大肠杆菌基因工程培训ppt课件

大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程1细菌与基因工程密不可分。细菌与基因工程密不可分。19731973年，年，BoyerBoyer和和CohenCohen首次首次完成外源基因在大肠杆菌中的表达，在实验室里实现了基完成外源基因在大肠杆菌中的表达，在实验室里实现了基因转移，为基因工程开启了通向现实应用的大门。因转移，为基因工程开启了通向现实应用的大门。几年后，第一个基因工程产品几年后，第一个基因工程产品利用构建基因的基因工程利用构建基因的基因工程菌生产人胰岛素获得成功，从此人类进入了生物技术的产菌生产人胰岛素获得成功，从此人类进入了生物技术的产业时代。业时代。细菌不仅在基因重组技术的诞生和技术进步中起到了举细菌不仅在基因重组技术的诞生和技术进步中起到了举足轻重的作用，而且细菌的遗传改造也是基因工程中历史足轻重的作用，而且细菌的遗传改造也是基因工程中历史最早、研究最广泛、取得实际应用成果最多的领域。最早、研究最广泛、取得实际应用成果最多的领域。大肠杆菌基因工程2细菌与基因工程密不可分。1973年，Boyer和Cohen首7-1.7-1.大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程C C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略大肠杆菌基因工程菌的构建策略大肠杆菌基因工程菌的构建策略大肠杆菌基因工程菌的构建策略B B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理A A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征E E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素利用重组大肠杆菌生产人胰岛素利用重组大肠杆菌生产人胰岛素利用重组大肠杆菌生产人胰岛素D D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌的遗传不稳定性及其对策大肠杆菌基因工程37-1.大肠杆菌基因工程C 大肠杆菌基因工程菌的构一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的优势大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有全基因组测序，共有全基因组测序，共有全基因组测序，共有44054405个开放型阅读框架个开放型阅读框架个开放型阅读框架个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善基因克隆表达系统成熟完善基因克隆表达系统成熟完善基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国被美国被美国被美国FDAFDA批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌基因工程4一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素细胞周质内含有种类繁多的内毒素大肠杆菌基因工程5大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏二、外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理二、外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理启动子启动子启动子启动子终止子终止子终止子终止子核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点密码子密码子密码子密码子质粒拷贝数质粒拷贝数质粒拷贝数质粒拷贝数大肠杆菌基因工程6二、外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理启动子终止子核糖体结合（一）启动子（一）启动子（一）启动子（一）启动子vv启动子最佳距离的探测启动子最佳距离的探测启动子最佳距离的探测启动子最佳距离的探测目的基因目的基因E EE EAA启动子启动子启动子启动子A A 酶切开酶切开酶切开酶切开Bal31Bal31酶解酶解酶解酶解目的基因目的基因E EE E大肠杆菌基因工程7（一）启动子启动子最佳距离的探测目的基因EEA启动子A 酶切vv启动子的筛选启动子的筛选启动子的筛选启动子的筛选ApAprroriorigalKgalKpKO1pKO1采用鸟枪法战略，将合适大小的采用鸟枪法战略，将合适大小的采用鸟枪法战略，将合适大小的采用鸟枪法战略，将合适大小的DNADNA片段克片段克片段克片段克隆到启动子探针质粒隆到启动子探针质粒隆到启动子探针质粒隆到启动子探针质粒pKO1pKO1上；上；上；上；受体细胞染色体受体细胞染色体受体细胞染色体受体细胞染色体DNADNA上的上的上的上的galEgalE、galTgalT与质粒上与质粒上与质粒上与质粒上报告基因报告基因报告基因报告基因galkgalk的表达产物联合作用，可将培养的表达产物联合作用，可将培养的表达产物联合作用，可将培养的表达产物联合作用，可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质。