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概念：概念：免疫组织化学免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)是是利用抗原抗体反应和组织化学呈色反应来检测组织利用抗原抗体反应和组织化学呈色反应来检测组织和细胞中某种化学成分的一门技术和细胞中某种化学成分的一门技术,是传统的免疫学是传统的免疫学和组织化学相结合而发展起来的一门新兴学科，也和组织化学相结合而发展起来的一门新兴学科，也叫原位免疫学（叫原位免疫学（In situ immunology）。）。特点或优点：特点或优点：（1）特异性强、灵敏度高；）特异性强、灵敏度高；（2）可定性、定位、定量观察；）可定性、定位、定量观察；（3）将形态学改变与功能和代谢变化结）将形态学改变与功能和代谢变化结 合起来；合起来；免疫组化概述免疫组化概述免疫组化概述1 IHC不仅具有传统形态学（包括不仅具有传统形态学（包括LM和和EM水平）水平）能对组织和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别能对组织和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别是经苏木精或伊红复染后），而且还克服了传统免是经苏木精或伊红复染后），而且还克服了传统免疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能定位的缺点。定位的缺点。IHC则可在原位和固相对染色结果进则可在原位和固相对染色结果进行观察。目前行观察。目前IHC的定位可精确到亚微结构水平。的定位可精确到亚微结构水平。随着随着IHC技术的发展和图象分析技术的发展，技术的发展和图象分析技术的发展，IHC已进入多标记（双标记）和定量研究的阶段，已进入多标记（双标记）和定量研究的阶段，使使IHC在生物学和医学各领域的应用日益广泛，不在生物学和医学各领域的应用日益广泛，不仅用于研究，也用于诊断。仅用于研究，也用于诊断。IHC与核酸分子杂交相与核酸分子杂交相结合形成的原位杂交技术（结合形成的原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）既特异性强、灵敏，又具定位、可视的特点。既特异性强、灵敏，又具定位、可视的特点。IHC不仅具有传统形态学（包括LM和EM水平2 IHC技术源于免疫荧光术（技术源于免疫荧光术（immunofluorescence,IF），从），从1941年年1950年年Coons等用了等用了10年首创了年首创了 荧光素标记抗体技术荧光素标记抗体技术检测肺组织内的肺炎双检测肺组织内的肺炎双 球菌球菌，六、七十年代，六、七十年代IF在科研中占据着主导地位在科研中占据着主导地位1968 年中根一穗（年中根一穗（Nakane）等创建了）等创建了酶标抗体技酶标抗体技 术术（immunoperoxidase，IPO）铁蛋白标记铁蛋白标记 Ab Ab技术技术;1974年年Stemberger Stemberger 改良上述技术，建立改良上述技术，建立辣根过氧辣根过氧 化物酶抗体过氧化物酶化物酶抗体过氧化物酶（PAPPAP）技术，使免疫）技术，使免疫 细胞化学得到广泛应用细胞化学得到广泛应用；一、一、IHCIHC的发展简史的发展简史一、IHC的发展简史380年代年代Hsu等建立了等建立了ABCABC法法之后，免疫金之后，免疫金银染色银染色 法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。9090年代年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细 胞化学分类方法迅速发展；胞化学分类方法迅速发展；20002000年年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组 化技术成为当今生物医学中形态、功化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合能代谢综合 研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个 学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技 术之一；术之一；国内起步晚，从国内起步晚，从70s开始。开始。80年代Hsu等建立了ABC法之后，免疫金银染色4（一）方法学（一）方法学1.