乙型肝炎病毒cccDNA培训ppt课件

乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒cccDNAcccDNA乙型肝炎病毒cccDNA1一、几个相关问题简介一、几个相关问题简介乙型肝炎病毒cccDNA2一、几个相关问题简介乙型肝炎病毒cccDNA2什么是什么是HBV cccDNA?HBV cccDNA?即即 共共 价价 闭 合合 环 状状 DNADNA（covalentlycovalentlyclosedclosedcircularcircularDNA)DNA)。乙乙肝肝病病毒毒感感染染宿宿主主细胞胞后后在在细胞胞内内复复制制并并建建立立感感染染状状态，病病毒毒松松弛弛环状状DNADNA（rcDNArcDNA）进入入细胞胞核核，利利用用宿宿主主DNADNA聚聚合合酶和和拓拓扑扑酶等等“修修复复”形形成的、成的、结构完整的、超螺旋双构完整的、超螺旋双链DNADNA分子。分子。乙型肝炎病毒cccDNA3什么是HBV cccDNA?即共价闭合环状DNA乙型肝炎病毒基因组结构示意图乙型肝炎病毒基因组结构示意图乙型肝炎病毒cccDNA4乙型肝炎病毒基因组结构示意图乙型肝炎病毒cccDNA4乙型肝炎病毒的复制过程乙型肝炎病毒的复制过程乙型肝炎病毒cccDNA5乙型肝炎病毒的复制过程乙型肝炎病毒cccDNA5我们为什么要关注我们为什么要关注HBV cccDNA?HBV cccDNA?cccDNAcccDNA存存在在于于细胞胞核核内内，成成为乙乙肝肝病病毒毒的的复复制制“池池”目前尚没有可以目前尚没有可以进入入细胞核内，并能胞核内，并能够清除清除cccDNAcccDNA 的的药物，物，这也是也是现有抗病毒有抗病毒药物治物治疗效果不佳和治效果不佳和治 疗后容易复后容易复发的原因之一的原因之一 肝肝脏以外器官以外器官组织细胞可能存在胞可能存在cccDNAcccDNA，成，成为肝肝脏 移植移植术后乙肝复后乙肝复发的来源的来源 还没有没有稳定、可靠、敏感的定、可靠、敏感的cccDNAcccDNA检测试剂盒盒问世世乙型肝炎病毒cccDNA6我们为什么要关注HBV cccDNA?cccDNA存在于为什么没有为什么没有cccDNAcccDNA检测试剂盒问世检测试剂盒问世?研究和开研究和开发该检测技技术的的时间不不长 检测技技术上的上的难度度较大大 前期研究主要集中于前期研究主要集中于细胞模型和胞模型和动物肝物肝脏模，不能模，不能满足足临床床检验的需求的需求 现有技有技术灵敏度不高，灵敏度不高，检测低限低限101044copycopy/ml/ml左右左右 分研究机构和学者分研究机构和学者对检测技技术的特异性的特异性认识不足，存在缺陷不足，存在缺陷乙型肝炎病毒cccDNA7为什么没有cccDNA检测试剂盒问世?研究和开发该检测技术 多种同源的乙肝病毒多种同源的乙肝病毒DNADNA分子并存分子并存(cccDNA(cccDNA、rcDNArcDNA、ssDNAssDNA、整合的、整合的HBVDNAHBVDNA），必），必须有有效地分离效地分离cccDNAcccDNA和其他和其他类型的病毒型的病毒DNADNA 如何如何进一步解决特异性的一步解决特异性的问题？如何解决灵敏度不高的如何解决灵敏度不高的问题（细胞内胞内cccDNAcccDNA含量的含量的较低），血清中含量？低），血清中含量？如何如何简化化检测步步骤？建立建立cccDNAcccDNA检测技术必须克服的难点检测技术必须克服的难点乙型肝炎病毒cccDNA8多种同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、建立ccccccDNAcccDNArcDNArcDNA核酸一核酸一级结构构完整的双完整的双链两条两条链均不完整均不完整核酸空核酸空间结构构闭合合环状，超螺旋状，超螺旋松弛松弛环状，非超螺旋状，非超螺旋是否与蛋白是否与蛋白质结合合不不结合合共价共价结合合对某些核酸某些核酸酶抗性抗性强，不容易被降解，不容易被降解弱，容易被降解弱，容易被降解分离分离cccDNAcccDNA和和rcDNArcDNA的分子基础的分子基础分离分离cccDNAcccDNA和和rcDNArcDNA的任何手段均基于上述差异的任何手段均基于上述差异乙型肝炎病毒cccDNA9cccDNArcDNA核酸一级结构完整的双链两条链均不完整核二、二、HBV cccDNA检测技术检测技术乙型肝炎病毒cccDNA10二、HBV cccDNA检测技术乙型肝炎病毒cccDNA101.1.