纱包好。a a、选择合适的的橡皮塞，、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；中间打孔；b b、在橡皮塞顶部切出锅底状的、在橡皮塞顶部切出锅底状的（），在），在0.5ml0.5ml的（的（）头部切）头部切下（下（）长的一段，插入橡皮塞孔内，）长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。凹穴凹穴移液管移液管5cm5cm纯化方法纯化方法6/27/202431方血红蛋白的提取和分离底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则塞的凹穴底面，否则，还会导致还会导致，蛋白质分离不彻底。，蛋白质分离不彻底。c c.剪剪小圆片覆盖在小圆片覆盖在上，用上，用的尼龙纱将橡皮塞的尼龙纱将橡皮塞包包好，插到玻璃管一端。好，插到玻璃管一端。d d、色谱柱下端用移液头部做、色谱柱下端用移液头部做，连接一细的连接一细的，并用螺旋夹控制尼，并用螺旋夹控制尼龙管的龙管的，另一端放入收集，另一端放入收集的收集器内的收集器内橡皮塞的凹面橡皮塞的凹面100100目目上部上部出口部位出口部位尼龙管尼龙管打开与关闭打开与关闭色谱流出液色谱流出液难以铺实尼龙网难以铺实尼龙网液体残留液体残留尼龙网尼龙网6/27/202432方血红蛋白的提取和分离安装其他附属结构。安装其他附属结构。顶塞的制作：顶塞的制作：插入插入安装了玻璃管的橡皮塞安装了玻璃管的橡皮塞组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装了玻璃管安装了玻璃管6/27/202433方血红蛋白的提取和分离2）凝胶色谱柱填料的处理）凝胶色谱柱填料的处理（1 1）凝胶的选择：（）凝胶的选择：（）（G-75G-75）：）：“G G”表示凝胶的表示凝胶的、及及。7575表示凝胶的表示凝胶的，即每克凝胶，即每克凝胶膨胀时吸水膨胀时吸水。（2 2）方法：）方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于的凝胶浸泡于（也可用洗脱缓（也可用洗脱缓冲液）中充分溶胀后，配成冲液）中充分溶胀后，配成。蒸馏水蒸馏水凝胶悬浮液凝胶悬浮液交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶交联程度交联程度膨胀程度膨胀程度分离范围分离范围得水值得水值7.57.5克克6/27/202434方血红蛋白的提取和分离固定：将色谱柱处置固定在支架上固定：将色谱柱处置固定在支架上装填：装填：将（将（）一次性的缓一次性的缓慢倒入（慢倒入（）内，装填时轻轻敲动）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。色谱柱，使凝胶填装均匀。（3）凝胶色谱柱的装填方法）凝胶色谱柱的装填方法凝胶悬浮液凝胶悬浮液色谱柱色谱柱注意：注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。的洗脱次序，降低分离效果。6/27/202435方血红蛋白的提取和分离步骤步骤操作要求操作要求立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h12h洗涤平衡洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液装填悬浮液凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液配制悬浮液计算称量凝胶计算称量凝胶固定色谱柱固定色谱柱材料：材料：交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶G-75 20mmol/LG-75 20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液“G”“G”表示什么？表示什么？7575代表什么？代表什么？2、凝胶色谱柱的装填、凝胶色谱柱的装填6/27/202436方血红蛋白的提取和分离洗涤平衡洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在()()高的操作压下，用高的操作压下，用300ml300ml的的20mmol/l的的磷酸缓冲磷酸缓冲液（液（pHpH为为7.07.0）充分（）充分（）1212小时。小时。洗涤平衡洗涤平衡注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。新填装。50cm50cm6/27/202437方血红蛋白的提取和分离 3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱加样前加样前 打开下端出口，使柱内凝打开下端出口，使柱内凝胶面上的（胶面上的（）缓）缓慢下降到与（慢下降到与（）平齐，关闭出口平齐，关闭出口缓冲液缓冲液凝胶面凝胶面50cm50cm6/27/202438方血红蛋白的提取和分离加加透析透析样样品品6/27/202439方血红蛋白的提取和分离调整缓冲液面：与凝胶面平齐调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：用（滴加透析样品：用（）将）将1ml（）的样品加到色谱柱的（的样品加到色谱柱的（）样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：（）洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱收集：收集：待待（）接近色谱柱底接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（端时，用试管收集流出液，每（）收集一试管连续收集收集一试管连续收集注意正确的加样操作：注意正确的加样操作：不要触及破坏凝胶面不要触及破坏凝胶面 贴壁加样贴壁加样 使吸管管口沿管壁环绕移动使吸管管口沿管壁环绕移动吸管吸管透析液透析液顶端顶端样品完全进凝胶层样品完全进凝胶层5ml红色的蛋白质红色的蛋白质6/27/202440方血红蛋白的提取和分离血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（）；然后通过凝胶色谱法将相对）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（）。）。