从传统的抗原、抗体反应（免疫反应）从传统的抗原、抗体反应（免疫反应）亲和反应。新的亲和亲和反应。新的亲和物质对有：物质对有：生物素与卵白素生物素与卵白素（biotin&avidin)，葡萄球菌，葡萄球菌A蛋蛋白（白（SPA）与）与IgG，凝集素与受体，激素与受体。这些亲和对，凝集素与受体，激素与受体。这些亲和对亲和力强，且可与多种标记物（荧光素、酶、同位素、胶体亲和力强，且可与多种标记物（荧光素、酶、同位素、胶体金、铁蛋白等）结合，由此产生了亲和组织化学（金、铁蛋白等）结合，由此产生了亲和组织化学（affinity histochemistry），），这些方法这些方法特异性、敏感性、稳定性高，更特异性、敏感性、稳定性高，更方便、适于某些特殊观察（如方便、适于某些特殊观察（如EM）。）。2.从单一显示某种物质（单标记）从单一显示某种物质（单标记）显示多种物质（双标记）。显示多种物质（双标记）。3.从从LMEM（超微结构）：免疫电镜、胶体金法、金银法。（超微结构）：免疫电镜、胶体金法、金银法。4.从定性从定性定量，图象分析（定量，图象分析（IA）、流式细胞术（）、流式细胞术（FCM）。）。5.IHC与与ISH相结合，可在不同水平检测相结合，可在不同水平检测DNA、mRNA、protein。6.原位原位PCR+IHC可在组织原位通过扩增检测微量目的可在组织原位通过扩增检测微量目的DNA。7.趋于标准化、自动化。趋于标准化、自动化。二、二、IHCIHC的现状和发展前景的现状和发展前景二、IHC的现状和发展前景5（二）技术分类（二）技术分类 1.根据染色方式分成：根据染色方式分成：贴片染色贴片染色 漂浮染色漂浮染色 2.根据根据Ag-Ab结合方式分成：结合方式分成：直接法直接法 间接法间接法 多层法多层法 3.按标记物的性质分成：按标记物的性质分成：免疫荧光技术（免疫荧光法）免疫荧光技术（免疫荧光法）免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、法、ABC法）法）免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色 法、蛋白法、蛋白A金法）金法）（二）技术分类6（三）标记物（三）标记物 1.必要性：组织细胞内必要性：组织细胞内Ag-Ab结合反应一般是不可结合反应一般是不可 见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。2.常用标记物常用标记物 荧光素荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）-荧光显荧光显 微镜下呈绿色荧光微镜下呈绿色荧光;四乙基罗达明（四乙基罗达明（rhodamine RB200）-荧光显微镜下发橙红色荧光荧光显微镜下发橙红色荧光 酶酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。生物素生物素：（：（Biotin）铁蛋白金铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。等：主要应用于免疫电镜。其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）（三）标记物7（四四）IHC的应用的应用1.只要是形态科学均可采用只要是形态科学均可采用:包括病理学、神经科学、包括病理学、神经科学、生物学、病原微生物的检测（病毒、细菌、寄生虫生物学、病原微生物的检测（病毒、细菌、寄生虫等）、皮肤病学、器官移植等。等）、皮肤病学、器官移植等。2.可用于多种材料：可用于多种材料：A.各种组织（冰冻组织、各种组织（冰冻组织、formalin固定组织、石蜡包埋组织兼可）；固定组织、石蜡包埋组织兼可）；B.各种细胞各种细胞(穿刺、穿刺、体液、涂片、血细胞、培养细胞等）。体液、涂片、血细胞、培养细胞等）。3.用于诊断：肿瘤病理学等（大中医院）。用于诊断：肿瘤病理学等（大中医院）。4.用于科研：临床和基础医学，尤其是形态学专业研用于科研：临床和基础医学，尤其是形态学专业研究生常用究生常用IHC，或或IHC+分生技术分生技术；最近几年，分子最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来，生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来，用免疫组织化学方法对所研究的大分子进行定位，用免疫组织化学方法对所研究的大分子进行定位，进而深入研究其功能。