免疫学诊断课件

生物技术学院抗体工程研究所生物技术学院抗体工程研究所2009年年6月月11日日免疫学检测技术免疫学检测技术1免疫学检测技术免疫学检测技术1分子诊断学分子诊断学分子诊断学是以分子生物学理论为基分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用础，利用基因和蛋白质分析技术和方法基因和蛋白质分析技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子来研究人体内源性或外源性生物大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的监测、诊断、疗效判断和预后为疾病的监测、诊断、疗效判断和预后评估、个体化治疗等提供信息和决策依评估、个体化治疗等提供信息和决策依据的一门科学。据的一门科学。随着分子诊断技术的不断发展，分子随着分子诊断技术的不断发展，分子诊断已从传统的诊断已从传统的DNADNA诊断概念发展到更全诊断概念发展到更全面的面的核酸和蛋白质核酸和蛋白质诊断的新概念；分子诊断的新概念；分子诊断的内容也从早期的单一遗传性疾病诊断的内容也从早期的单一遗传性疾病的诊断发展成为覆盖临床医学、预防医的诊断发展成为覆盖临床医学、预防医学等众多领域的重要技术。学等众多领域的重要技术。2分子诊断学分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用基因和蛋白分子诊断学分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用基因和蛋白v生化产品生化产品30v免疫产品免疫产品25%v基因产品基因产品58v血液分析产品血液分析产品810v尿液分析产品尿液分析产品35%v微生物产品微生物产品23诊断试剂仅占生物技术产业的诊断试剂仅占生物技术产业的25%3生化产品生化产品30诊断试剂仅占生物技术产业的诊断试剂仅占生物技术产业的25%2005年国内年国内免疫学检验项目分布情况免疫学检验项目分布情况Infectious diseasesInfectious diseasesTumor markersTumor markersSource:UBS Warburg LLC estimatesSource:UBS Warburg LLC estimates免疫学技术在临床诊断领域中的作用将越来越重要免疫学技术在临床诊断领域中的作用将越来越重要4免疫学检验项目分布情况免疫学检验项目分布情况Infectiousdiseases（1 1）酶免疫分析酶免疫分析（2 2）放射免疫分析放射免疫分析（3 3）免疫荧光分析免疫荧光分析（4 4）时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析（5 5）化学发光免疫分析化学发光免疫分析（6 6）金标和金标和磁性免疫层析分析磁性免疫层析分析（7 7）蛋白印迹蛋白印迹（8 8）AlphaScreenAlphaScreen分析技术分析技术 5主要内容（主要内容（1）酶免疫分析）酶免疫分析51 1、特异性特异性2 2、可见性、可见性3 3、可逆性、可逆性AgAb-+61、特异性抗原抗体反应的特性、特异性抗原抗体反应的特性AgAb-+6(1)(1)抗原抗体的性质抗原抗体的性质(2)(2)温度温度(3)(3)酸碱度（酸碱度（PHPH）(4)(4)电解质（离子强度）电解质（离子强度）7(1)抗原抗体的性质影响抗原抗体反应的因素抗原抗体的性质影响抗原抗体反应的因素71 1、天然抗原天然抗原2 2、重组抗原、重组抗原3 3、合成肽、合成肽1 1、多克隆抗体多克隆抗体2 2、单克隆抗体、单克隆抗体3 3、基因工程抗体、基因工程抗体抗原抗原抗体抗体Georges J.F.Khler,Csar Milstein,1984 McAb Georges J.F.Khler,Csar Milstein,1984 McAb 81、天然抗原、天然抗原1、多克隆抗体抗原抗体抗原和抗体的类别、多克隆抗体抗原抗体抗原和抗体的类别Georg标记免疫学分析技术发展历程标记免疫学分析技术发展历程4免疫荧光分析免疫荧光分析(Coons,1941)(Coons,1941)4放射免疫分析放射免疫分析(Berson(Berson和和Yalow,1960)Yalow,1960)4酶联免疫吸附分析酶联免疫吸附分析 (Engvall,1971)(Engvall,1971)4金标免疫分析金标免疫分析(Faulk(Faulk和和Taylor,1971)Taylor,1971)4化学发光免疫分析化学发光免疫分析(Arakawa(Arakawa，1977)1977)4时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析(Soini(Soini和和HemmilaHemmila，1979)1979)4电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析(Leland,1990)(Leland,1990)9标记免疫学分析技术发展历程标记免疫学分析技术发展历程9免疫荧光免疫荧光放射免放射免疫疫化化 学学 发发光光电化学发光电化学发光 