液相色谱故障诊断课件

液相色谱故障诊断液相色谱故障诊断液相色谱故障诊断液相色谱故障诊断峰 型所有的1峰峰 型型所有的峰都展宽柱效降低柱死体积大进样量/质量高粘度流动相 部分峰展宽前次进样后流出的组分大分子量样品蛋白或聚合物峰展宽样品与流动相不匹配峰 型所有的峰都展宽柱效降低柱死体积大进样量/质量高2峰峰 型型拖尾峰对称性 1.2NormalTailingNormalTailing原因：原因：部分峰拖尾二次保留效应残留硅醇基的反应小峰紧跟在大峰的后面流出柱头有污染金属所有峰拖尾额外的柱效应柱坏/不适当的溶剂不适当的样品量峰 型拖尾峰对称性 1.2NormalTailingN3峰峰 型型正常峰伸舌峰前伸峰不对称性 0.9可能的原因可能的原因柱过载在大峰前，有小峰流出样品溶剂不适当柱死体积过滤片部分堵塞峰 型正常峰伸舌峰前伸峰不对称性 0.9可能的原因柱过载4峰峰 型型原因:流动相吸收本底高 进样过程中进了空气 离子对分离中的系统峰 样品组分的吸收(RI或UV)低于流动相峰 型原因:5宽宽 峰峰柱外体积增加*在进样口到柱或柱到检测器之间，使用细的短的连接管*保证所有的管路接头都使用正确*用小体积检测池*减少进样量或降低样品浓度宽 峰柱外体积增加*在进样口到柱或柱到检测器之间，使用细的6HPLC常见问题系统压力问题压力高压力低或没有压力压力不稳流路基线噪音问题基线不稳定(不重复)长、短程振荡基线漂移噪音脉冲尖刺HPLC常见问题系统压力问题7HPLC常见问题分析系统压力问题压力高的原因温度太低流速太高流动相粘度大管路堵塞仪器或色谱柱堵塞压力传感器问题HPLC常见问题分析系统压力问题8HPLC常见问题分析(续)系统压力问题压力低或没有压力温度太高;流速太低泵关闭或保险丝断了泵未输送流动相储液瓶中无溶剂 低压限设置不当泵未正确排气溶剂入口过滤头堵 入口管路中有空气泵失效系统内有渗漏处所用溶剂不正确自动进样器在Purge时卡住HPLC常见问题分析(续)系统压力问题9HPLC常见问题分析(续)系统压力问题压力不稳压力传感器问题泵排气不充分泵失效流动相未正确脱气所用溶剂不混溶或易挥发HPLC常见问题分析(续)系统压力问题10HPLC常见问题分析(续)流路基线噪音问题短程振荡泵压不稳泵入口管松,弯或堵塞溶剂混合不充分检测池中有大气泡泵入口阀脏或失效泵柱塞杆密封垫磨损检测器出口溶液成滴状流入废液瓶HPLC常见问题分析(续)流路基线噪音问题11判断故障与故障排除的原则规则一确认问题至少发生两次以上。如果问题不重复 出现，很难证实其确实存在。规则二一次只变化一个因素，以使你能够确认所变因 素与问题之间的关联。规则三恢复原状。如果使用更换组件方法来查找问题 之所在,完毕后应将原有完好组件安装回原处。否则,换下的组件将来很难再利用,会造成浪费。规则四尝试预测将来可能发生的问题。利用成功的故 障排除经验来改善您目前的预防保养工作,使现 有问题再发率降至最低。规则五养成记录的好习惯。一个好记录是成功地进行 故障排除的关键。判断故障与故障排除的原则规则一确认问题至少发生两次以上。如12色谱图常见问题色谱图常见问题主要有两类:色谱峰峰形异常问题例如负峰,宽峰,肩峰,双峰,峰形不对称等色谱峰保留时间问题保留时间不稳定等色谱图常见问题色谱图常见问题主要有两类:13色谱图常见问题分析(一)色谱峰峰形异常问题:色谱图中未出峰:进样问题:未进样或样品分解流动相问题:泵未输液或流动相不正确检测器设置不正确,或检测器有问题一个或几个峰是负峰流动相吸收本底高进样过程中进了空气离子对分离中的系统峰样品组分的吸收(RI或UV)低于流动相色谱图常见问题分析(一)色谱峰峰形异常问题:14色谱图常见问题分析(一)(续)色谱峰峰形异常问题:峰比预想的要小样品粘度过大进样器有问题或进样体积有误检测器设置不正确,定量环(Loop)体积不正确检测器输出未置零用了不正确的检测器输出信号检测池被污染检测器的灯可能有问题色谱图常见问题分析(一)(续)色谱峰峰形异常问题:15色谱图常见问题分析(一)(续)色谱峰峰形异常问题:双峰或肩峰进样量或样品浓度过大保护柱或色谱柱进口堵塞保护柱或色谱柱污染或失效前伸峰进样量或样品浓度过大溶样的溶剂相对于流动相太强保护柱或色谱柱污染或失效色谱图常见问题分析(一)(续)色谱峰峰形异常问题:16色谱图常见问题分析(一)(续)色谱峰峰形异常问题:拖尾峰保护柱或色谱柱问题:污染或失效(选择合适的柱子)进样问题检测器时间常数不正确平头峰检测器设置不正确进样体积太大或样品浓度太高色谱图常见问题分析(一)(续)色谱峰峰形异常问题:17色谱峰保留时间问题:保留时间飘忽不定(各次运行之间)系统不稳定或未达化学平衡泵压力不稳(泵头里有气泡)进样体积过大或样品浓度过大温度波动流动相混合不均匀色谱柱被污染色谱图常见问题分析(二)色谱峰保留时间问题:色谱图常见问题分析(二)18色谱峰保留时间问题:保留时间增加或减少(各次运行之间)系统不稳定或化学平衡不足泵流速变化温度变化色谱柱污染,柱效下降流动相被污染溶剂入口过滤器堵或管路堵塞系统渗漏色谱图常见问题分析(二)(续)色谱峰保留时间问题:色谱图常见问题分析(二)(续)19色谱图常见问题分析(二)(续)色谱峰保留时间问题:保留时间改变到一个新的恒定值流动相不正确或其组成不正确泵流速变化实际输液的流速不正确(泵失灵或故障)环境温度变化；柱温不正确色谱柱尺寸或类型不正确色谱柱被污染流动相含有稳定剂或稳定剂发生变化输液系统的梯度滞后体积不正确色谱图常见问题分析(二)(续)色谱峰保留时间问题:20液相色谱实用技术 