免疫细胞的分离与检测课件

一、免疫细胞的特征一、免疫细胞的特征1、免疫、免疫细细胞的形胞的形态态学特征学特征理化性状理化性状生物学特性生物学特性2、免疫、免疫细细胞的膜分子特征胞的膜分子特征分子分子一、免疫细胞的特征1、免疫细胞的形态学特征1免疫细胞的分离与检测课件2 吞噬溶酶体吞噬溶酶体3免疫细胞的分离与检测课件4二、免疫细胞的分离技术二、免疫细胞的分离技术1、密度梯度离心法、密度梯度离心法2、黏附分离法、黏附分离法3、荧荧光激活分离法光激活分离法4、磁性分离法、磁性分离法5、其他分离法、其他分离法二、免疫细胞的分离技术1、密度梯度离心法51、密度梯度离心法、密度梯度离心法聚蔗糖聚蔗糖()-泛影葡胺泛影葡胺()()分分层液液是蔗糖的多聚体，呈中性，是蔗糖的多聚体，呈中性，亲水性高，平均分子量水性高，平均分子量为400,000，当密度，当密度为1.2仍未超出正常生理性渗透仍未超出正常生理性渗透压，也不穿，也不穿过生物膜。生物膜。红细胞、粒胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和胞和单核核细胞的比重小于或等于分胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分液比重，离心后漂浮于分层液的液的液面上，也可有少部分液面上，也可有少部分细胞胞悬浮在分浮在分层液中。吸取分液中。吸取分层液液液液面的面的细胞，就可从外周血中分离到胞，就可从外周血中分离到单个核个核细胞。胞。1、密度梯度离心法聚蔗糖()-泛影葡胺()()分层液6离心前离心前离心后离心后稀稀释抗凝血抗凝血淋巴淋巴细胞分离液胞分离液血血浆单个核个核细胞胞粒粒细胞胞红细胞胞离心前离心后稀释抗凝血淋巴细胞分离液血浆单个核细胞粒细胞红细72、黏附分离法、黏附分离法-纯纯淋巴淋巴细细胞群的分离胞群的分离贴壁法：将已制壁法：将已制备的的单个核个核细胞胞悬液液倾于玻于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37温箱温箱静置静置1h左右，左右，单核核细胞和粒胞和粒细胞均胞均贴于平皿于平皿壁上，而未壁上，而未贴壁的非粘附壁的非粘附细胞几乎胞几乎为纯淋巴淋巴细胞，胞，继用橡皮刮下用橡皮刮下贴壁的壁的细胞即胞即为纯单核核细胞群。因胞群。因B细胞也有胞也有贴壁壁现象，用本法分象，用本法分离的淋巴离的淋巴细胞群中胞群中B细胞有所胞有所损失。失。2、黏附分离法-纯淋巴细胞群的分离贴壁法：将已制备的单个核细82、黏附分离法：淋巴细胞亚群的分离vv尼龙毛法：混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，尼龙毛法：混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B B细胞、浆细胞、细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而多数单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而多数T T细胞则细胞则通过尼龙毛柱，这是获得富含通过尼龙毛柱，这是获得富含T T细胞群的有效方法。细胞群的有效方法。TT细胞得率为细胞得率为20-20-30%30%左右。左右。vv亲和板法：利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群，其原理是各种淋巴细亲和板法：利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群，其原理是各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取。