进而深入研究其功能。（四）IHC的应用8（一）标本的收集与处理（一）标本的收集与处理 IHC染色成功与否及其质量如何，除染色方法本染色成功与否及其质量如何，除染色方法本身外，对材料的处理也至关重要，它包括：取材、身外，对材料的处理也至关重要，它包括：取材、固定、脱水、包埋、切片等。固定、脱水、包埋、切片等。目的：保存好目的：保存好Ag的数的数量及活性、保持组织细胞的良好形态结构。量及活性、保持组织细胞的良好形态结构。材料的材料的来源：人体及实验动物；细胞和组织；新鲜的及固来源：人体及实验动物；细胞和组织；新鲜的及固定的。定的。1、组织标本的取材与储存、组织标本的取材与储存 来源：活检取材、手术切除、实验动物组织等。来源：活检取材、手术切除、实验动物组织等。要求：要快、要小（要求：要快、要小（110.4cm），避免挤压。），避免挤压。处理：冰冻处理：冰冻即用或保存；固定即用或保存；固定即用或保存。即用或保存。三、样品的准备、处理三、样品的准备、处理三、样品的准备、处理9 2、细胞标本的取材与储存、细胞标本的取材与储存来源：血细胞、穿刺细胞、体液细胞等。来源：血细胞、穿刺细胞、体液细胞等。处理：细胞多时直接涂片、干燥、固定、染色；处理：细胞多时直接涂片、干燥、固定、染色；细胞少需离心沉淀、涂片、干燥、固定、染色；细胞少需离心沉淀、涂片、干燥、固定、染色；对于体外培养细胞：对于体外培养细胞：贴壁生长贴壁生长细胞（内皮细胞（内皮C、纤、纤维维C、神经、神经C等）在培养皿底置载玻片；等）在培养皿底置载玻片；悬浮生长悬浮生长细胞细胞需离心沉淀，再涂片、固定，即用或冰冻保存。需离心沉淀，再涂片、固定，即用或冰冻保存。2、细胞标本的取材与储存10 （二）固定（二）固定（fixation）1、固定的含义、固定的含义 固定是指以某种化学物质使蛋白质、酶类（变性）固定是指以某种化学物质使蛋白质、酶类（变性）、脂质、糖类等物质保持在组织细胞原位，避免、脂质、糖类等物质保持在组织细胞原位，避免Ag溶解、扩散、丢失；保持组织细胞的正常形态结构。溶解、扩散、丢失；保持组织细胞的正常形态结构。根据根据Ag对固定剂的耐受性，可将其分为：对固定剂的耐受性，可将其分为：不稳不稳定定Ag（如细胞表面（如细胞表面Ag，不耐甲醛，宜用丙酮）、，不耐甲醛，宜用丙酮）、半半稳定稳定Ag及稳定及稳定Ag，后二者多为蛋白、肽类、酶类物，后二者多为蛋白、肽类、酶类物质。质。固定有时间性，太短达不到固定目的，太长交联固定有时间性，太短达不到固定目的，太长交联过度，封闭过度，封闭Ag。（二）固定（fixation）11 2、常用固定剂及其用途、常用固定剂及其用途1.10%的的formalin（4%的甲醛的甲醛formaldehyde）：以）：以pH7.4的的PBS配制，配制，优点优点：穿透力强、固定快、组织收缩小；：穿透力强、固定快、组织收缩小；适于适于固定蛋固定蛋白、肽类、酶、糖。白、肽类、酶、糖。IHC常用常用4%多聚甲醛多聚甲醛polyformaldehyde灌注固定及后固定，灌注固定及后固定，时间时间46 h。2.2.5%的戊二醛，同上。也可用的戊二醛，同上。也可用2%戊二醛与戊二醛与2%多聚甲醛混合多聚甲醛混合液固定，尤对液固定，尤对超微结构超微结构保存好。醛类固定剂的缺点是易封闭保存好。醛类固定剂的缺点是易封闭抗原，必要时需抗原修复。抗原，必要时需抗原修复。3.70%的酒精（乙醇），的酒精（乙醇），优点优点：固定蛋白好，：固定蛋白好，缺点缺点：组织收缩：组织收缩严重；严重；时间时间：2h。4.70%丙酮，丙酮，优点优点：渗透快；：渗透快；缺点缺点：对形态保存不好；：对形态保存不好；用于用于对对冰冻切片和细胞涂片的固定；冰冻切片和细胞涂片的固定；时间时间：10min。5.混合固定液：混合固定液：Bouin液：液：40%PF250ml、冰醋酸、冰醋酸50ml、饱和苦、饱和苦味酸味酸250ml；还有；还有PLP固定液，较适合免疫组化。固定液，较适合免疫组化。6.四氧化锇（四氧化锇（OsO4 锇酸）：常用锇酸）：常用PBS配制配制1%锇酸溶液后固定锇酸溶液后固定1h，用于免疫组化及电镜观察。，用于免疫组化及电镜观察。有强烈刺激，需在通风橱内操有强烈刺激，需在通风橱内操作作。2、常用固定剂及其用途12（三）（三）组织的脱水、浸蜡、包埋和切片组织的脱水、浸蜡、包埋和切片 前三步只用于石蜡切片，冰冻切片和振动切片前三步只用于石蜡切片，冰冻切片和振动切片不需此步骤。不需此步骤。切片可分为：切片可分为：石蜡切片石蜡切片：脱水、透明、浸蜡、包埋、切片：脱水、透明、浸蜡、包埋、切片57m；冰冻切片冰冻切片：浸糖，：浸糖，20%30%蔗糖蔗糖4oC过夜，减少冰过夜，减少冰 晶；晶；OCT包埋；液氮速冻，减轻组织破包埋；液氮速冻，减轻组织破 坏。