色谱柱的使用和保养液相色谱实用技术 色谱柱的使用和保养21色谱柱的选择非极性或极性较小的样品可用一般的非极性或极性较小的样品可用一般的C18C18柱柱酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化过的过的C18C18柱，柱，PHPH范围范围2-92-9（1212）糖类，氨基酸，有机酸，多环芳烃，糖类，氨基酸，有机酸，多环芳烃，GPCGPC有有专用柱专用柱色谱柱的选择非极性或极性较小的样品可用一般的C18柱22键合相色谱柱以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上作为固定相。这种固定相要占所有柱填料的60-70%优点固定相稳定，不易流失应用广泛，可使用多种溶剂消除硅羟基的不良影响缺点pH值不能小于2或大于8同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同键合相色谱柱以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺23反相HPLC柱（C18）的性能常规C18填料的稳定性硅胶基质填料pH范围：2-8 pH值大于7时键合相粉碎或溶解pH值小于2时键合相的化学键断裂经常用缓冲液 固定相降解填料新的键合技术 -PH范围 2-12 -稳定性好，使用寿命长反相HPLC柱（C18）的性能常规C18填料的稳定性24良好的色谱实验习惯拿到一根新色谱柱时，先测柱效保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件定期检测柱效良好的色谱实验习惯拿到一根新色谱柱时，先测柱效25色谱柱的使用及操作流动相的转换特别是GPC柱流速(压力)的变化幅度温度的变化幅度专用色谱柱样品及溶剂的要求色谱柱的使用及操作流动相的转换26色谱柱的保养（一）样品方面除去微粒及杂质了解样品在流动相中的溶解度如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用色谱柱的保养（一）样品方面27样品准备样品准备28为什么溶剂和样品要过滤?溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。护作用，消除由于污染对分析结果的影响。色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。损。样品过滤头的类型：样品过滤头的类型：30mm 内径：适用于大进样量的过滤，由内径：适用于大进样量的过滤，由0.2m 和和0.45m 两种规格两种规格,材料有纤维素材料有纤维素,醋酸纤维醋酸纤维,聚四氟乙烯。聚四氟乙烯。处理样品体积少于处理样品体积少于50l。13mm 内径：适用于范围广的过滤，由内径：适用于范围广的过滤，由0.2m 和和0.45m 两种规格两种规格,材料为纤维素。材料为纤维素。3mm 内径：适用于小进样量的过滤，由内径：适用于小进样量的过滤，由0.2m 和和0.45m 两种规格。处理样品体积为两种规格。处理样品体积为7l。为什么溶剂和样品要过滤?溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱29色谱柱的保养（二）流动相方面除去微粒纯度的要求超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低（建议走空白检验）缓冲液的pH值，在填料的允许范围内缓冲液（盐）的浓度溶剂：色谱纯，并与填料相匹配溶剂中的杂质含量注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂 流动相对样品的溶解度有机溶剂或水的比例色谱柱的保养（二）流动相方面30溶剂过滤-除去微粒不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器以及色谱柱。遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器和色谱柱的寿命：使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌。用滤膜过滤溶剂去除微生物。每两天更换或过滤溶剂。避免溶剂瓶直接日照。向溶剂中加入0.0001-0.001M的叠氮化钠。溶剂过滤-除去微粒不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞31溶剂准备：过滤溶剂准备：过滤32选择合适的滤膜聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。