时间分辨荧光时间分辨荧光酶联免酶联免疫疫10免疫荧光免疫荧光放射免疫放射免疫化学发光化学发光电化学发光电化学发光时间分辨荧光时间分辨荧光酶免疫技术酶免疫技术固相固相(ELISA)(ELISA)酶免疫组织化学酶免疫组织化学酶免疫测定酶免疫测定均相均相异相异相液相液相11一、酶免疫分析技术酶免疫技术固相一、酶免疫分析技术酶免疫技术固相(ELISA)酶免疫组织化学酶免疫组织化学 酶联免疫吸附测定（酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked Immuno Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA Sorbent Assay,ELISA）基础是抗原或抗体）基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，反应完成后的固相化及抗原或抗体的酶标记，反应完成后加入酶反应底物，底物被酶催化成为有色产物，加入酶反应底物，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。此进行定性或定量分析。12酶联免疫吸附测定（酶联免疫吸附测定（EnzymeLinkedImmun来源方便，易于纯化；来源方便，易于纯化；比活性高，性质稳定；比活性高，性质稳定；与抗体或抗原交联后仍保持酶的活性；与抗体或抗原交联后仍保持酶的活性；待测物中不存在该酶及其底物、抑制剂和其它干待测物中不存在该酶及其底物、抑制剂和其它干扰因素；扰因素；酶活性和量能用简单、快速、敏感的方法测定。酶活性和量能用简单、快速、敏感的方法测定。辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶13来源方便，易于纯化；标记用酶的要求辣根过氧化物酶，碱性磷酸来源方便，易于纯化；标记用酶的要求辣根过氧化物酶，碱性磷酸底物为邻苯二胺底物为邻苯二胺(OPD),(OPD),橙红色橙红色 ，检，检测波长测波长492nm492nm；四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)(TMB)，蓝绿色，检测蓝绿色，检测波长波长450nm450nm14底物为邻苯二胺底物为邻苯二胺(OPD),橙红色橙红色，检测波长，检测波长492nm；底物为底物为PNPPNP（对硝基磷酸苯酯）（对硝基磷酸苯酯）,检测波长检测波长405nm405nm。15碱性磷酸酶碱性磷酸酶底物为底物为PNP（对硝基磷酸苯酯）（对硝基磷酸苯酯）,检测波长检测波长固相的抗原或抗体固相的抗原或抗体酶标记的抗原或抗体酶标记的抗原或抗体酶作用的底物酶作用的底物 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。16固相的抗原或抗体固相的抗原或抗体ELISA的必要试剂的必要试剂根据试剂的来源根据试剂的来源双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体间接法测抗体间接法测抗体竞争法测抗体竞争法测抗体竞争法测抗原竞争法测抗原捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体BAS-ELISABAS-ELISA法法17双抗体夹心法测抗原技术类型双抗体夹心法测抗原技术类型17(1)(1)双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原 此法适用于检验各种大分子抗原，例如此法适用于检验各种大分子抗原，例如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP等。等。酶标抗体酶标抗体样品样品底物底物酶标仪测定酶标仪测定ODOD值值终止液终止液18(1)双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原此法适用于检验各种大分子抗原，此法适用于检验各种大分子抗原，n在一步法测定中，如标本中受检抗原的含量很高在一步法测定中，如标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成不再形成“夹心复合物夹心复合物”。所得结果将低于实际。所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应的含量，这种现象被称为钩状效应(hookeffect)(hookeffect)。n类风湿因子（类风湿因子（RFRF）的干扰。）的干扰。RFRF是一种自身抗体，是一种自身抗体，多为多为IgMIgM型，能和多种动物型，能和多种动物IgGIgG的的FcFc段结合。表现出段结合。表现出假阳性反应。假阳性反应。19在一步法测定中，如标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和在一步法测定中，如标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和 反应模式与双抗体夹心法类似。反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。合物，以检测相应的抗体。抗抗-HBs-HBs、抗、抗-HCV-HCV、抗、抗-HIV-HIV的检测常采用本的检测常采用本法。法。