基中的半乳糖酵解成红色素物质。基中的半乳糖酵解成红色素物质。基中的半乳糖酵解成红色素物质。转化转化转化转化galEgalE+、galTgalT+、galKgalK-的大肠杆菌受体菌株的大肠杆菌受体菌株的大肠杆菌受体菌株的大肠杆菌受体菌株含有外源启动子活性的重组克隆含有外源启动子活性的重组克隆含有外源启动子活性的重组克隆含有外源启动子活性的重组克隆大肠杆菌基因工程8启动子的筛选AprorigalKpKO1采用鸟枪法战略，将合vv启动子的构建启动子的构建启动子的构建启动子的构建-35-35 区序列区序列区序列区序列-10-10 区序列区序列区序列区序列P PLLP PrecArecAP PtrptrpP PlaclacP PtraAtraAP Ptactac启动子启动子启动子启动子T T G A C AT T G A C AG A T A C TG A T A C TT T G A T AT T G A T AT A T A A TT A T A A TT T G A C AT T G A C AT T A A C TT T A A C TT A G A C AT A G A C AT A A T G TT A A T G TT T T A C AT T T A C AT A T A A TT A T A A TT T G A C AT T G A C AT A T A A TT A T A A T大肠杆菌基因工程9启动子的构建-35 区序列-10 区序列PLPrecAPtrvv启动子的可控性启动子的可控性启动子的可控性启动子的可控性P PFF乳糖启动子乳糖启动子乳糖启动子乳糖启动子P Placlac的可控性的可控性的可控性的可控性：OOP PO高效转录高效转录阻遏蛋白阻遏蛋白诱导诱导乳糖乳糖 异丙基异丙基-D-D-硫硫代半乳糖苷（代半乳糖苷（IPTGIPTG）野生型的野生型的野生型的野生型的P Placlac与其控制区与其控制区与其控制区与其控制区OOlaclac偶联在一起，在没有诱导物偶联在一起，在没有诱导物偶联在一起，在没有诱导物偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基存在时，整个操纵子处于基存在时，整个操纵子处于基存在时，整个操纵子处于基底水平表达；底水平表达；底水平表达；底水平表达；基底水平转录基底水平转录诱导物可以使启动子诱导物可以使启动子诱导物可以使启动子诱导物可以使启动子P Placlac介导的转录大幅提高。介导的转录大幅提高。介导的转录大幅提高。介导的转录大幅提高。大肠杆菌基因工程10启动子的可控性P乳糖启动子Plac的可控性：OPO高效转录阻P PlaclacOO高效转录高效转录高效转录高效转录葡萄糖代谢葡萄糖代谢葡萄糖代谢葡萄糖代谢野生型的野生型的野生型的野生型的P Placlac上游附近拥有上游附近拥有上游附近拥有上游附近拥有代谢激活因子代谢激活因子代谢激活因子代谢激活因子（CAPCAP）结合结合结合结合区，区，区，区，cAMPcAMP激活激活激活激活CAPCAP，CAPCAP结合启动子控制区，进而促结合启动子控制区，进而促结合启动子控制区，进而促结合启动子控制区，进而促进进进进P Placlac介导的转录。介导的转录。介导的转录。介导的转录。基底水平转录基底水平转录基底水平转录基底水平转录葡萄糖代谢使葡萄糖代谢使葡萄糖代谢使葡萄糖代谢使cAMPcAMP减少，减少，减少，减少，也能阻遏也能阻遏也能阻遏也能阻遏P Placlac介导的转录。因介导的转录。因介导的转录。因介导的转录。因此，基因工程中使用的乳糖此，基因工程中使用的乳糖此，基因工程中使用的乳糖此，基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻启动子均为抗葡萄糖代谢阻启动子均为抗葡萄糖代谢阻启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即遏的突变型，即遏的突变型，即遏的突变型，即P Plac lac UV5UV5。CAPCAPcAMPcAMPcAMPcAMP浓度降低浓度降低浓度降低浓度降低P Plac lac UV5UV5OO高效转录高效转录高效转录高效转录P PlaclacOOFF乳糖启动子乳糖启动子乳糖启动子乳糖启动子P Placlac的可控性的可控性的可控性的可控性：大肠杆菌基因工程11PlacO高效转录葡萄糖代谢野生型的Plac上游附近拥有基底色氨酸启动子色氨酸启动子色氨酸启动子色氨酸启动子P Ptrptrp的可控性：的可控性：的可控性：的可控性：除去除去除去除去色氨酸色氨酸色氨酸色氨酸色氨酸启动子色氨酸启动子色氨酸启动子色氨酸启动子P Ptrptrp受色氨酸受色氨酸受色氨酸受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转阻遏蛋白复合物的阻遏，转阻遏蛋白复合物的阻遏，转阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态；录呈基底状态；录呈基底状态；录呈基底状态；在培养系统中去除色氨酸或在培养系统中去除色氨酸或在培养系统中去除色氨酸或在培养系统中去除色氨酸或者加入者加入者加入者加入3-3-吲哚丙烯酸（吲哚丙烯酸（吲哚丙烯酸（吲哚丙烯酸（IAAIAA），），），），便可有效地解除阻遏抑制作用。