选择性性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光光PCR)PCR)2.2.侵入者探侵入者探针法（法（InvaderassaayInvaderassaay）3.3.嵌合引物嵌合引物荧光光PCRPCR法法现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介乙型肝炎病毒cccDNA111.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)现有的现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介 选择性性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光光PCR)PCR)2.2.侵入者探侵入者探针法（法（InvaderassaayInvaderassaay）3.3.嵌合引物嵌合引物荧光光PCRPCR法法乙型肝炎病毒cccDNA12现有的几种cccDNA检测技术简介选择性PCR(普通PCR设计一一对特殊引物：跨特殊引物：跨双双缺口引物缺口引物正正义引物引物P1P1：与：与负链互互补结合，位于正合，位于正链缺口上游缺口上游反反义引物引物P2P2：与正：与正链互互补结合，位于合，位于负链缺口下游缺口下游目的：目的：rcDNArcDNA不被不被扩增增1.1.选择性选择性PCRPCR乙型肝炎病毒cccDNA13设计一对特殊引物：跨双缺口引物1.选择性PCR乙型肝炎病毒选择性选择性PCR：rcDNA不被扩增不被扩增乙型肝炎病毒cccDNA14选择性PCR：rcDNA不被扩增乙型肝炎病毒cccDNA14选择性选择性PCRPCR：cccDNAcccDNA能被扩增能被扩增乙型肝炎病毒cccDNA15选择性PCR：cccDNA能被扩增乙型肝炎病毒cccDNA1PCR产物自身退火（产物自身退火（self annealing）“选择性选择性”PCR”PCR：并非万无一：并非万无一失失乙型肝炎病毒cccDNA16PCR产物自身退火（self annealing）“选择性 rcDNArcDNA被被大大量量扩增增，阳阳性性结果果不不可可靠靠，定定量量结果果也不可靠也不可靠HepatologyResearch2003;15:234-243HepatologyResearch2003;15:234-243（PBMCPBMC）WorldJGastroenterol2004;10(1):82-85(WorldJGastroenterol2004;10(1):82-85(血清血清)lKockKock等：反等：反应管中管中rcDNArcDNA含量不能超含量不能超过10105 5copycopyHepatologyHepatology1996;23:405-4131996;23:405-413 血血清清HBVHBVrcDNArcDNA超超过10108 8copy/mlcopy/ml，进行行荧光光PCRPCR可能会出可能会出现检测结果假阳性果假阳性“选择性选择性”PCR”PCR：并非万无一：并非万无一失失乙型肝炎病毒cccDNA17 rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可 与与定定性性法法比比较增增加加了了一一个个荧光光探探针，探探针位位于于扩增增片片段段区区（负链缺缺口口下游），与下游），与cccDNAcccDNA的的负链互互补。选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA乙型肝炎病毒cccDNA18 与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（rcDNArcDNA不能被扩增不能被扩增无荧光信号无荧光信号EcoR I5+P1 P2 3200(1)53159031820P118201590+3200（1）EcoR I P2cccDNAcccDNA能被扩增能被扩增检测到荧光信号检测到荧光信号选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA乙型肝炎病毒cccDNA19rcDNA不能被扩增EcoR I5+P1 P2 