20反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备(3)(3)间接法测抗体间接法测抗体 一些传染病的诊断一些传染病的诊断(Torch)(Torch)。包被抗原利。包被抗原利用用酶标二抗酶标二抗建立检测相应抗体的方法。建立检测相应抗体的方法。酶标抗体酶标抗体样品样品样品稀释液样品稀释液终止液终止液底物底物21(3)间接法测抗体间接法测抗体一些传染病的诊断一些传染病的诊断(Torch)。2222(4)(4)竞争法测抗体竞争法测抗体 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。如抗如抗-HBc-HBc等常用该方法。等常用该方法。酶标抗体酶标抗体样品样品底物底物终止液终止液23(4)竞争法测抗体竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去，当抗原材料中的干扰物质不易除去，(5)(5)竞争法测抗原竞争法测抗原 其原理是标本中的抗原和一定量的酶标其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素后的显色也愈浅。小分子激素(T3(T3、T4)T4)、药、药物等物等ELISAELISA测定多用此法。测定多用此法。24(5)竞争法测抗原竞争法测抗原其原理是标本中的抗原和一定量的酶标其原理是标本中的抗原和一定量的酶标(6)(6)捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体 IgM IgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgMIgM抗抗体包被固相，以捕获血清标本中的体包被固相，以捕获血清标本中的IgMIgM（其中包括（其中包括针对抗原的特异性针对抗原的特异性IgMIgM抗体和非特异性的抗体和非特异性的IgMIgM）。）。此法常用于病毒性感染的早期诊断。此法常用于病毒性感染的早期诊断。酶标抗体酶标抗体特异性抗原特异性抗原样品样品终止液终止液底物底物25(6)捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体IgM的检测常用于传染病的诊断。的检测常用于传染病的诊断。(7)(7)BAS-ELISABAS-ELISA法法：固相支持物；：固相支持物；：样品；：样品；：特异性：特异性IgGIgG；：生物素化抗小鼠：生物素化抗小鼠IgG IgG（BiotinBiotin）；）；：辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶HRP-HRP-酶标链亲和素（酶标链亲和素（AvidinAvidin）；）；：DABDAB显色液；显色液；：显色；：显色；26(7)BAS-ELISA法法：固相支持物；：固相支持物；261.1.戊二醛法戊二醛法一步法：将一步法：将HRPHRP和抗体与戊二醛同时反应连接而和抗体与戊二醛同时反应连接而成。成。一步法操作简单，但所得产物质量不均一，一步法操作简单，但所得产物质量不均一，抗体活性损失大，结合物的产率低。抗体活性损失大，结合物的产率低。二步法：将二步法：将HRPHRP按一定比例与戊二醛反应，形成按一定比例与戊二醛反应，形成HRP-HRP-戊二醛结合物，透析除去未结合的戊二醛戊二醛结合物，透析除去未结合的戊二醛后，再加入抗体。后，再加入抗体。二步法制备的结合物产量虽二步法制备的结合物产量虽无提高，但质量均一，活性高。无提高，但质量均一，活性高。27酶标记抗原或抗体的方法酶标记抗原或抗体的方法1.戊二醛法戊二醛法272.2.过碘酸钠法过碘酸钠法 过碘酸钠将酶分子上的糖羟基氧化成醛过碘酸钠将酶分子上的糖羟基氧化成醛基，醛基与抗体（或抗原）中的游离氨基结合基，醛基与抗体（或抗原）中的游离氨基结合形成形成SchiffsSchiffs碱，经碱，经NaBHNaBH还原生成稳定的酶结还原生成稳定的酶结合物。合物。该法快速简便、安全，酶结合物的产率高、该法快速简便、安全，酶结合物的产率高、活性好，已成为目前最常用的酶标记方法活性好，已成为目前最常用的酶标记方法 。28酶标记抗原或抗体的方法酶标记抗原或抗体的方法2.过碘酸钠法过碘酸钠法28硫酸铵盐析法硫酸铵盐析法Sephadex G-200Sephadex G-200凝胶过滤凝胶过滤SPASPA亲和层析亲和层析29酶标记物的纯化硫酸铵盐析法酶标记物的纯化硫酸铵盐析法29酶标抗体工作浓度酶标抗体工作浓度100ng/ml人人IgG系列稀释酶标抗体系列稀释酶标抗体OD值约为值约为1.0时的稀释度时的稀释度包被抗原工作浓度包被抗原工作浓度系列抗原稀释度包被系列抗原稀释度包被加入加入1:100稀释强阳性、稀释强阳性、弱阳性、阴性对照弱阳性、阴性对照加酶标抗人加酶标抗人IgG抗体抗体强阳性强阳性OD值约为值约为0.8，阴性阴性OD值小于值小于0.130最适工作浓度的选择（间接法）最适工作浓度的选择（间接法）酶标抗体工作浓度酶标抗体工作浓度100ng/m参考血清参考血清各抗原稀释度的吸光度值各抗原稀释度的吸光度值1:501:1001:2001:4001:800强阳性强阳性1.261.080.860.680.42弱阳性弱阳性0.680.410.300.220.18阴性阴性0.250.130.050.040.03稀释液稀释液0.090