便可有效地解除阻遏抑制作用。便可有效地解除阻遏抑制作用。便可有效地解除阻遏抑制作用。基底水平转录基底水平转录基底水平转录基底水平转录在正常的细菌培养体系中在正常的细菌培养体系中在正常的细菌培养体系中在正常的细菌培养体系中,除除除除去色氨酸是困难的，因此基因工去色氨酸是困难的，因此基因工去色氨酸是困难的，因此基因工去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加程中往往添加程中往往添加程中往往添加IAAIAA诱导诱导诱导诱导P Ptrptrp介导的目基因的表达。介导的目基因的表达。介导的目基因的表达。介导的目基因的表达。色氨酸色氨酸色氨酸色氨酸或加或加或加或加3-3-吲哚丙烯酸吲哚丙烯酸吲哚丙烯酸吲哚丙烯酸高效转录高效转录高效转录高效转录P PtrptrpOOtrptrp阻遏蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白 （IAAIAA）OOtrptrpP Ptrptrp高效转录高效转录高效转录高效转录OOtrptrpP Ptrptrp大肠杆菌基因工程12色氨酸启动子Ptrp的可控性：除去色氨酸色氨酸启动子Ptrpl l l l噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体启动子启动子启动子启动子P Pl ll lLL的可控性：的可控性：的可控性：的可控性：噬菌体启动子噬菌体启动子噬菌体启动子噬菌体启动子P PLL受受受受CICI阻遏蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导控制。在基阻遏，很难直接诱导控制。在基阻遏，很难直接诱导控制。在基阻遏，很难直接诱导控制。在基因工程中常使用温度敏感型的因工程中常使用温度敏感型的因工程中常使用温度敏感型的因工程中常使用温度敏感型的cIcI突变基因突变基因突变基因突变基因cI857cI857控制控制控制控制PLPL。cI857cI857阻遏蛋在阻遏蛋在阻遏蛋在阻遏蛋在4242时失活脱落，时失活脱落，时失活脱落，时失活脱落，P PLL便可介导目的基因的表达便可介导目的基因的表达便可介导目的基因的表达便可介导目的基因的表达.P PtrptrpAAcIcI857857BBP PLL目的基因目的基因阻遏作用阻遏作用BBP PLLP PtrptrpAA表达表达色氨酸色氨酸但在大型细菌培养罐中迅速升温但在大型细菌培养罐中迅速升温但在大型细菌培养罐中迅速升温但在大型细菌培养罐中迅速升温非常困难，因此常使用一个双质粒非常困难，因此常使用一个双质粒非常困难，因此常使用一个双质粒非常困难，因此常使用一个双质粒控制系统控制系统控制系统控制系统，用色氨酸间接控制目的用色氨酸间接控制目的用色氨酸间接控制目的用色氨酸间接控制目的基因表达。基因表达。基因表达。基因表达。大肠杆菌基因工程13l噬菌体启动子PlL的可控性：噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白（二）终止子（二）终止子（二）终止子（二）终止子1.1.强化转录终止的必要性强化转录终止的必要性强化转录终止的必要性强化转录终止的必要性v外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的粒上邻近的DNADNA序列，形成长短不一的序列，形成长短不一的mRNAmRNA混合物；混合物；v过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达。表达。大肠杆菌基因工程14（二）终止子1.强化转录终止的必要性外源基因在强启动子的控如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNADNA功功功功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；致重组质粒的不稳定性；致重组质粒的不稳定性；致重组质粒的不稳定性；转录产物越长，转录产物越长，转录产物越长，转录产物越长，RNARNA聚合酶转录一分子聚合酶转录一分子聚合酶转录一分子聚合酶转录一分子mRNAmRNA所需的时间所需的时间所需的时间所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；过长的过长的过长的过长的mRNAmRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；无谓的能量消耗；无谓的能量消耗；无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。大肠杆菌基因工程15如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功转录产物2.2.