吸附的细胞悬液中获取。vv吸附柱法：将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶吸附柱法：将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶1010的柱的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中，从柱上层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。此法简单易行，对细胞极少损害。洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。此法简单易行，对细胞极少损害。2、黏附分离法：淋巴细胞亚群的分离尼龙毛法：混合单个核细胞悬93、荧荧光激活分离法（）光激活分离法（）3、荧光激活分离法（）10流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪114、磁性分离法（1）磁铁吸引法：利用单核细胞具有吞噬的特性，在单个核细胞悬液中加直径为3m的羰基铁颗粒，置37温箱内短时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞。（2）磁激活细胞分离术：是一种特异性细胞分选技术，其高度特异性来自抗体对抗原的特异性识别。主要组成成分为微珠、分选柱和分选器。微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒。分选柱置于一个永久性磁场分选器中，可以将磁力增强1000倍，足以滞留仅标记极少量微珠的目的细胞。用缓冲液冲洗分选柱，所有未标记的细胞被冲洗掉。分选柱离开磁场，即可获得被标记的细胞组分。4、磁性分离法（1）磁铁吸引法：利用单核细胞具有吞噬的特性，12(阳性选择法）阳性选择法）NS(阳性选择法）NS13(阴性选择法）阴性选择法）NS(阴性选择法）NS14免疫细胞的分离与检测课件15免疫细胞的分离与检测课件165、其他分离法、其他分离法花花环沉降法：本法是将淋巴沉降法：本法是将淋巴细胞与一定比例胞与一定比例的的绵羊羊红细胞混合，待淋巴胞混合，待淋巴细胞形成胞形成E花花环后，后，继用淋巴用淋巴细胞分胞分层液分离液分离细胞。浮胞。浮悬在在分分层界面而不形成界面而不形成E花花环的群的群则富含富含B细胞，胞，而沉降在管底的形成而沉降在管底的形成E花花环的的细胞用低渗法胞用低渗法处理，使理，使围绕细胞周胞周围的的绵羊羊红细胞快速裂胞快速裂解，解，则获得得纯的的T细胞。胞。可溶性可溶性肽四聚体法：四聚体法：肽四聚体复合物的原理四聚体复合物的原理是通是通过增增强t细胞受体与胞受体与肽复合物复合物亲和力，达和力，达到可直接特异性到可直接特异性检测t细胞的目的。胞的目的。作作为临床床诊断工具，定量断工具，定量检测外周血及外周血及组织中抗原特异性的比率，并中抗原特异性的比率，并进行表型及功能分行表型及功能分析。析。用于用于过继性性肿瘤免疫治瘤免疫治疗用于疫苗用于疫苗疗效的效的监测5、其他分离法花环沉降法：本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红17抗原肽分子四聚体技术抗原肽分子四聚体技术T抗原肽分子四聚体技术T18I I类类(左左)和和类类(右右)分子四聚体结构示意图分子四聚体结构示意图 I类(左)和类(右)分子四聚体结构示意图19三、细胞的冻存与复苏三、细胞的冻存与复苏1、细胞冻存的原理与方法：在不加任何条件、细胞冻存的原理与方法：在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，引起细胞死亡。