.020.020.020.0431间接间接ELISA法包被抗原工作浓度的选择参考血清各抗原稀释度的法包被抗原工作浓度的选择参考血清各抗原稀释度的包被抗体浓度包被抗体浓度酶标抗体酶标抗体稀释度稀释度各抗原浓度的吸光度值各抗原浓度的吸光度值25ng/ml1.5ng/ml阴性阴性5g/ml1:20001:40001:80003g/ml1:20001:40001:80001g/ml1:20001:40001:800025ng/ml25ng/ml的抗原的抗原ODOD值约为值约为0.80.8，阴性，阴性ODOD值小于值小于0.10.132双抗体夹心法工作浓度的选择双抗体夹心法工作浓度的选择(棋盘法棋盘法)包被抗体浓度酶标抗体稀释包被抗体浓度酶标抗体稀释固相载体的选择固相载体的选择包被包被封闭封闭加样加样保温保温洗涤洗涤显色显色33固相载体的选择固相载体的选择ELISA技术操作要点技术操作要点33n不同批号的试剂盒不要混用。不同批号的试剂盒不要混用。n整个实验过程应尽量建立在干净无整个实验过程应尽量建立在干净无尘的环境下进行。尘的环境下进行。n试剂盒与待检样本使用前必须平衡试剂盒与待检样本使用前必须平衡至室温。至室温。34不同批号的试剂盒不要混用。试剂盒试剂操作前的注意事项不同批号的试剂盒不要混用。试剂盒试剂操作前的注意事项34 酶标板最常用的材料是聚苯乙烯。聚苯酶标板最常用的材料是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。疫学活性。良好的酶标板应该是吸附良好的酶标板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。各孔之间性能相近。35酶标板最常用的材料是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质酶标板最常用的材料是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质 以一定浓度的人以一定浓度的人IgGIgG（一般为（一般为10ng/ml10ng/ml）包被）包被ELISAELISA板各孔，洗涤后每孔内板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人加入适当稀释度的酶标抗人IgGIgG抗体，保温抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度孔读数在吸光度0.80.8左右。计算全部左右。计算全部读数的读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，应小于差，应小于10%10%。36以一定浓度的人以一定浓度的人IgG（一般为（一般为10ng/ml）包被）包被n包被液：包被液：碳酸盐缓冲溶液碳酸盐缓冲溶液(pH=9.6),PBS(pH=9.6),PBS(pH=7.4),Tris-HCl(pH=7.8)(pH=7.4),Tris-HCl(pH=7.8)n包被浓度：包被浓度：100ng/ml-20ug/ml100ng/ml-20ug/mln温度和时间：在温度和时间：在4-84-8过夜或过夜或37 237 2小时小时37包被液：包被液：碳酸盐缓冲溶液碳酸盐缓冲溶液(pH=9.6),PBS(pH=封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。度的无关蛋白质溶液再包被的过程。u0.05%-0.5%0.05%-0.5%的牛血清白蛋白的牛血清白蛋白u10%10%的小牛血清的小牛血清u1%1%明胶明胶u5%5%脱脂奶脱脂奶粉粉38封闭封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关是继包被之后用高浓度的无关 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加样步聚，次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。即加标本，加酶结合物，加底物。4吸头应悬空，避免因吸头碰到小孔边缘或其中吸头应悬空，避免因吸头碰到小孔边缘或其中试剂而造成污染试剂而造成污染4每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染；每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染；4酶结合物工作液和底物可用多道加液器，使加酶结合物工作液和底物可用多道加液器，使加液过程迅速完成。液过程迅速完成。39在在ELISA中一般有中一般有3次加样步聚，即加标本次加样步聚，即加标本3737是实验室中常用的保温温度，也是大多是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度；数抗原抗体结合的合适温度；室温较室温较3737可避免蒸发，为加速反应，可辅可避免蒸发，为加速反应，可辅以摇床振荡；以摇床振荡；抗原抗体反应在抗原抗体反应在44过夜反应更为彻底。过夜反应更为彻底。4037是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适决定着实验的成败决定着实验的成败 4 ELSIAELSIA靠洗涤来分离游离的和结合的酶标记物。