思考思考样品的粗分离样品的粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定你能描述血红蛋白的提取和分离的你能描述血红蛋白的提取和分离的完整过程吗？完整过程吗？P70 第第4题题6/27/202441方血红蛋白的提取和分离血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。离过程非常直观，大大简化了实验操作。思考思考6/27/202442方血红蛋白的提取和分离3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳判断（判断（）的蛋白质是否达到要求，）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的纯度鉴定。需要进行蛋白质的纯度鉴定。纯化纯化血红核蛋白血红核蛋白纯度鉴定纯度鉴定6/27/202443方血红蛋白的提取和分离 观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见教科书图（见教科书图5-5-1818），），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。的提取纯度。三、实验结果分析与评价三、实验结果分析与评价 1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？理后的样品发生了哪些变化吗？2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？柱装填得成功吗？你是如何判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。以消除气泡，消除不了时要重新装柱。6/27/202444方血红蛋白的提取和分离 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。3 3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？此判断分离效果？6/27/202445方血红蛋白的提取和分离回忆蛋白质的回忆蛋白质的有关知识有关知识6/27/202446方血红蛋白的提取和分离(一）蛋白质一）蛋白质占细胞干重的占细胞干重的5050以上，细胞中含量最多的以上，细胞中含量最多的有机物有机物2 2、组成元素、组成元素C C、H H、O O、N N一、基础知识一、基础知识1 1、含量、含量3 3、相对分子质量、相对分子质量高分子化合物高分子化合物6/27/202447方血红蛋白的提取和分离4 4、基本组成单位、基本组成单位氨基酸氨基酸5 5、氨基酸通式、氨基酸通式R RH HC CCOOHCOOHNHNH2 26 6、氨基酸连接方式、氨基酸连接方式脱水缩合脱水缩合6/27/202448方血红蛋白的提取和分离8 8、分子结构、分子结构7 7、肽键、肽键COCONHNH氨基酸氨基酸肽链肽链蛋白质蛋白质脱水缩合脱水缩合盘曲折叠盘曲折叠（一条或者多条）（一条或者多条）6/27/202449方血红蛋白的提取和分离1010、生理功能、生理功能细细胞胞和和生生物物体体的的结结构构物物质质，是是人人体体发发育育和和组组织织更更新新的的主主要要原原料料，具具有有运运输输、调调节节、免免疫疫、催化等作用，是一切生命活动的主要承担者催化等作用，是一切生命活动的主要承担者氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别序变化多端；多肽链的空间结构千差万别9 9、蛋白质结构的多样性、蛋白质结构的多样性6/27/202450方血红蛋白的提取和分离氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基（不计基，另一端只有一个羧基（不计R R基上的氨基和基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个基和羧基都是一个若有个若有个n n氨基酸分子缩和成氨基酸分子缩和成m m条肽链条肽链,则可形成则可形成n-mn-m个肽键个肽键,脱去个脱去个n-mn-m个水分子，至有氨基个水分子，至有氨基和和 羧基各羧基各m m个个1111、相关计算、相关计算6/27/202451方血红蛋白的提取和分离（1）血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：）血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：_、_、_和和_。（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的加入柠檬酸钠的目的_。以上所述的过程即是样品处理，它包括以上所述的过程即是样品处理，它包括_、_、收集血红蛋白溶液。、收集血红蛋白溶液。（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。的粗分离。透析的目的是透析的目的是_。透析的原理是透析的原理是_。（4）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS聚聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。样品纯化的目的样品纯化的目的_。血红蛋白有什么特点？血红蛋白有什么特点？_。这一特点对进。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义行蛋白质的分离有什么意义_。6/27/202452方血红蛋白的提取和分离答案答案:样品处理样品处理 粗分离粗分离 纯化纯化 纯度鉴定纯度鉴定 防止血液凝固防止血液凝固 红细胞洗涤红细胞洗涤 血红蛋白释放血红蛋白释放 去除相对分子质量较小的杂质去除相对分子质量较小的杂质 透析袋能使小分子透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内自由进出，而大分子则保留在袋内 通过凝胶色谱法，将相对分子质量大的杂质蛋白除去通过凝胶色谱法，将相对分子质量大的杂质蛋白除去 呈现红色呈现红色 在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液，这使血红蛋白的分离过程非常什么时候应该收集洗脱液，这使血红蛋白的分离过程非常直观直观,简化了实验操作。简化了实验操作。6/27/202453方血红蛋白的提取和分离