向培养液加入保会形成冰晶，引起细胞死亡。向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130以下的低温中能减少冰晶的形成。以下的低温中能减少冰晶的形成。2、细胞复苏的原理与方法：细胞复苏时速度、细胞复苏的原理与方法：细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的要快，使之迅速通过细胞最易受损的50，细胞仍能生长，活力受损不大。，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（）和甘油，它目前常用的保护剂为二甲亚砜（）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。透细胞。三、细胞的冻存与复苏1、细胞冻存的原理与方法：在不加任何条件20细胞冻存罐细胞冻存罐细胞冻存罐21 第二节第二节 免疫细胞膜分子的检测免疫细胞膜分子的检测一、免疫一、免疫细胞膜分子胞膜分子检测的原理与的原理与类型型二、免疫二、免疫细胞膜分子的胞膜分子的检测方法方法第二节免疫细胞膜分子的检测一、免疫细胞膜分子检测的原理22一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型1、以抗体识别抗原、以抗体识别抗原2、以配体识别受体、以配体识别受体一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型1、以抗体识别抗原23二、免疫细胞膜分子的主要检测方法1、免疫、免疫标记检测标记检测方法方法 荧荧光抗体法光抗体法 酶酶免疫免疫检测检测法法 免疫金免疫金银银染色法染色法2、补补体依体依赖赖的的细细胞毒胞毒试验试验（）（）3、花、花环环形成形成试验试验二、免疫细胞膜分子的主要检测方法1、免疫标记检测方法24的荧光抗体检测法的荧光抗体检测法的荧光抗体检测法25的酶免疫检测法的酶免疫检测法的酶免疫检测法26补体依赖的细胞毒试验（）补体依赖的细胞毒试验（）染料补体补体依赖的细胞毒试验（）染料补体27花环：利用T细胞膜上的异种动物红细胞受体T细胞B细胞花环形成细胞绵羊红细胞花环：利用T细胞膜上的异种动物红细胞受体T细胞B细胞花环形成28免疫细胞的分离与检测课件29花环：B淋巴细胞表面有受体，能与免疫球蛋白的段结合，因此用抗体致敏的红细胞与B淋巴细胞混合，可见B淋巴细胞周围粘附有红细胞花环：B淋巴细胞表面有受体，能与免疫球蛋白的段结合，因此用抗30花环：B淋巴细胞表面有补体受体，在抗体致敏的红细胞中加入补体，可形成红细胞-抗体-补体复合物，再与B淋巴细胞混合，则可形成玫瑰花环。花环：B淋巴细胞表面有补体受体，在抗体致敏的红细胞中加入补体31 第三节第三节第三节第三节 免疫细胞功能测定免疫细胞功能测定免疫细胞功能测定免疫细胞功能测定一、一、转化、增殖化、增殖试验二、二、细胞毒胞毒试验三、抗体形成三、抗体形成试验四、四、细胞吞噬与胞吞噬与杀伤试验第三节免疫细胞功能测定一、转化、增殖试验321、淋巴细胞转化试验：刺激物分为非特异性（如植物血凝素、刀豆素A等）和特异性刺激因子（如抗原）；检测方法为形态学检测法和3掺入法及法等。2、混合淋巴细胞培养：混合淋巴细胞培养()或称混合淋巴细胞反应()常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原(抗原)相容的程度。