病理切片要薄，坏。病理切片要薄，57 m；脑片通常；脑片通常 3050 m厚。厚。振动切片振动切片：不需做任何包埋，固定后的组织可直接：不需做任何包埋，固定后的组织可直接 用振动切片机做各种厚度的切片，并在用振动切片机做各种厚度的切片，并在 染色后可进一步制作电镜标本观察。染色后可进一步制作电镜标本观察。（三）组织的脱水、浸蜡、包埋和切片13 （四）防脱片剂（四）防脱片剂 （1）蛋白甘油，蛋清与甘油蛋白甘油，蛋清与甘油1：1搅拌、过滤、防腐；搅拌、过滤、防腐；（2）1%的铬矾明胶涂片；的铬矾明胶涂片；（3）0.1%的多聚赖氨酸涂片，晾干备用。的多聚赖氨酸涂片，晾干备用。配制时用塑料配制时用塑料 瓶而不能用玻璃瓶瓶而不能用玻璃瓶；（4）购买商品化的进口购买商品化的进口硅化玻片硅化玻片；（5）APES（氨丙基三乙氧基硅烷），（氨丙基三乙氧基硅烷），1：50丙酮稀释，丙酮稀释，浸片浸片2030秒，晾干备用；秒，晾干备用；贴片时要一步到位。贴片时要一步到位。（四）防脱片剂14（五）抗原修复（五）抗原修复 近年兴起的新技术。目的：近年兴起的新技术。目的：暴露被交联封闭的暴露被交联封闭的Ag。主要适用于经长期主要适用于经长期formalin固定的标本、石蜡包埋标固定的标本、石蜡包埋标本；也可用于冰冻切片。常用的方法有：本；也可用于冰冻切片。常用的方法有：（1）微波加热微波加热 切片煮沸切片煮沸1020min，室温自然冷却，室温自然冷却，所用溶液有：所用溶液有：饱和饱和NaCL溶液；溶液；10mMpH 6.0的的枸橼酸钠缓冲液；枸橼酸钠缓冲液；4M的尿素等；的尿素等；pH8.0TBS;（2）高压锅处理）高压锅处理 将切片放入将切片放入10mM、pH 6.0的枸橼酸的枸橼酸钠缓冲液容器中，置锅内加盖喷气钠缓冲液容器中，置锅内加盖喷气310min，自然冷，自然冷却。却。（3）酶消化处理）酶消化处理：常用：常用0.1%的胰蛋白酶（含的胰蛋白酶（含0.1%CaCL2，pH 7.8）37。C 10min。或。或0.4%胃蛋白胃蛋白酶酶37。C 30min;（五）抗原修复15（一）基本染色方法（一）基本染色方法 荧光素标记抗体：荧光素标记抗体：FITC、直接法直接法 TRITC等等标记抗体法标记抗体法 酶标记抗体：酶标记抗体：HRP、AP等等 荧光素标记抗体荧光素标记抗体 间接法间接法 酶标记抗体（三步法）酶标记抗体（三步法）非标记抗体法：非标记抗体法：酶桥法、酶桥法、PAP法法、APAAP法法;亲和组化法：亲和组化法：ABC法法、LAB法、法、LsAB法、法、BRAB法法;双重标记：双重标记：阻断法（酸洗阻断法（酸洗抗）、非阻断法（连续染）抗）、非阻断法（连续染）四、四、免疫组织化学技术免疫组织化学技术四、免疫组织化学技术161直接法直接法 荧光素直接标记特异性抗体（一抗）上，标记抗荧光素直接标记特异性抗体（一抗）上，标记抗体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察检测抗原。检测抗原。优点优点：简单，时间短，：简单，时间短，特异性强。特异性强。缺点缺点：灵敏度低，所：灵敏度低，所 需抗体量大需抗体量大 （不经济）。（不经济）。应用应用：基本不用了！：基本不用了！1直接法优点：简单，时间短，172间接法间接法 荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体）。抗体）。显色后镜检显色后镜检 特点：特点：1 1、敏感性较直接法高、敏感性较直接法高3-43-4倍，但倍，但特异性较低特异性较低；2 2、不必标记每种一抗，只需标记某一种动物的二抗；、不必标记每种一抗，只需标记某一种动物的二抗；3 3、一抗可高度稀释，节省一抗，且可用、一抗可高度稀释，节省一抗，且可用PBSPBS代替一抗做空白对照。代替一抗做空白对照。2间接法 荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动183非标记非标记Ab桥法：桥法：“桥法桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，其二抗为未标记桥抗体。是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，其二抗为未标记桥抗体。（1）单桥法）单桥法3非标记Ab桥法：19(2)双桥法双桥法 在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，可增大染色强度。