醋酸纤维滤膜：适用于水基溶剂，不适用于有机溶剂，推荐用于蛋白质和其相关的样品。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸、70%乙醇、二氯甲烷、不适用于DMF二甲基甲酰胺再生纤维素滤膜：具有蛋白质吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂。注意：1）每张滤膜只能用一次。2）水相和有机相不要搞混。选择合适的滤膜聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无33溶剂的相溶性溶剂的相溶性34溶剂信息避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂：卤化物碱金属溶液和相应的酸溶液。高浓度的无机酸例如：硝酸和硫酸。能够形成卤素自由基或酸的氯化试剂及其混合物。含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂。在有机溶剂中的有机酸溶液。含有强络合剂的溶液。四氯化碳和异丙醇或THF混合液。溶剂信息避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂：35溶剂截止波长溶剂截止波长36溶剂准备：脱气溶剂准备：脱气37流动相使用前为什么要脱气？流动相使用前必须进行脱气处理流动相使用前必须进行脱气处理，以除去，以除去其中溶解的气体（如其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。，可能会造成荧光猝灭。流动相使用前为什么要脱气？流动相使用前必须进行脱气处理，38常用的脱气方法比较：氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。氦脱气，效果较好，但成本高。加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染抽真空脱气法：易抽走有机相。抽真空脱气法：易抽走有机相。超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。，此法效果最差。在线真空脱气法：在线真空脱气法：LC 真空脱机利用膜渗透技术，真空脱机利用膜渗透技术，在线脱在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。常用的脱气方法比较：氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比39典型的流速典型的流速40流动相的保存有机溶剂流动相:室温下密封,避光保存缓冲盐流动相:当日现配现用低温下密封保存,一般不超过3天防止长菌有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:低温密封保存防止有机相的挥发选用适宜的容器流动相的保存有机溶剂流动相:412 星期1 天1 星期1 小时新鲜配制5101520250分保存于聚乙烯瓶中的超纯水测试条件测试条件水样水样:40ml trace enrichment 2.0 ml/min:40ml trace enrichment 2.0 ml/min色谱柱色谱柱:C18:C18 反相柱反相柱 (Waters)(Waters)梯度梯度:线性线性 100%100%水水 100%100%乙腈乙腈波长波长:254 nm:254 nm2 星期1 天1 星期1 小时新鲜配制5101520250分421 天1星期新鲜配制5101520250分保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水测试条件测试条件水样水样:40ml trace enrichment 2.0 ml/min:40ml trace enrichment 2.0 ml/min色谱柱色谱柱:C18:C18 反相柱反相柱 (Waters)(Waters)梯度梯度:线性线性 100%100%水水 100%100%乙腈乙腈波长波长:254 nm:254 nm1 天1星期新鲜配制5101520250分保存于标准棕色玻璃43色谱柱日常使用过滤所有的溶剂和样品过滤所有的溶剂和样品使用保护柱使用保护柱不要把柱接头上得太紧，损坏接头螺纹易渗液不要把柱接头上得太紧，损坏接头螺纹易渗液开机时，流速和柱压要逐渐增加开机时，流速和柱压要逐渐增加进样前检查色谱系统的各个接头是否有漏液进样前检查色谱系统的各个接头是否有漏液注意色谱柱的注意色谱柱的pHpH值使用范围值使用范围不要高温下过长时间使用硅胶键合相柱子不要高温下过长时间使用硅胶键合相柱子关机前先用水冲洗整个系统，移走缓冲液后再用有机相冲洗关机前先用水冲洗整个系统，移走缓冲液后再用有机相冲洗不要高压冲洗柱子不要高压冲洗柱子色谱柱日常使用过滤所有的溶剂和样品44色谱柱保护色谱柱保护45在线的保护装置给色谱柱提供物理的保护除去样品及流动相中的颗粒给色谱柱提供化学的保护防止分析柱被化学污染装置在线过滤器自装填料保护柱预装保护柱在线的保护装置给色谱柱提供物理的保护46新型的保护柱特点高质量,高效填料-不损失柱效增加分析柱效-增加适应范围20mm柱长-脏样品载荷能力大，能延长保护柱寿命手可拧紧接头，安装时不需要工具通用柱套-适用于所有的HPLC柱(3.9及4.6内径)整体式-使用方便，容易各种不同填料配合色谱柱新型的保护柱特点47色谱柱常见毛病柱压过高多少才算高?