靠洗涤来分离游离的和结合的酶标记物。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。于固相载体的干扰物质。常用洗涤液为常用洗涤液为pH7.4 pH7.4 PBS-Tween-20 PBS-Tween-20。4手工洗板时要注意防止气泡产生。手工洗板时要注意防止气泡产生。4洗板机在使用前应进行校正注液量和残留量，注洗板机在使用前应进行校正注液量和残留量，注意管道是否通畅。洗涤时，确认每孔中的洗涤液都意管道是否通畅。洗涤时，确认每孔中的洗涤液都注满微孔，洗涤后，每个孔必须是干的，如果仍有注满微孔，洗涤后，每个孔必须是干的，如果仍有水可倒扣在无尘吸水纸上拍干。水可倒扣在无尘吸水纸上拍干。41决定着实验的成败决定着实验的成败洗洗涤涤41 HRP-TMB HRP-TMB显色系统受光照的影响不显色系统受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。定的适当时间阅读结果。TMBTMB经经HRPHRP作用后，作用后，约约4040分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2 2小小时后即可完全消退至无色。各类酸性终止液时后即可完全消退至无色。各类酸性终止液(2mol/LH(2mol/LH2 2SOSO4)4)则会使蓝色转变成黄色，此时则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（可用特定的波长（450nm450nm）测读吸光值。）测读吸光值。42HRP-TMB显色系统受光照的影响不大，可显色系统受光照的影响不大，可（1 1）已包被抗原或抗体的固相载体；）已包被抗原或抗体的固相载体；（2 2）酶标记的抗原或抗体）酶标记的抗原或抗体(结合物结合物)；（3 3）酶的底物；）酶的底物；（4 4）阴性对照品和阳性对照品）阴性对照品和阳性对照品(定性测定中定性测定中)，参考，参考标准品标准品 (定量测定中定量测定中)；（5 5）标本稀释液；）标本稀释液；（6 6）洗涤液；）洗涤液；（7 7）终止液。）终止液。43ELISA试剂盒（试剂盒（1）已包被抗原或抗体的固相载体；）已包被抗原或抗体的固相载体；（2）酶）酶实验仪器：ELISA操作的标准化 变频振荡器变频振荡器 全自动酶联免疫分析仪全自动酶联免疫分析仪BIORAD550 BIORAD550 酶标仪酶标仪BIORAD1575BIORAD1575洗板仪洗板仪44实验仪器：实验仪器：ELISA操作的标准化操作的标准化(1)(1)在医学检测中的应用在医学检测中的应用病原体及其抗体的检测病原体及其抗体的检测蛋白质的检测蛋白质的检测非肽类激素的检测非肽类激素的检测药物的检测药物的检测毒品检测毒品检测45(1)在医学检测中的应用在医学检测中的应用ELISA技术的应用技术的应用45(2)(2)在食品检测中的应用在食品检测中的应用食品微生物的检测食品微生物的检测食品毒素的检测食品毒素的检测食品中残留农药的检测食品中残留农药的检测食品中残留抗生素的检测食品中残留抗生素的检测转基因食品的检测转基因食品的检测46(2)在食品检测中的应用在食品检测中的应用ELISA技术的应用技术的应用46v与放射免疫测定相比，标记物比较稳定，无与放射免疫测定相比，标记物比较稳定，无放射性的危害。放射性的危害。v与免疫荧光技术相比，结果判定更加客观。与免疫荧光技术相比，结果判定更加客观。v操作简单，易自动化。操作简单，易自动化。v酶标仪普及、价格低廉。酶标仪普及、价格低廉。47与放射免疫测定相比，标记物比较稳定，无放射性的危害。与放射免疫测定相比，标记物比较稳定，无放射性的危害。ELISvO.DO.D值仅在低浓度范围与酶活性呈线性值仅在低浓度范围与酶活性呈线性关系，关系，HookHook效应严重。效应严重。v酶的活性容易失活，使酶的活性容易失活，使ELISAELISA的灵敏度的灵敏度不高。不高。vELISAELISA的大分子标记容易影响被标记物的大分子标记容易影响被标记物的空间结构，使得的空间结构，使得ELISAELISA的灵敏度进一步的灵敏度进一步提高受到限制。提高受到限制。48O.D值仅在低浓度范围与酶活性呈线性关系，值仅在低浓度范围与酶活性呈线性关系，Hook效应严重。效应严重。免免疫疫组组化化技技术术又又称称免免疫疫细细胞胞化化学学，以以酶酶标标记记抗抗体体（或或抗抗原原）用用于于免免疫疫学学检检测测，通通过过相相应应底底物物被被酶酶解解后后的的显显色色反反应应，对对细细胞胞和和组组织织标标本本中中的的抗抗原原抗抗体体复复合合物物进进行行定定位位、定定性性分分析析和和鉴鉴定定。它它把把免免疫疫反反应应的的特特异异性性、组组织织化化学学的的可可见见性性巧巧妙妙地地结结合合起起来来，借借助助显显微微镜镜的的显显像像和和放放大大作作用用，在在细细胞胞、亚亚细细胞胞水水平检测各种抗原。平检测各种抗原。