可增大染色强度。特别提示：注意动物种属关系特别提示：注意动物种属关系 特点：特点：敏感性高，但酶浓度不好掌握；与组织非敏感性高，但酶浓度不好掌握；与组织非特异性结合的酶不易洗去，背景染色重特异性结合的酶不易洗去，背景染色重。(2)双桥法204 4过氧化物酶过氧化物酶抗过氧化物酶法（抗过氧化物酶法（Peroxidase anti-Peroxidase anti-peroxidase method peroxidase method，简称，简称PAPPAP法）法）是桥法的改良，用第二抗体作是桥法的改良，用第二抗体作“桥梁桥梁”，先与第一抗体结合，先与第一抗体结合，再与再与PAPPAP复合物联结，形成复合物联结，形成抗原抗原抗体抗体抗抗IgGIgG抗体抗体PAPPAP复合物复合物，最后用底物显色剂显色。，最后用底物显色剂显色。特点：特点：灵敏度高，比间接荧光法敏感灵敏度高，比间接荧光法敏感2020倍，比间接酶标记抗体法倍，比间接酶标记抗体法敏感敏感100100倍倍4过氧化物酶抗过氧化物酶法（Peroxidase an21 5亲和素亲和素-生物素生物素-过氧化物酶复合物法（过氧化物酶复合物法（avidin-biotin-peroxidase complex technique，简称，简称ABC法）。法）。关键的程序步骤为关键的程序步骤为3步：步：Ag+Ab1+（Ab2-B）+ABC 复合物复合物 （Ab2-B 为生物素标记的第二抗体）为生物素标记的第二抗体）（B 为生物素标记的过氧化物酶）为生物素标记的过氧化物酶）ABC复合物是复合物是avidin与酶联与酶联biotin 在使用前在使用前30min配置，混匀。配置，混匀。1个个avidin分子结合了分子结合了3个个biotin分子，剩下分子，剩下1个结合点与个结合点与2抗的生物素结合，抗的生物素结合，avidin起桥联作用。起桥联作用。5亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法（avidi22（1）ABC复合物的制备：复合物的制备：（2）ABC法反应原理：法反应原理：特点：特点：ABC法敏感性更高，比法敏感性更高，比PAP法敏感法敏感2040倍，背景倍，背景也更清晰。也更清晰。（1）ABC复合物的制备：（2）ABC法反应原理：特点：AB23ABC法示意图法示意图ABC法示意图24染色结果观察（染色结果观察（BrdU）染色结果观察（BrdU）25 6、酶标亲和素、酶标亲和素-生物素技术（生物素技术（labelled avidin-biotin technique，简称简称LAB法）。法）。即用辣根过氧化物酶直接标记即用辣根过氧化物酶直接标记avidin，用，用biotin标记标记2抗。抗。关键步骤为关键步骤为3步：步：Ag+Ab1+（Ab2-B）+A （A为为HRP标记的卵白素）标记的卵白素）A与与2抗的生物素结合，抗的生物素结合，avidin起桥联作用。起桥联作用。如将该法中的如将该法中的卵白素卵白素（avidin）变换成）变换成链霉卵白素链霉卵白素(streptavidin)，LAB法即成法即成LsAB法，或称法，或称SP法法。据认为据认为LAB法比法比ABC法敏感法敏感24倍，而倍，而LsAB法因法因链霉卵白素链霉卵白素不与组织细胞中内源性生物素结不与组织细胞中内源性生物素结合而特异性更高。现在合而特异性更高。现在SP法已趋于取代法已趋于取代ABC法而广为应用。法而广为应用。6、酶标亲和素-生物素技术（labelle26生物素化生物素化抗抗AB复合物复合物酶标链卵白素酶标链卵白素AvidinBiotinPeroxidase抗抗组织抗原组织抗原ABC法（法（3步完成）步完成）LsAB（SP）法（）法（3步完成）步完成）AB复合物酶标链卵白素AvidinBiotinPeroxid27链霉卵白素链霉卵白素酶酶生物素生物素底物底物抗原抗原SP法示意图法示意图链霉卵白素酶生物素底物抗原SP法示意图28（二）免疫组化染色步骤（以（二）免疫组化染色步骤（以ABCABC法为例）法为例）1)、切片常规脱蜡至水：切片常规脱蜡至水：二甲苯虽然可以反复使用，但次数二甲苯虽然可以反复使用，但次数不宜多。乙醇的浓度是从高到低，与脱水时相反。不宜多。乙醇的浓度是从高到低，与脱水时相反。2)、灭活内源性酶：灭活内源性酶：博士德推荐应用博士德推荐应用3%的双氧水，但实际操的双氧水，但实际操作中，使用作中，使用30%双氧水和纯甲醇按双氧水和纯甲醇按1:9的溶剂比混合较为理想。的溶剂比混合较为理想。3)、抗原修复：抗原修复：暴露被交联封闭的暴露被交联封闭的Ag。