强终止子的选择与使用强终止子的选择与使用强终止子的选择与使用强终止子的选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的终目前外源基因表达质粒中常用的终目前外源基因表达质粒中常用的终目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌止子是来自大肠杆菌止子是来自大肠杆菌止子是来自大肠杆菌rRNArRNA操纵子上操纵子上操纵子上操纵子上的的的的rrnTrrnT11T T22以及以及以及以及T7T7噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA上的上的上的上的T Tf f f f；pCP1pCP1ApAprrorioriTcTcrr筛选筛选筛选筛选ApAprr、TcTcss的转化子的转化子的转化子的转化子对于一些终止作用较弱的终止子，对于一些终止作用较弱的终止子，对于一些终止作用较弱的终止子，对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特通常可以采用二聚体终止子串联的特通常可以采用二聚体终止子串联的特通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用；殊结构，以增强其转录终止作用；殊结构，以增强其转录终止作用；殊结构，以增强其转录终止作用；终止子也可以象启动子那样，从细终止子也可以象启动子那样，从细终止子也可以象启动子那样，从细终止子也可以象启动子那样，从细菌或噬菌体基因组菌或噬菌体基因组菌或噬菌体基因组菌或噬菌体基因组DNADNA中克隆筛选。中克隆筛选。中克隆筛选。中克隆筛选。终止子序列终止子序列终止子序列终止子序列大肠杆菌基因工程162.强终止子的选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的终pC（三）核糖体结合位点（三）核糖体结合位点（三）核糖体结合位点（三）核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与转录启动的频率，而且在很大程度上还与转录启动的频率，而且在很大程度上还与转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNAmRNA的翻译的翻译的翻译的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNAmRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。数百倍。数百倍。数百倍。mRNAmRNA翻译的起始效率主要由其翻译的起始效率主要由其翻译的起始效率主要由其翻译的起始效率主要由其5 5 端的结构序端的结构序端的结构序端的结构序列所决定，称为列所决定，称为列所决定，称为列所决定，称为核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点核糖体结合位点（RBSRBS）大肠杆菌基因工程17（三）核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表四个特征结构要素：四个特征结构要素：四个特征结构要素：四个特征结构要素：1.1.核糖体结合位点的结构核糖体结合位点的结构核糖体结合位点的结构核糖体结合位点的结构Shine-DalgarnoShine-Dalgarno（SDSD）序列：序列：序列：序列：位于翻译起始密码子上游的位于翻译起始密码子上游的位于翻译起始密码子上游的位于翻译起始密码子上游的6-86-8个个个个核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列5 5 UAAGGAGG 3UAAGGAGG 3，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚它通过识别大肠杆菌核糖体小亚它通过识别大肠杆菌核糖体小亚它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的基中的基中的基中的1616S rRNA 3S rRNA 3端区域端区域端区域端区域3 3 AUUCCUCC 5AUUCCUCC 5并与之专一性结合，并与之专一性结合，并与之专一性结合，并与之专一性结合，将将将将mRNAmRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；定位于核糖体上，从而启动翻译；定位于核糖体上，从而启动翻译；定位于核糖体上，从而启动翻译；翻译起始密码子：翻译起始密码子：翻译起始密码子：翻译起始密码子：大肠杆菌绝大部分基因以大肠杆菌绝大部分基因以大肠杆菌绝大部分基因以大肠杆菌绝大部分基因以AUGAUG作为阅读框架作为阅读框架作为阅读框架作为阅读框架的起始位点的起始位点的起始位点的起始位点,但有些基因也使用但有些基因也使用但有些基因也使用但有些基因也使用GUGGUG或或或或UUGUUG作为翻译起始密码子；作为翻译起始密码子；作为翻译起始密码子；作为翻译起始密码子；SDSD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成。序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成。序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成。序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成。基因编码区基因编码区基因编码区基因编码区5 5 端若干密码子的碱基序列。启始密码子后为端若干密码子的碱基序列。