不同色谱柱有差异不同系统有差异不同溶剂有差异柱效低重复性差不出峰，回收率低色谱柱常见毛病柱压过高48柱压过高 为什么柱压会过高微粒堵塞样品流动相密封垫柱床膨胀不可逆吸附细菌生长柱压过高 为什么柱压会过高49柱效低为什么柱效低色谱柱被污染过滤片部分堵塞样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞色谱柱内的死体积流动相pH值及组成不合适造成固定相流失流速急剧变化造成固定相物理损坏机械震动造成固定相产生裂缝柱床收缩或干枯柱效低为什么柱效低50重复性差、回收率低实验的重复性差色谱柱被污染流动相pH值及组成不合适造成键合相流失样品溶剂不同或样品本身不稳定回收率低，不出峰“不可逆”吸附固定相过强或流动相过弱非特异性吸附重复性差、回收率低实验的重复性差51色谱柱的日常清洗对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗（如反相C18柱用100%甲醇或乙腈）硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂质，再用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化键合相柱(烷基)的一般方法20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗 柱子尺寸 柱子体积 冲洗体积 150 x4.6mm 2.5ml 50ml 200 x4.6mm 3.3ml 65ml 250 x4.6mm 4.2ml 80ml*再有杂质严格清洗：20倍柱体积的水-相同体积的0.05mol/L硫酸，最后用流 动相清洗色谱柱的日常清洗对所做的样品要有充分的了解52色谱柱的清洗-物理阻塞l在安装柱前后测试压力差l如果柱压力太高，反装色谱柱，并用10-20倍柱体积的 流动相冲洗色谱柱，监测压力变化l若出现沉淀(如：蛋白凝聚、细胞物、聚合物)设法用相应的可溶性溶剂，如 0.1%TFA/80%乙腈,6M 盐酸胍,THF,HFIPl若仍无效，应考虑更换过滤片色谱柱的清洗-物理阻塞在安装柱前后测试压力差53色谱柱头塌陷的修补 柱头有塌陷可用填料修补：1）松开柱入口接头，拆下不锈钢烧结过滤器，常见柱头塌陷，剔掉无规则床层和带色填料，使柱床呈白色水平面，滴一滴甲醇，加少许填料使沉降，如此反复多次后，用刮刀将填料刮平，放上清洗过的不锈钢烧结过滤器，装上柱入口接头，把柱重新接到LC仪器上慢慢地增加流速，直到操作上限为止。2）如果柱头塌陷较深（小于1cm）可逐渐减低流速至零，再次拆下柱子，用填料修补直到塌陷填满为止。色谱柱头塌陷的修补 柱头有塌陷可用填料修补：54色谱柱的存放存放前的处理存放前的处理除去杂质、盐等，防止细菌生长除去杂质、盐等，防止细菌生长合适的存放溶剂合适的存放溶剂两端密封保存，两端密封保存，避免色谱柱床干枯避免色谱柱床干枯避免机械震动避免机械震动注意存放的温度注意存放的温度色谱柱的存放存放前的处理55色谱柱以外的因素（一）“柱效”问题，不一定是色谱柱问题！仪器问题：连接不好造成死体积进样器检测器管路，连接口保护柱在线过滤器堵塞流动相问题：色谱柱未平衡好进样量太大色谱柱以外的因素（一）“柱效”问题，不一定是色谱柱问题！56色谱柱与仪器的联接不同公司产品，其接头不同。处理不当时，会造成：色谱峰展宽（死体积）使柱效下降、或渗漏解决办法：使用“通用”型接头（锥箍及螺母）这种锥箍在不锈钢管上是活动的，因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。PEEK工程塑料的接头，可用在所有类型的色谱柱上的。色谱柱与仪器的联接不同公司产品，其接头不同。处理不当时，会造57色谱柱以外的因素（二）柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！系统反压问题阻尼器堵塞进样器堵塞管路或连接口堵塞在线过滤器不干净保护柱压力传感器不准确流速是否错误?色谱柱以外的因素（二）柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！58色谱柱以外的因素（三）实验的重复性差梯度实验时平衡时间不足温度波动流动相组成改变样品溶剂不同样品稳定性不好方法的开发不好缓冲液的pH值不合适缓冲液的缓冲能力不足色谱柱以外的因素（三）实验的重复性差59手动进样器-六通阀的结构手动进样器-六通阀的结构60手动进样器清洗为避免出现怪峰，冲洗注射针时最好用流动相（不含盐）冲洗手动进样器清洗为避免出现怪峰，冲洗注射针时最好用流动相（不含61谢谢！谢谢！62