4)、正常山羊血清封闭：正常山羊血清封闭：封闭时应该注意室温与时间的相对封闭时应该注意室温与时间的相对关系。室温低，时间就要长一些，反之亦然。另外，保持反关系。室温低，时间就要长一些，反之亦然。另外，保持反应池湿润是重要的一环，否则，前功尽弃。后面的步骤也是应池湿润是重要的一环，否则，前功尽弃。后面的步骤也是如此。如此。5)、一抗反应：一抗反应：一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度与背景有直接关系。一般说来，阳性染色强度不够时，可提与背景有直接关系。一般说来，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时则相反。高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时则相反。孵育时间与温度：抗原抗体充分反应是得到可靠结果的关孵育时间与温度：抗原抗体充分反应是得到可靠结果的关键。因此，控制温度与时间也是一个严肃的问题。由于室温键。因此，控制温度与时间也是一个严肃的问题。由于室温控制较为困难，控制较为困难，建议建议4冰箱过夜（冰箱过夜（18h）。）。（二）免疫组化染色步骤（以ABC法为例）1)、切片常规脱296)、二抗（生物素化二抗（生物素化IgG）反应：）反应：建议湿盒内建议湿盒内 37OC1h，另外仪，另外仪器显示温度器显示温度37，但实际只有，但实际只有23，自然结果难以令人满意。，自然结果难以令人满意。7)、SABC染色（染色（37）：）：这是博士德的人性化之处，直接就这是博士德的人性化之处，直接就可以用。可以用。8)、DAB显色镜下控时：显色镜下控时：DAB浓度应该比推荐的要低一些，这浓度应该比推荐的要低一些，这样可以便于控制反应时间以及在合适的时候中止反应。同时注样可以便于控制反应时间以及在合适的时候中止反应。同时注意，使用后残余的意，使用后残余的DAB应应妥善处理妥善处理，而不是随便倒入下水道，而不是随便倒入下水道，因为它有致癌性。因为它有致癌性。9)、苏木素轻度复染：苏木素轻度复染：不建议使用。尽管复染后标本层次分明，不建议使用。尽管复染后标本层次分明，但实际情况是，这样有时也会掩盖阳性结果，从而使前功尽弃。但实际情况是，这样有时也会掩盖阳性结果，从而使前功尽弃。10)、脱水透明：脱水透明：脱水乙醇的浓度由低到高，有一个较准确判断脱水乙醇的浓度由低到高，有一个较准确判断脱水成功与否的办法是：观察透明后盛二甲苯容器的壁，若发脱水成功与否的办法是：观察透明后盛二甲苯容器的壁，若发现白色雾状现象，则说明脱水不成功，应再次脱水。透明时间现白色雾状现象，则说明脱水不成功，应再次脱水。透明时间不要太长，不要太长，1分钟左右就可以了。分钟左右就可以了。11)、封片：封片：封片时，中性树脂量宜少，同时注意不要产生气泡。封片时，中性树脂量宜少，同时注意不要产生气泡。6)、二抗（生物素化IgG）反应：建议湿盒内 37OC1h，30（三）免疫组化染色基本技术及注意事项（三）免疫组化染色基本技术及注意事项1实验计划实验计划根据课题的内容选用动物，选用配套的根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。如。如Ab-I鼠鼠抗人的抗体，与其他种属间无交叉，则不能用其他动抗人的抗体，与其他种属间无交叉，则不能用其他动物，而且物，而且Ab-必须是羊抗鼠，若必须是羊抗鼠，若 PAP法法Ab-必须来必须来源于鼠，否则不能连接成复合物源于鼠，否则不能连接成复合物 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差 异，在贴异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否则无可比性。片方面最好贴于同一张载片上，否则无可比性。选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。（三）免疫组化染色基本技术及注意事项312Ab稀释度稀释度 （如系购买的药盒有工作液和原液）（如系购买的药盒有工作液和原液）（1）工作液：无须稀释）工作液：无须稀释（2）原液：）原液：应参照其提供的工作液浓度进行预试验应参照其提供的工作液浓度进行预试验原液的保存（原液的保存（-20）冻存）冻存应选最佳稀度冻存。应选最佳稀度冻存。若工作浓度若工作浓度大于大于1 500则要先将原液稀释十倍则要先将原液稀释十倍，而，而 后分装后分装10l/瓶瓶冻存（冻存（-20）于）于 冰箱备用。冰箱备用。