启始密码子后为端若干密码子的碱基序列。启始密码子后为端若干密码子的碱基序列。启始密码子后为GCAUGCAU或或或或AAAAAAAA时，翻译效率最高。时，翻译效率最高。时，翻译效率最高。时，翻译效率最高。大肠杆菌基因工程18四个特征结构要素：1.核糖体结合位点的结构Shine-Da2.2.核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SDSD序列的影响序列的影响序列的影响序列的影响：一般来说，一般来说，一般来说，一般来说，mRNAmRNA与核糖体的结合程度越强，翻译与核糖体的结合程度越强，翻译与核糖体的结合程度越强，翻译与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SDSD序列序列序列序列与与与与1616S rRNAS rRNA的碱基互补性，其中以的碱基互补性，其中以的碱基互补性，其中以的碱基互补性，其中以GGAGGGAG四个碱基序列四个碱基序列四个碱基序列四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成换成换成换成C C或或或或T T，均会导致翻译效率大幅度降低均会导致翻译效率大幅度降低均会导致翻译效率大幅度降低均会导致翻译效率大幅度降低 。大肠杆菌基因工程192.核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD序列的影响：SDSD序列与起始密码子之间的序列的影响序列与起始密码子之间的序列的影响序列与起始密码子之间的序列的影响序列与起始密码子之间的序列的影响：紧邻紧邻紧邻紧邻AUGAUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌b b b b-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的mRNAmRNA而言，在这个位置上最佳而言，在这个位置上最佳而言，在这个位置上最佳而言，在这个位置上最佳的碱基组合是的碱基组合是的碱基组合是的碱基组合是UAUUAU或或或或CUUCUU，如果用如果用如果用如果用UUCUUC、UCAUCA或或或或AGGAGG取取取取代之，则酶的表达水平低代之，则酶的表达水平低代之，则酶的表达水平低代之，则酶的表达水平低2020倍。倍。倍。倍。SDSD序列下游的碱基若为序列下游的碱基若为序列下游的碱基若为序列下游的碱基若为AAAAAAAA或或或或UUUUUUUU，翻译效率最高；翻译效率最高；翻译效率最高；翻译效率最高；而而而而CCCCCCCC或或或或GGGGGGGG的翻译效率则分别是最高值的的翻译效率则分别是最高值的的翻译效率则分别是最高值的的翻译效率则分别是最高值的50%50%和和和和25%25%。大肠杆菌基因工程20SD序列与起始密码子之间的序列的影响：紧邻AUG的前三个碱基SDSD序列与起始密码子之间的距离的影响序列与起始密码子之间的距离的影响序列与起始密码子之间的距离的影响序列与起始密码子之间的距离的影响：SDSD序列与起始密码子之间的精确距离保证了序列与起始密码子之间的精确距离保证了序列与起始密码子之间的精确距离保证了序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNAmRNA在在在在核糖体上定位后，翻译起始密码子核糖体上定位后，翻译起始密码子核糖体上定位后，翻译起始密码子核糖体上定位后，翻译起始密码子AUGAUG正好处于核糖体正好处于核糖体正好处于核糖体正好处于核糖体复合物结构中的复合物结构中的复合物结构中的复合物结构中的P P位，这是翻译启动的前提条件。位，这是翻译启动的前提条件。位，这是翻译启动的前提条件。位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下在很多情况下在很多情况下在很多情况下,SDSD序列位于序列位于序列位于序列位于AUGAUG之前大约之前大约之前大约之前大约7 7 7 7个碱基处，个碱基处，个碱基处，个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。始效率不同程度的降低。始效率不同程度的降低。始效率不同程度的降低。大肠杆菌基因工程21SD序列与起始密码子之间的距离的影响：SD序列与起始密码子之起始密码子及其后续若干密码子的影响：起始密码子及其后续若干密码子的影响：起始密码子及其后续若干密码子的影响：起始密码子及其后续若干密码子的影响：大肠杆菌中的起始大肠杆菌中的起始大肠杆菌中的起始大肠杆菌中的起始tRNAtRNA分子可以同时识别分子可以同时识别分子可以同时识别分子可以同时识别AUGAUG、GUGGUG和和和和UUGUUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同三种起始密码子，但其识别频率并不相同三种起始密码子，但其识别频率并不相同三种起始密码子，但其识别频率并不相同,通常通常通常通常GUGGUG为为为为AUGAUG的的的的50%50%而而而而UUGUUG只及只及只及只及AUGAUG的的的的25%25%。