由于中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进、和等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。一、一、转化、增殖化、增殖试验1、淋巴细胞转化试验：刺激物分为非特异性（如植物血凝素、刀豆33免疫细胞的分离与检测课件34放射性放射性测定定3丝裂原（抗原）刺激淋淋巴巴细胞胞转化化试验原原理理示示意意小淋巴小淋巴细胞在胞在转化化为原始母原始母细胞胞过程中，合成增加，能程中，合成增加，能够吸收吸收胸腺胸腺嘧啶核苷（核苷（3H3H）放射性测定3丝裂原（抗原）刺激淋巴细胞转化试验原理示意小淋巴351、T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验2、作用测定作用测定3、活性测定、活性测定二、细胞毒检测试验 第三节第三节第三节第三节 免疫细胞功能测定免疫细胞功能测定免疫细胞功能测定免疫细胞功能测定1、T细胞介导的细胞毒试验二、细胞毒检测试验第三节免疫36放射性测定细胞胞毒毒试验原原理理示示意意靶细胞效应细胞分离上清放射性测定细胞毒试验原理示意靶细胞效应细胞分离上清372、K细细胞活性胞活性测测定（活性定（活性测测定）定）v动物机体有些免疫细胞，通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（）杀伤靶细胞，如细胞、活化的T细胞、吞噬细胞等，这类细胞统称为K细胞。vK细胞的活性不仅反映机体细胞免疫的能力，而且与体液免疫也有直接的关系。vK细胞活性检测的方法有同位素释放试验法，溶血空斑法，细胞剥离法和靶细胞接合试验。仅介绍同位素释放法。2、K细胞活性测定（活性测定）动物机体有些免疫细胞，通过抗体38（1 1）原理）原理v将靶细胞用51标记后，再与特异性的抗体结合，加入K细胞后即可发生效应，引起靶细胞的溶解并释放51。用计数仪分别检测上清和细胞沉淀中的，根据上清中释放的51的多少，可判断K细胞活性的高低。（1）原理将靶细胞用51标记后，再与特异性的抗体结合，加入K39（2 2）方法）方法v1、试验管：效应细胞(淋巴细胞悬液)，标记的靶细胞(51标记的鸡红细胞)和亚凝集单位的抗体(兔抗鸡红细胞抗体)各0.1，加1640完全培养基1.7（）。v2、效应细胞对照管：效应细胞和标记的靶细胞各0.1加上述完全培养基1.8（未加抗体）。v3、抗体对照管：标记的靶细胞和亚凝集单位的抗体各0.1，加完全培养基1.8（未加效应细胞）。v4、最大释放对照管：标记的靶细胞0.1加蒸馏水1.9（靶细胞会裂解，完全释放同位素）。v5、自然释放管：标记的靶细胞0.1，加完全培养基1.9（靶细胞不裂解，但可自然释放一定量的同位素）。v以上各管均置37520h后，2500g离心10，分别取各管上清夜1.0置于5支试管中，用计数仪测各管上清和沉淀中的值。（2）方法1、试验管：效应细胞(淋巴细胞悬液)，标记的靶细40（3 3）结果判断和果判断和计算算v51实验释放率（%）v2(上清本底)100%v(上清本底)(沉淀本底)v51特异释放率（%）v试验释放率自然释放率100%v最大释放率自然释放率（3）结果判断和计算51实验释放率（%）413、细细胞活性胞活性测测定定v细胞是具有天然杀伤靶细胞活性的淋巴样细胞，其杀伤作用不需要抗体、补体的参加，所杀伤靶细胞通常指肿瘤细胞和病毒感染或转化的细胞。这样，可以将来源于同种动物的肿瘤细胞系或病毒转化的细胞系，作为检测细胞活性的指示细胞。v细胞活性测定多采用51释放法试验，其原理同细胞毒性T细胞试验中所采用的51释放法试验。在这里以检测小鼠脾脏细胞活性为例，说明本试验方法。用3掺入法，靶细胞为1细胞株（小鼠淋巴瘤细胞系）。