（3）Ab浓度的选择浓度的选择 Ab浓度不可太高或太低，因为浓度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定结合需在一定浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少；浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少；极过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。极过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。并非并非Ab浓度越高越好。浓度越高越好。2Ab稀释度 （如系购买的药盒有工作液和原液）323Ab滴片技术滴片技术 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。注意注意滴抗体前需把切片上的水弄干，但不滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。能干片。要领：甩净组织周围的水。要领：甩净组织周围的水。3Ab滴片技术334Ab孵育技术孵育技术（1）必须在）必须在湿盒内湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。进行，以防抗体的蒸发和干片。（2）温度与时间）温度与时间 4过夜（过夜（16h）37 1 h or 参考说明书参考说明书5光镜控制显色方法光镜控制显色方法（1）室内操作：注意温度与时间的关系，室温）室内操作：注意温度与时间的关系，室温 最宜最宜5分钟。分钟。（2）染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可）染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可 加深。加深。4Ab孵育技术34 染色失败的几种原因：染色失败的几种原因：（1）所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性）所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性 对照在内。全部（）原因可能：对照在内。全部（）原因可能：染色未完全严格按照操作步骤进行；染色未完全严格按照操作步骤进行；漏加一种抗体，或抗体失效；漏加一种抗体，或抗体失效；缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性；缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性；底物中所加底物中所加H2O2 量少或失效；量少或失效；复染或脱水剂使用不当复染或脱水剂使用不当 染色失败的几种原因：35（2）所有切片均呈阳性反应，原因可能是：）所有切片均呈阳性反应，原因可能是：切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了。切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了。缓冲液配置中未加氯化钠和缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确，值不准确，洗涤不彻底。洗涤不彻底。使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应 时间过长。时间过长。抗体温育的时间过长。抗体温育的时间过长。H2O2 浓度过高，呈色速度过快。粘附剂太浓度过高，呈色速度过快。粘附剂太 厚。厚。（2）所有切片均呈阳性反应，原因可能是：36（3）所有切片背景过深，原因可能是：所有切片背景过深，原因可能是：未加酶消化处理切片。未加酶消化处理切片。切片或涂片过厚。切片或涂片过厚。漂洗不够。漂洗不够。底物呈色反应过久。底物呈色反应过久。蛋白质封闭不够或所用血清溶血。蛋白质封闭不够或所用血清溶血。使用全血清抗体稀释不够。使用全血清抗体稀释不够。（4）阳阳性性对对照照染染色色良良好好，检检测测的的阳阳性性标标本本呈呈阴性反应。阴性反应。最常见的原因是：标本的固定和处理不当。最常见的原因是：标本的固定和处理不当。（3）所有切片背景过深，原因可能是：37谢谢聆听！谢谢聆听！谢谢聆听！38
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