32实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的原理的原理乙型肝炎病毒cccDNA20实时荧光定量PCR的原理乙型肝炎病毒cccDNA20实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的原理的原理乙型肝炎病毒cccDNA21实时荧光定量PCR的原理乙型肝炎病毒cccDNA21实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的原理的原理乙型肝炎病毒cccDNA22实时荧光定量PCR的原理乙型肝炎病毒cccDNA22l 标准曲准曲线方程方程Y YCtCt=42.0827-3.5554logX=42.0827-3.5554logXcopycopyl 相关指数：相关指数：RR2 2=0.995=0.995l 灵敏度至少可以达到灵敏度至少可以达到10103 3copy/mlcopy/ml结果结果：选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA乙型肝炎病毒cccDNA23 标准曲线方程YCt=42.0827-3.5554logX 同同样存在存在PCRPCR产物自身退火引起的物自身退火引起的rcDNArcDNA非特异性非特异性扩增的增的问题由于灵敏度由于灵敏度较普通普通PCRPCR高，假阳性率比普高，假阳性率比普通通PCRPCR更高更高缺陷：缺陷：选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA乙型肝炎病毒cccDNA24同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA缺陷：选择性实时质粒标准品质粒标准品107copy/ml3.5108copy/ml携带者血清携带者血清质粒标准品质粒标准品105copy/ml105107copy/ml携带者血清携带者血清选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA乙型肝炎病毒cccDNA25质粒标准品107copy/ml3.5108copy/ml携解决方案解决方案l 特异性抽提分离特异性抽提分离cccDNAcccDNA与其它形式的病毒与其它形式的病毒DNADNA 采用沉淀法或采用沉淀法或质粒抽提粒抽提试剂盒抽提法盒抽提法l 酶切切纯化化cccDNAcccDNA 采用采用绿豆核酸豆核酸酶或或ATPATP依依赖的的plasmid-safeDNAplasmid-safeDNA酶选择性实时荧光定量选择性实时荧光定量PCRPCR检测检测cccDNAcccDNA乙型肝炎病毒cccDNA26解决方案 特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA选1.1.选择性性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光光PCR)PCR)侵入者探侵入者探针法（法（InvaderassaayInvaderassaay）3.3.嵌合引物嵌合引物荧光光PCRPCR法法现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介乙型肝炎病毒cccDNA271.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)现有的乙型肝炎病毒cccDNA培训ppt课件28乙型肝炎病毒cccDNA29乙型肝炎病毒cccDNA29乙型肝炎病毒cccDNA30乙型肝炎病毒cccDNA30侵入者探针法侵入者探针法定量检测定量检测cccDNAcccDNA的优缺点的优缺点优点点：线性信号放大，特异性比性信号放大，特异性比荧光光PCRPCR法法强缺点缺点：灵敏度低：灵敏度低：10104 4copy/mlcopy/ml乙型肝炎病毒cccDNA31侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺点优点：线性信号放大，1.1.选择性性PCR(PCR(普通普通PCRPCR、套式、套式PCRPCR、荧光光PCR)PCR)2.2.侵入者分析法（侵入者分析法（InvaderassaayInvaderassaay）嵌合引物嵌合引物荧光光PCRPCR法法现有的几种现有的几种cccDNAcccDNA检测技术简介检测技术简介乙型肝炎病毒cccDNA321.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)现有的3.