3、细胞活性测定细胞是具有天然杀伤靶细胞活性的淋巴样细胞，其42v（1）试剂v小鼠脾细胞悬液:分离单个脾脏细胞裂解红细胞淋巴细胞洗涤配置悬液（1640完全培养基2106）。v标记的靶细胞：活淋巴细胞（96%以上）加入H3孵育2小时/每30振摇洗3次配成2106悬液。（1）试剂43v（2）方法v试验组孔：脾细胞悬液(淋巴细胞)：标记的靶细胞悬液100:1左右；v对照组：单纯加标记的靶细胞。v3752培养18小时（细胞杀伤靶细胞）；v每孔加终浓度为0.15%的胰酶和0.0125酶37处理30（消化细胞和处理掉死亡靶细胞释放出来的放射性）。v各孔细胞收集后依次通过生理盐水，5%三氯乙酸和无水乙醇（获得了存活的靶细胞的标记）。v待滤膜干燥后用液闪计数仪测定值。v三、结果计算v细胞活性以特异性杀伤率表示：特异性杀伤率（%）（1试验组对照组）100%（2）方法441、直接溶血空斑、直接溶血空斑试验试验2、间间接溶血空斑接溶血空斑试验试验3、溶血空斑、溶血空斑试验试验三、抗体形成三、抗体形成试验1、直接溶血空斑试验三、抗体形成试验451、直接溶血空斑、直接溶血空斑试验试验1、直接溶血空斑试验462、间间接溶血空斑接溶血空斑试验试验2、间接溶血空斑试验473、溶血空斑、溶血空斑试验试验3、溶血空斑试验481、细细胞吞噬功能胞吞噬功能试验试验2、细细胞胞杀杀菌功能菌功能试验试验细胞吞噬与杀伤功能试验细胞吞噬与杀伤功能试验1、细胞吞噬功能试验细胞吞噬与杀伤功能试验49免疫细胞的分离与检测课件50吞噬百分率 =吞有颗粒的吞噬细胞数计数的吞噬细胞数吞噬指数 =吞噬细胞吞噬的总颗粒数计数的吞噬细胞数吞噬百分率=吞有颗粒的吞噬细胞数计数的吞噬细胞数吞噬指数51还原试验还原试验原理：C +2C 四氮唑基（淡黄色）甲月簪基（紫黑色）还原试验原理：2四氮唑基（淡黄色）甲月簪基（紫黑色）52还原试验还原试验方法：方法：1、抗凝血、抗凝血+硝基硝基蓝蓝四氮四氮唑唑（），（），37。C孵育孵育25。2、推片染色、推片染色、镜检镜检。正常正常值：阳性阳性细细胞胞7.5-15%还原试验方法：1、抗凝血+硝基蓝四氮唑（），37。C孵育53 第四节 免疫细胞凋亡测定一、一、细胞凋亡的概念与原理胞凋亡的概念与原理二、二、细胞凋亡的胞凋亡的检测方法方法第四节免疫细胞凋亡测定一、细胞凋亡的概念与原理54 一、细胞凋亡的概念与原理一、细胞凋亡的概念与原理1、细细胞凋亡的概念胞凋亡的概念2、细细胞凋亡的原理胞凋亡的原理3、细细胞凋亡的特点胞凋亡的特点一、细胞凋亡的概念与原理1、细胞凋亡的概念55 1、细胞凋亡（）细胞在内源性基因调控下发生的主动死亡过程，也称程序性死亡。1、细胞凋亡（）细胞在内源性基因调控下发生的主动死亡56v虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大差别。v坏死（）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，降解不充分，引起局部严重的炎症反应。v凋亡是细胞对环境的生理性病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大57凋亡凋亡坏死坏死机制机制基因基因调控的程序化控的程序化细胞死亡，胞死亡，主主动进行（自行（自杀性）性）意外事故性意外事故性细胞死亡，被胞死亡，被动进行行（他（他杀性）性）诱因因生理性或生理性或轻微病理性刺激因子微病理性刺激因子诱导发生，如生生，如生长因子缺乏因子缺乏病理性刺激因子病理性刺激因子诱导发生，如缺氧、生，如缺氧、感染、中毒感染、中毒死亡范死亡范围多多为散在的散在的单个个细胞胞多多为聚集的大片聚集的大片细