除此之外，从除此之外，从除此之外，从除此之外，从AUGAUGAUGAUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与至少这一序列不能与至少这一序列不能与至少这一序列不能与mRNAmRNAmRNAmRNA的的的的5 5 5 5 端非编码区形成茎环结构，否端非编码区形成茎环结构，否端非编码区形成茎环结构，否端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰则便会严重干扰则便会严重干扰则便会严重干扰mRNAmRNAmRNAmRNA在核糖体上的准确定位；在核糖体上的准确定位；在核糖体上的准确定位；在核糖体上的准确定位；目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。佳的。佳的。佳的。大肠杆菌基因工程22起始密码子及其后续若干密码子的影响：大肠杆菌中的起始tRNA(四四四四)密码子密码子密码子密码子1.1.生物体对密码子的偏爱性生物体对密码子的偏爱性生物体对密码子的偏爱性生物体对密码子的偏爱性 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。爱性。爱性。爱性。大肠杆菌基因工程23(四)密码子1.生物体对密码子的偏爱性 不同的生物生物基因组中的碱基含量：在富含生物基因组中的碱基含量：在富含生物基因组中的碱基含量：在富含生物基因组中的碱基含量：在富含ATATATAT的生物（如单链的生物（如单链的生物（如单链的生物（如单链DNADNADNADNA噬菌噬菌噬菌噬菌体体体体fX174fX174fX174fX174）基因组中基因组中基因组中基因组中,密码子第三位上的密码子第三位上的密码子第三位上的密码子第三位上的U U U U和和和和A A A A出现的频率较高出现的频率较高出现的频率较高出现的频率较高;而而而而在在在在GCGCGCGC丰富的生物（如链霉菌）基因组中丰富的生物（如链霉菌）基因组中丰富的生物（如链霉菌）基因组中丰富的生物（如链霉菌）基因组中,第三位上含有第三位上含有第三位上含有第三位上含有G G G G或或或或C C C C的简的简的简的简并密码子占并密码子占并密码子占并密码子占90%90%90%90%以上的绝对优势。以上的绝对优势。以上的绝对优势。以上的绝对优势。密码子与反密码子相互作用的自由能：性中等强度规律密码子与反密码子相互作用的自由能：性中等强度规律密码子与反密码子相互作用的自由能：性中等强度规律密码子与反密码子相互作用的自由能：性中等强度规律细胞内细胞内细胞内细胞内tRNAtRNAtRNAtRNA的含量的含量的含量的含量如如如如GGGGGGGGGGGG、CCCCCCCCCCCC、GCGGCGGCGGCG、GGCGGCGGCGGC、AAAAAAAAAAAA、UUUUUUUUUUUU、AUAAUAAUAAUA、UAUUAUUAUUAU等使用少；等使用少；等使用少；等使用少；如如如如GUGGUGGUGGUG、CACCACCACCAC、UCGUCGUCGUCG、AGCAGCAGCAGC、ACAACAACAACA、UGUUGUUGUUGU、AUCAUCAUCAUC、UUGUUGUUGUUG等使用多；等使用多；等使用多；等使用多；v偏爱密码子的决定因素：偏爱密码子的决定因素：大肠杆菌基因工程24生物基因组中的碱基含量：在富含AT的生物（如单链DNA噬菌密2.2.密码子偏爱性对外源基因表达的影响密码子偏爱性对外源基因表达的影响密码子偏爱性对外源基因表达的影响密码子偏爱性对外源基因表达的影响由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。子的正确选择。子的正确选择。子的正确选择。一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：大肠杆菌细胞中获得最佳表达：大肠杆菌细胞中获得最佳表达：大肠杆菌细胞中获得最佳表达：外源基因全合成外源基因全合成外源基因全合成外源基因全合成同步表达相关同步表达相关同步表达相关同步表达相关tRNAtRNA编码基因编码基因编码基因编码基因大肠杆菌基因工程252.密码子偏爱性对外源基因表达的影响由于原核生物和真核生物vv按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法。这种方法。这种方法。这种方法。外源基因全合成外源基因全合成外源基因全合成外源基因全合成大肠杆菌基因工程26按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源外源基因全合成大对于那些含有不和谐密码子、种类单一、出现频率对于那些含有不和谐密码子、种类单一、出现频率对于那些含有不和谐密码子、种类单一、出现频率对于那些含有不和谐密码子、种类单一、出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关相关相关相关tRNAtRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。编码基因同步克隆表达的策略较为有利。编码基因同步克隆表达的策略较为有利。编码基因同步克隆表达的策略较为有利。