49免疫组化技术又称免疫细胞化学，以酶标记抗体（或免疫组化技术又称免疫细胞化学，以酶标记抗体（或直接法直接法间接法间接法酶桥法酶桥法 PAPPAP法法APAAPAPAAP法法 亲和素生物素方法亲和素生物素方法 50直接法主要类型直接法主要类型50直接法间接法直接法间接法 酶桥法酶桥法PAPPAP法法51主要类型直接法间接法主要类型直接法间接法酶桥法酶桥法PAP法法5180%80%甲甲醇醇+0.3%H2O2+0.3%H2O2处处理理切切片片151530min30min，封封闭闭内内源源性过氧化酶的活性；性过氧化酶的活性；0.05%Tween-20/PBS 0.05%Tween-20/PBS 洗涤；洗涤；0.10.11%BSA1%BSA湿盒内孵育湿盒内孵育151525min25min；加第一抗体（加第一抗体（505080l80l），湿盒内孵育），湿盒内孵育1 12h2h；0.05%Tween-20/PBS 0.05%Tween-20/PBS 洗涤；洗涤；加加HRPHRP酶标记二抗酶标记二抗,湿盒内孵育湿盒内孵育454560min60min；PBSPBS漂洗漂洗3 3次；次；0.010.010.05%DAB0.05%DAB显色显色101015min15min（暗处）。（暗处）。5280%甲醇甲醇+0.3%H2O2处理切片处理切片1530min，封闭内，封闭内5353 放放 射射 免免 疫疫 分分 析析(Radioimmunoassay(Radioimmunoassay，RIA)RIA)19591959年年由由BersonBerson和和YalowYalow创创建建，是是以以放放射射性性核核素素为为标标记记物物的的标标记记免免疫疫分分析析法法，RIARIA将将放放射射性性核核素素分分析析的的高高灵灵敏敏度度与与抗抗原原抗抗体体反反应的特异性相结合，应的特异性相结合，用于测定标本中抗原用于测定标本中抗原或抗体的量。或抗体的量。Rosalyn Yalow,1977 Rosalyn Yalow,197754放射免疫分析放射免疫分析(Radioimmunoassay，RI+Prior to TestLabeled Ag+Test+PatientssampleLabeledAg+55放射免疫分析放射免疫分析(RIA)YY+PriortoTestLa 19681968年年MilesMiles和和HalesHales应应用用放放射射性性核核素素标标记记的的抗抗胰胰岛岛素素抗抗体体检检测测牛牛血血清清中中胰胰岛岛素素获获得得成成功功。为为了了区区别别于于经经典典的的放放射射免免疫疫测测定定(RIA)(RIA)，他他们们将将其其命命名名为为免免疫疫放放射射分分析析(immunoradiometric(immunoradiometric assayassay，IRMA)IRMA)。561968年年Miles和和Hales应用放射性核素标记的应用放射性核素标记的SolidPhaseAgImmobilizedAg in PatientssampleLabeledAb57SolidYAgImmobilizedYAginLabel高比活度高比活度适宜的半衰期适宜的半衰期对抗原和抗体损害小对抗原和抗体损害小容易标记容易标记58高比活度放射性核素的选择原则高比活度放射性核素的选择原则581414C C 和和3 3H H：半衰期长：半衰期长(5730(5730年和年和12.2612.26年年 )，需在，需在真空条件下标记，真空条件下标记，射线测定需要液体闪烁技术，射线测定需要液体闪烁技术，一般实验室不易开展，放射性废物处理困难，应一般实验室不易开展，放射性废物处理困难，应用受限制。用受限制。131131I I和和125125I I ：125125I I化学性质活泼，易标记，含有化学性质活泼，易标记，含有酪氨酸的蛋白质和多肽均可标记酪氨酸的蛋白质和多肽均可标记 ；衰变过程不产；衰变过程不产生生 射线，可以晶体闪烁计数仪直接测量射线，可以晶体闪烁计数仪直接测量 射线；射线；125125I I半衰期长半衰期长(60(60天天)、比活度高、比活度高(95%)95%)较较131131I(I(半半衰期衰期8 8天，比活度仅天，比活度仅20%)20%)更为适用。更为适用。59放射性核素放射性核素14C和和3H：半衰期长：半衰期长(5730年和年和12.26年年直接标记法：标记含酪氨酸的化合物，可将直接标记法：标记含酪氨酸的化合物，可将125125I I直接结合于蛋白质侧链残基的酪氨酸上，此直接结合于蛋白质侧链残基的酪氨酸上，此法法操作简便，反应时间短，标记物的比活度高。操作简便，反应时间短，标记物的比活度高。间接标记法：常用环核苷酸、前列腺素等小分间接标记法：常用环核苷酸、前列腺素等小分子化合物的标记。先将子化合物的标记。先将125125I I标记在载体上，再与标记在载体上，再与蛋白质结合。蛋白质结合。此法操作较复杂，标记蛋白质的此法操作较复杂，标记蛋白质的比活度也低于直接法。但标记反应较为温和，比活度也低于直接法。但标记反应较为温和，可以避免因蛋白质直接加入可以避免因蛋白质直接加入125125I I引起的生物活性引起的生物活性的丧失。的丧失。60125I标记方法分类标记方法分类直接标记法：标记含酪氨酸的化合物，可将直接标记法：标记含酪氨酸的化合物，可将葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 ：SephadexSephadex分子量分子量700 700 1 500 1 500 5 000 5 000 1500150020000 20000 型号型号G10 G10 G15 G15 G25 G25 G50 G50 分子量分子量3000300070000 70000 40004000150000 150000 50005000800000 800000 50005000300000 300000 型号型号G75 G75 G100 G100 G150G150G200 G200 61125I标记物的纯化标记物的纯化葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶：Sephadex分子量分子量1.1.