胞胞形形态特征特征细胞固胞固缩，核染色，核染色质边集，集，细胞膜及各胞膜及各细胞器膜完整，膜可胞器膜完整，膜可发泡成芽，形成凋亡小体泡成芽，形成凋亡小体细胞胞肿胀，核染色，核染色质絮状或絮状或边集，集，细胞膜及各胞膜及各细胞器膜溶解破坏，溶胞器膜溶解破坏，溶酶体体酶释放，放，细胞自溶胞自溶生化特征生化特征耗能的主耗能的主动过程，有新蛋白合程，有新蛋白合成，早期成，早期规律降解律降解为180-200180-200片段，片段，琼脂凝胶脂凝胶电泳呈特征性泳呈特征性梯梯带状状不耗能的被不耗能的被动过程，无新蛋白合成，程，无新蛋白合成，降解不降解不规律，片段大小不一，律，片段大小不一，琼脂脂凝胶凝胶电泳不呈梯泳不呈梯带状状周周围反反应不引起周不引起周围组织炎症反炎症反应和修和修复再生，但凋亡小体可被复再生，但凋亡小体可被邻近近细胞吞噬胞吞噬引起周引起周围组织炎症反炎症反应和修复再生和修复再生凋亡坏死机制基因调控的程序化细胞死亡，主动进行（自杀性）意58 2、细胞凋亡的原理凋亡信号凋亡信号凋亡受体凋亡受体信号信号传导凋亡基因启凋亡基因启动编码程序性死亡蛋白程序性死亡蛋白细胞胞结构解体构解体细胞凋亡胞凋亡2、细胞凋亡的原理凋亡信号凋亡受体信号传导凋亡59 细细胞凋亡机制（胞凋亡机制（动动画）画）细胞凋亡机制（动画）603 3、细胞凋亡的特点、细胞凋亡的特点、细胞凋亡的特点、细胞凋亡的特点（1）细胞胞皱缩（2）染色）染色质边集集（3）凋亡小体出）凋亡小体出现3、细胞凋亡的特点（1）细胞皱缩61 细胞凋亡细胞凋亡62 二、细胞凋亡的检测方法二、细胞凋亡的检测方法二、细胞凋亡的检测方法二、细胞凋亡的检测方法1、形态观察法：凋亡的细胞皱缩，质膜完整，胞浆致密，细胞器密集，不同程度退变；核染色质致密，形成形状不一，大小不等的团块边集于核膜处，进而胞核裂解；胞浆发生芽突。胞浆芽突脱落后，形成许多凋亡小体。2、生化检测法：胞浆内2+浓度升高。细胞内活性氧增多。质膜通透性增高。内切酶被激活，双链在核小体之间切断形成180200的特征性的有序片段。型谷氨酰胺转移酶和钙蛋白酶（）活性升高。3、流式细胞仪检测法二、细胞凋亡的检测方法1、形态观察法：凋亡的细胞皱缩，质膜631、形态观察法、形态观察法（1 1）普通光）普通光）普通光）普通光镜检测镜检测染色染色染色染色甲基甲基甲基甲基绿绿-派派派派诺诺宁染色：宁染色：宁染色：宁染色：细细胞凋亡是一种胞凋亡是一种胞凋亡是一种胞凋亡是一种细细胞主胞主胞主胞主动动死亡死亡死亡死亡过过程，程，程，程，需要有需要有需要有需要有细细胞内蛋白胞内蛋白胞内蛋白胞内蛋白酶酶的激活，的激活，的激活，的激活，细细胞胞胞胞质质内常有表达的增内常有表达的增内常有表达的增内常有表达的增强强。而而而而细细胞坏死是一种被胞坏死是一种被胞坏死是一种被胞坏死是一种被动动的的的的细细胞死亡胞死亡胞死亡胞死亡过过程，程，程，程，细细胞胞胞胞质质内常有的内常有的内常有的内常有的损损失。根据失。根据失。根据失。根据这这一特点，可一特点，可一特点，可一特点，可应应用用用用试剂试剂甲基甲基甲基甲基绿对绿对染色的特异性染色的特异性染色的特异性染色的特异性和派和派和派和派诺诺宁宁宁宁对对的的的的亲亲和性，使甲基和性，使甲基和性，使甲基和性，使甲基绿对绿对固固固固缩细缩细胞核内的脱氧核胞核内的脱氧核胞核内的脱氧核胞核内的脱氧核糖核酸着染，如果糖核酸着染，如果糖核酸着染，如果糖核酸着染，如果细细胞胞胞胞质质内核糖核酸呈派内核糖核酸呈派内核糖核酸呈派内核糖核酸呈派诺诺宁阳性染色者宁阳性染色者宁阳性染色者宁阳性染色者为为凋亡凋亡凋亡凋亡细细胞，呈阴性染色者胞，呈阴性染色者胞，呈阴性染色者胞，呈阴性染色者为为坏死坏死坏死坏死细细胞。胞。胞。胞。