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法Shao,et al.J Virol Methods 2003；112：45-52+PNN：与：与HBVDNA非同源片段非同源片段5N533p+rcDNAcccDNA乙型肝炎病毒cccDNA333.嵌合引物荧光PCR法Shao,et al.J ViPNNP253533.嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR法法乙型肝炎病毒cccDNA34PNNP253533.嵌合引物荧光PCR法乙型肝炎 嵌合引物荧光嵌合引物荧光PCRPCR的优缺点的优缺点优点：点：克服了克服了荧光光PCRPCR法的部分缺陷，灵敏法的部分缺陷，灵敏度比侵入法提高度比侵入法提高缺点：缺点：仍不能完全避免待仍不能完全避免待测标本中存在的本中存在的rcDNArcDNA被非特异性被非特异性扩增增乙型肝炎病毒cccDNA35 嵌合引物荧光PCR的优缺点 优点：克服了荧光PCR法的部 无无论是是选择性性荧光光PCRPCR，还是是侵侵入入者者探探针法法或或嵌嵌合合引引物物荧光光PCRPCR，本本身身都都不不能能解解决决在在高高rcDNArcDNA背背景景条条件件下下的的假假阳阳性性问题，必必须结合合抽抽提提分分离离、酶切切纯化化等等步步骤，以以提提高高特特异性。异性。乙型肝炎病毒cccDNA36 无论是选择性荧光PCR，还是侵入者探针法或嵌合引物荧三、影响三、影响cccDNA池的因素池的因素乙型肝炎病毒cccDNA37三、影响cccDNA池的因素乙型肝炎病毒cccDNA371.cccDNA1.cccDNA池的自身恒定池的自身恒定 cccDNAcccDNA池：感染肝池：感染肝细胞核内胞核内HBVcccDNAHBVcccDNA的的含量在无外来干含量在无外来干扰的情况下保的情况下保持恒定持恒定(5(550copy/cell)50copy/cell)病毒自身病毒自身调节：关于病毒的：关于病毒的进化化关于病毒的关于病毒的“思思维”病毒自身的病毒自身的调节 外来外来压力：打破病毒含量自身恒定的力：打破病毒含量自身恒定的结果果乙型肝炎病毒cccDNA381.cccDNA池的自身恒定 cccDNA池：感染肝细胞核2.2.抗病毒药物对抗病毒药物对cccDNAcccDNA的影响的影响l现有抗病毒有抗病毒药物，包括干物，包括干扰素和各种核苷素和各种核苷类似物，可以一似物，可以一过性地减少性地减少cccDNAcccDNA，但均不能，但均不能清除清除cccDNAcccDNAl细胞核内胞核内cccDNAcccDNA含量的相含量的相对稳定性，决定了定性，决定了长疗程抗病毒治程抗病毒治疗的必要性的必要性乙型肝炎病毒cccDNA392.抗病毒药物对cccDNA的影响现有抗病毒药物，包括干扰素3.3.肝外组织也是肝外组织也是cccDNAcccDNA的储存池？的储存池？肝外肝外组织细胞中胞中HBVHBV标志的存在情况：志的存在情况：肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏黏膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺等等组织或或细胞中均胞中均检测到到HBVHBV的的标志物志物HBVHBV吸附？吸附？暂居？建立感染状居？建立感染状态？依据：从上述依据：从上述组织细胞中胞中检测到到cccDNAcccDNA，但必但必须解决解决检测技技术问题乙型肝炎病毒cccDNA403.肝外组织也是cccDNA的储存池？肝外组织细胞中HBV(2)(2)关于血清中是否存在关于血清中是否存在cccDNAcccDNA的问题的问题 “血清中血清中rcDNArcDNA含量越高，含量越高，cccDNAcccDNA阳性率阳性率越高和含量越高越高和含量越高”的的现象，使我象，使我们对方法方法学提出学提出质疑疑肝衰竭的病人在一定病期有可能大量肝衰竭的病人在一定病期有可能大量释放放cccDNAcccDNA入血入血细胞坏死后，胞坏死后，cccDNAcccDNA释放入血是必然的，放入血是必然的，但是，裸露的核酸分子在血清中存在多少但是，裸露的核酸分子在血清中存在多少时间？乙型肝炎病毒cccDNA41(2)关于血清中是否存在cccDNA的问题“血清中rcD乙型肝炎病毒cccDNA42Thank you乙型肝炎病毒cccDNA42