同步表达相关同步表达相关同步表达相关同步表达相关tRNAtRNA编码基因编码基因编码基因编码基因大肠杆菌基因工程27对于那些含有不和谐密码子、种类单一、出现频率同步表达相关tR为了提高人尿激酶原为了提高人尿激酶原为了提高人尿激酶原为了提高人尿激酶原cDNAcDNA在大肠杆菌中的高效表达，将在大肠杆菌中的高效表达，将在大肠杆菌中的高效表达，将在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个大肠杆菌的这两个大肠杆菌的这两个大肠杆菌的这两个tRNAtRNA编码基因克隆在另一个高效表达的编码基因克隆在另一个高效表达的编码基因克隆在另一个高效表达的编码基因克隆在另一个高效表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体细胞对外源基因高效表达的制约作用。细胞对外源基因高效表达的制约作用。细胞对外源基因高效表达的制约作用。细胞对外源基因高效表达的制约作用。例如，在人尿激酶原例如，在人尿激酶原例如，在人尿激酶原例如，在人尿激酶原cDNAcDNA的的的的412412个密码子中，共含有个密码子中，共含有个密码子中，共含有个密码子中，共含有2222个个个个精氨酸密码子，精氨酸密码子，精氨酸密码子，精氨酸密码子，其中其中其中其中7 7个个个个AGGAGG、2 2个个个个AGAAGA，而大肠杆菌受而大肠杆菌受而大肠杆菌受而大肠杆菌受体细胞中体细胞中体细胞中体细胞中tRNAtRNAAGGAGG和和和和tRNAtRNAAGAAGA的丰度较低。的丰度较低。的丰度较低。的丰度较低。大肠杆菌基因工程28为了提高人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的高效表达，将例如，在（五）质粒拷贝数（五）质粒拷贝数（五）质粒拷贝数（五）质粒拷贝数1.1.质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。代谢最旺盛的阶段。代谢最旺盛的阶段。代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。大肠杆菌基因工程29（五）质粒拷贝数1.质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响目前实验2.2.质粒扩增时序的控制质粒扩增时序的控制质粒扩增时序的控制质粒扩增时序的控制在在在在2828时，每个细胞的质粒拷贝数为时，每个细胞的质粒拷贝数为时，每个细胞的质粒拷贝数为时，每个细胞的质粒拷贝数为6060orioripCP3pCP3P PLLMCSMCSApAprr在在在在4242时，拷贝数迅速增至时，拷贝数迅速增至时，拷贝数迅速增至时，拷贝数迅速增至300-600300-600在此温度下，受体细胞染色体上的在此温度下，受体细胞染色体上的在此温度下，受体细胞染色体上的在此温度下，受体细胞染色体上的CICI基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活。因此，用一种手段同时控制质粒活。因此，用一种手段同时控制质粒活。因此，用一种手段同时控制质粒活。因此，用一种手段同时控制质粒拷贝数和基因的表达拷贝数和基因的表达拷贝数和基因的表达拷贝数和基因的表达pCP3pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子拥有一个温度可诱导型的复制子拥有一个温度可诱导型的复制子拥有一个温度可诱导型的复制子大肠杆菌基因工程302.质粒扩增时序的控制在28时，每个细胞的质粒拷贝数为6三、大肠杆菌基因工程菌的构建策略三、大肠杆菌基因工程菌的构建策略包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建大肠杆菌基因工程31三、大肠杆菌基因工程菌的构建策略包涵体型异源蛋白的表达分泌型（一）包涵体型异源蛋白的表达（一）包涵体型异源蛋白的表达（一）包涵体型异源蛋白的表达（一）包涵体型异源蛋白的表达1.1.包涵体及其性质包涵体及其性质包涵体及其性质包涵体及其性质包涵体包涵体包涵体包涵体(Inclusion BodiesInclusion Bodies，IBIB)：在某些生长条件下，在某些生长条件下，在某些生长条件下，在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露的水不溶集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露的水不溶集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露的水不溶集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露的水不溶性结构。性结构。性结构。性结构。大肠杆菌基因工程32（一）包涵体型异源蛋白的表达1.包涵体及其性质包涵体(In富含蛋白质的包涵体多见于生长在富含蛋白质的包涵体多见于生长在富含蛋白质的包涵体多见于生长在富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物含有氨基酸类似物含有氨基酸类似物含有氨基酸类似物培养基的培养基的培养基的培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或源或源或源或异源蛋白质，异源蛋白质，异源蛋白质，异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。菌细胞内。菌细胞内。菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的除此之外，包涵体中还含有少量的除此之外，包涵体中还含有少量的除此之外，包涵体中还含有少量的DNADNA、RNARNA和脂多糖等非蛋和脂多糖等非蛋和脂多糖等非蛋和脂多糖等非蛋白分子。白分子。白分子。白分子。大肠杆菌基因工程33富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的由高效2.2.以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点包涵体表达形式的优点：包涵体表达形式的优点：包涵体表达形式的优点：包涵体表达形式的优点：包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来。白从细菌裂解物中分离出来。白从细菌裂解物中分离出来。白从细菌裂解物中分离出来。在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁。源重组蛋白的稳定性已构不成威胁。源重组蛋白的稳定性已构不成威胁。源重组蛋白的稳定性已构不成威胁。能简化外源基因表达产物的分离操作能简化外源基因表达产物的分离操作能简化外源基因表达产物的分离操作能简化外源基因表达产物的分离操作 能在一定程度上保持表达产物的结构稳定能在一定程度上保持表达产物的结构稳定能在一定程度上保持表达产物的结构稳定能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 大肠杆菌基因工程342.以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点包涵体表达形式的优点：包涵体表达形式的缺点：包涵体表达形式的缺点：包涵体表达形式的缺点：包涵体表达形式的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白以包涵体形式表达的重组蛋白以包涵体形式表达的重组蛋白以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，丧失了原有的生物活性，丧失了原有的生物活性，丧失了原有的生物活性，必必必必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。作的效率对目标产物的收率至关重要。作的效率对目标产物的收率至关重要。作的效率对目标产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题然而，这也是一个技术难题然而，这也是一个技术难题然而，这也是一个技术难题,尤其当目标蛋白分子中的尤其当目标蛋白分子中的尤其当目标蛋白分子中的尤其当目标蛋白分子中的CysCys残基数目较高时残基数目较高时残基数目较高时残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过超过超过超过30%30%。大肠杆菌基因工程35包涵体表达形式的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的3.3.以包涵体形式表达目的蛋白的操作以包涵体形式表达目的蛋白的操作以包涵体形式表达目的蛋白的操作以包涵体形式表达目的蛋白的操作如果未进行特殊设计如果未进行特殊设计如果未进行特殊设计如果未进行特殊设计(如分泌型表达或融合型表达如分泌型表达或融合型表达如分泌型表达或融合型表达如分泌型表达或融合型表达),),),),外外外外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%20%20%20%以以以以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长处所在。处所在。处所在。处所在。大肠杆菌基因工程363.以包涵体形式表达目的蛋白的操作如果未进行特殊设计(如分4.4.包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作CC 共价修饰的蛋白质共价修饰的蛋白质共价修饰的蛋白质共价修饰的蛋白质1 1）蛋白质变性复性的动力学原理：）蛋白质变性复性的动力学原理：）蛋白质变性复性的动力学原理：）蛋白质变性复性的动力学原理：CC11CC22CCnnCCUUI I 11I I nnNNXX11X2X2XnXnXXAgAgAgAgAgAgAgAgII 有效变复性过程中的中间状态有效变复性过程中的中间状态有效变复性过程中的中间状态有效变复性过程中的中间状态XX 脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态NN 天然状态的蛋白质天然状态的蛋白质天然状态的蛋白质天然状态的蛋白质UU 变性状态的蛋白质变性状态的蛋白质变性状态的蛋白质变性状态的蛋白质A A 集聚状态的蛋白质集聚状态的蛋白质集聚状态的蛋白质集聚状态的蛋白质vv在细菌细胞内，集聚状态和在细菌细胞内，集聚状态和在细菌细胞内，集聚状态和在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的共价修饰的共价修饰的共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为无活性的蛋白质。无活性的蛋白质。无活性的蛋白质。无活性的