二、二、细细胞凋亡的胞凋亡的检测检测方法方法1、形态观察法（1）普通光镜检测二、细胞凋亡的检测方法64vv甲基绿甲基绿-派诺宁染色：光学显微镜下凋亡细胞和坏死细胞均表现为细派诺宁染色：光学显微镜下凋亡细胞和坏死细胞均表现为细胞固缩：其中凋亡细胞细胞核呈绿色或绿蓝色着染，胞质呈红紫色胞固缩：其中凋亡细胞细胞核呈绿色或绿蓝色着染，胞质呈红紫色着染，坏死细胞只有固缩细胞，核绿色着染，而细胞质无染色。着染，坏死细胞只有固缩细胞，核绿色着染，而细胞质无染色。甲基绿-派诺宁染色：光学显微镜下凋亡细胞和坏死细胞均表现为细65（2 2）荧光显微镜检测）荧光显微镜检测溴化丙锭（）染色：溴化丙锭（）染色：碘化丙啶碘化丙啶(,)(,)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，能够透过细胞膜而使细但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，能够透过细胞膜而使细胞核红染。胞核红染。（2）荧光显微镜检测溴化丙锭（）染色：66vv（3 3）透射电子显）透射电子显微镜：已经用于凋微镜：已经用于凋亡细胞的检测。镜亡细胞的检测。镜下可见凋亡细胞体下可见凋亡细胞体积变小、细胞质浓积变小、细胞质浓缩、细胞核变小、缩、细胞核变小、染色质浓缩并凝结染色质浓缩并凝结成块，出现染色质成块，出现染色质沿核膜内侧排列的沿核膜内侧排列的核边集现象。晚期核边集现象。晚期的凋亡细胞，清晰的凋亡细胞，清晰可见细胞核裂解产可见细胞核裂解产生的凋亡小体。生的凋亡小体。（3）透射电子显微镜：已经用于凋亡细胞的检测。镜下可见凋亡细672、生化检测法、生化检测法（1）凝胶电泳法：（2）原位末端标记法（3）二苯胺分光光度法 二、细胞凋亡的检测方法二、细胞凋亡的检测方法二、细胞凋亡的检测方法二、细胞凋亡的检测方法2、生化检测法（1）凝胶电泳法：二、细胞凋亡的检测方法68（1）凝胶电泳法）凝胶电泳法原理：凋亡细胞的突出特征是由于内源性核酸内切酶的激活而导致细胞核的断裂。典型的细胞凋亡，在核内形成大量200大小及其倍体的核苷酸片段，而非典型的凋亡细胞，由于核内的降解不完全，仅形成30050的大片。利用这一特性，可通过凝胶电泳来判定凋亡的发生和发展情况。方法：提取总凝胶电泳观察现象（1）凝胶电泳法原理：凋亡细胞的突出特征是由于内源性核酸内切69v凝胶电泳特点(1)本方法不能检测单个细胞水平的凋亡。(2)不能提供细胞发生凋亡所处的组织位置和细胞分化状态。凝胶电泳特点(1)本方法不能检测单个细胞水平的凋亡。(70（2）原位末端标记法（）原位末端标记法（）原理：利用原理：利用标记的，在作用下的，在作用下结合断片的合断片的3末端末端羟基，基，显示断示断链，提示凋亡，提示凋亡方法：制方法：制备组织切片切片标记物物结合合标记物物显色色镜检（2）原位末端标记法（）原理：利用标记的，在作用下结合断片的71v染色：细胞核固缩有的呈碎片状，不规则，大小不一致，呈棕黄色颗粒者为阳性细胞。即凋亡的细胞染色：细胞核固缩有的呈碎片状，不规则，大小不一致，呈棕黄色颗72（3）二苯胺分光光度法）二苯胺分光光度法原理：原理：细细胞凋亡可胞凋亡可产产生低分子量，通生低分子量，通过过超速离心可超速离心可与与细细胞核的高分子量分离，分胞核的高分子量分离，分别测别测定两种，即可得定两种，即可得出凋亡百分率。出凋亡百分率。方法：裂解方法：裂解细细胞胞13000g13000g超速离心超速离心分分别别提取提取使使显显色，色，测测定定（3）二苯胺分光光度法原理：细胞凋亡可产生低分子量，通过超速73凋亡百分率 =上清液OD值上清液OD值+沉淀OD值凋亡百分率=上清液OD值上清液OD值+沉淀OD值74