放射性化学纯度放射性化学纯度 是指结合于抗原上的放射性强度占总是指结合于抗原上的放射性强度占总放射性总强度的百分率。一般要求游离碘含放射性总强度的百分率。一般要求游离碘含量占总放射性碘的量占总放射性碘的5%5%以下。标记抗原在贮存以下。标记抗原在贮存过久后会出现标记物的脱碘，如游离碘超过过久后会出现标记物的脱碘，如游离碘超过5 5则应重新纯化去除这部分游离碘。则应重新纯化去除这部分游离碘。62125I标记物的鉴定标记物的鉴定1.放射性化学纯度放射性化学纯度622.2.免疫活性免疫活性 指标记抗原结合于抗体的放射性占总指标记抗原结合于抗体的放射性占总放射性的百分率。方法是用小量的标记抗放射性的百分率。方法是用小量的标记抗原加过量的抗体原加过量的抗体(10(10倍量倍量)，反应后分离结，反应后分离结合部分合部分(B)(B)和游离部分和游离部分(F)(F)，分别测定放射，分别测定放射性，算出性，算出B/TB/T。此值应在。此值应在8080以上，该值以上，该值越大，表示抗原损伤越少。越大，表示抗原损伤越少。63125I标记物的鉴定标记物的鉴定2.免疫活性免疫活性63 3.3.比度：比度：指单位化学量标记物中所含的放射性指单位化学量标记物中所含的放射性强度，即每分子被标记物平均所标记放射性强度，即每分子被标记物平均所标记放射性原子数目，原子数目，Ci/gCi/g、Ci/gCi/g等单位。等单位。643.比度：比度：125I标记物的鉴定标记物的鉴定641.1.平衡饱和法平衡饱和法 指抗原和抗体反应达到再不结合、也不解离指抗原和抗体反应达到再不结合、也不解离的平衡状态，称为饱和状态。操作时在反应管内的平衡状态，称为饱和状态。操作时在反应管内同时加入标准品同时加入标准品(或样品或样品)、标记抗原和特异性抗、标记抗原和特异性抗体，混匀后在一定温度下孵育一定时间，使三种体，混匀后在一定温度下孵育一定时间，使三种成分的反应几率相同。一般来说，平衡法的反应成分的反应几率相同。一般来说，平衡法的反应时间需较长，低温（时间需较长，低温（44）或室温为）或室温为1 1天，但操作天，但操作方便，精密度较好。方便，精密度较好。65抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型1.平衡饱和法平衡饱和法652.2.顺序加样法顺序加样法 将标准品将标准品(或样品或样品)先与抗体一同温育反应一先与抗体一同温育反应一定时间，使抗原与抗体充分结合，甚至达到平衡，定时间，使抗原与抗体充分结合，甚至达到平衡，然后加入标记抗原再短时温育，与剩余的抗体结然后加入标记抗原再短时温育，与剩余的抗体结合，最后分离合，最后分离B B与与F F。此法使非标记抗原与抗体结。此法使非标记抗原与抗体结合形成复合物的几率大于标记抗原，相当于使非合形成复合物的几率大于标记抗原，相当于使非标记抗原具有较高的竞争能力，结果使剂量反应标记抗原具有较高的竞争能力，结果使剂量反应曲线的斜率增加，有利于提高分析的灵敏度。曲线的斜率增加，有利于提高分析的灵敏度。66抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型2.顺序加样法顺序加样法661.1.第二抗体沉淀法第二抗体沉淀法 在抗原与抗体反应后加入第二抗体，形成双抗在抗原与抗体反应后加入第二抗体，形成双抗体复合物。但因第一抗体浓度甚低，其复合物亦极体复合物。但因第一抗体浓度甚低，其复合物亦极少，无法进行离心分离，为此在分离时加入一定量少，无法进行离心分离，为此在分离时加入一定量的与一抗同种动物的血清或的与一抗同种动物的血清或IgGIgG，使之与第二抗体形，使之与第二抗体形成可见的沉淀物，与上述抗原的双抗体复合物形成成可见的沉淀物，与上述抗原的双抗体复合物形成共沉淀。经离心即可使含有结合态抗原（共沉淀。经离心即可使含有结合态抗原（B B）的沉淀）的沉淀物沉淀，与上清液中的游离标记抗原（物沉淀，与上清液中的游离标记抗原（F F）分离。该）分离。该血清或血清或IgGIgG通常称为分析试剂。通常称为分析试剂。67RIAB、F分离方法分离方法1.第二抗体沉淀法第二抗体沉淀法672.2.聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）沉淀法）沉淀法 是以是以PEGPEG溶液代替第二抗体作沉淀剂。在测定不溶液代替第二抗体作沉淀剂。在测定不含有血浆蛋白的样品时，用含有血浆蛋白的样品时，用PEGPEG沉淀剂分离沉淀剂分离B B、F F，必，必须加适量蛋白或正常人混合血清，以增加蛋白的含须加适量蛋白或正常人混合血清，以增加蛋白的含量，便于沉淀。量，便于沉淀。PEGPEG沉淀剂的主要优点是制备方便、沉淀剂的主要优点是制备方便、沉淀完全。缺点是非常特异性结合率比用第二抗体沉淀完全。缺点是非常特异性结合率比用第二抗体为高，且温度高于为高，且温度高于3030时沉淀物容易复溶。时沉淀物容易复溶。68RIAB、F分离方法分离方法2.聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）沉淀法）沉淀法68THANK YOUSUCCESS2024/6/2169可编辑THANKYOUSUCCESS2023/8/1063.PR3.PR试剂法试剂法 是一种将双抗体与是一种将双抗体与PEGPEG二法相结合的方法。二法相结合的方法。此法保持了两者的优点，节省了两者的用量，此法保持了两者的优点，节省了两者的用量，而且分离快速、简便。而且分离快速、简便。70RIAB、F分离方法分离方法3.PR试剂法试剂法704.4.活性炭吸附法活性炭吸附法 小分子游离抗原或半抗原被活性炭吸附，大分小分子游离抗原或半抗原被活性炭吸附，大分子复合物留在溶液中。在抗原与特异性抗体反应后，子复合物留在溶液中。在抗原与特异性抗体反应后，加入葡聚糖活性炭。放置加入葡聚糖活性炭。放置5 510min10min，使游离抗原，使游离抗原吸附在活性炭颗粒上，离心使颗粒沉淀，上清液中吸附在活性炭颗粒上，离心使颗粒沉淀，上清液中含有结合的标记抗原。此法适用于测定类固醇激素、含有结合的标记抗原。此法适用于测定类固醇激素、强心糖苷和各种药物，因为它们是相对非极性的，强心糖苷和各种药物，因为它们是相对非极性的，又比抗原抗体复合物小，易被活性炭吸附。又比抗原抗体复合物小，易被活性炭吸附。71RIAB、F分离方法分离方法4.活性炭吸附法活性炭吸附法71固相分离法固相分离法 利用聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯塑料试利用聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯塑料试管（小珠）作为固相载体，将特异性抗体或管（小珠）作为固相载体，将特异性抗体或抗原直接吸附于管壁（小珠），利用固相抗抗原直接吸附于管壁（小珠），利用固相抗体或抗原分离体或抗原分离B B和和F F。72IRMAB、F分离方法固相分离法分离方法固相分离法72免疫放射分析免疫放射分析放射免疫分析放射免疫分析标记物标记物抗体抗体抗原抗原标记物用量标记物用量过量过量限量限量反应方式反应方式直接结合，反应参直接结合，反应参数与待测抗原量成数与待测抗原量成正比正比竞争性结合，反应竞争性结合，反应参数与待测抗原量参数与待测抗原量成反比成反比反应速率反应速率较快较快较慢较慢B、F分离方分离方法法固相抗体等固相抗体等第二抗体等第二抗体等特异性特异性高高较高较高灵敏度灵敏度高高较高较高73RIA与与IRMA的比较免疫放射分析放射免疫分析标记物抗体抗原的比较免疫放射分析放射免疫分析标记物抗体抗原u所有试剂最好平衡到室温后加样。由于血清所有试剂最好平衡到室温后加样。由于血清标准或样品长时间保存后会出现上稀下浓现象，标准或样品长时间保存后会出现上稀下浓现象，分离剂更是如此，所以试剂包括样品在内加样分离剂更是如此，所以试剂包括样品在内加样前应摇匀。前应摇匀。u不同批号的试剂最好不要混合使用。加样或不同批号的试剂最好不要混合使用。加样或溶解时，注意各试剂之间不要相互污染。溶解时，注意各试剂之间不要相互污染。74所有试剂最好平衡到室温后加样。由于血清标准或样品长时间保存后所有试剂最好平衡到室温后加样。由于血清标准或样品长时间保存后u同次实验要保证所有管中加入的标记物、抗同次实验要保证所有管中加入的标记物、抗体完全一致。当一次检测大量样品时将两瓶或体完全一致。当一次检测大量样品时将两瓶或两瓶以上的标记物混合在一起后加样，以保证两瓶以上的标记物混合在一起后加样，以保证实验的一致性。实验的一致性。u抽吸上清液时，应特别注意不要将沉淀抽走，抽吸上清液时，应特别注意不要将沉淀抽走，否则将严重影响测定结果的准确性。否则将严重影响测定结果的准确性。u对于药盒对于药盒(100(100管管)中提供中提供2 2瓶标记物的多肽类瓶标记物的多肽类产品，一般标记物、标准品稳定性欠佳，要求产品，一般标记物、标准品稳定性欠佳，要求现用现溶，复溶后低温冰冻保存，应尽量减少现用现溶，复溶后低温冰冻保存，应尽量减少液体状态放置的时间。液体状态放置的时间。75同次实验要保证所有管中加入的标记物、抗体完全一致。当一次检测同次实验要保证所有管中加入的标记物、抗体完全一致。当一次检测1 1、放射性（、放射性（125125 I I），对环境的污染及对身体的），对环境的污染及对身体的危害，该方法已经为重视环保的国家逐步取消。危害，该方法已经为重视环保的国家逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个放免试验室）（如整个欧洲仅尚存几个放免试验室）2 2、125 125 I I 的半衰期短而导致其试剂有效期短。的半衰期短而导致其试剂有效期短。3 3、标记物、标记物125125 I I 的稳定性差，导致试剂盒批间、的稳定性差，导致试剂盒批间、批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费。次定标，造成浪费。4 4、操作繁琐，出报告时间长。、操作繁琐，出报告时间长。5 5、无法保存备用。、无法保存备用。761、放射性（、放射性（125I），对环境的污染及对身体的危害，该方法），对环境的污染及对身体的危害，该方法u以以荧荧光光物物质质标标记记抗抗体体进进行行抗抗原原定定位位称称为为荧荧光光抗体法；抗体法；u用用已已知知的的荧荧光光抗抗原原标标记记物物示示踪踪或或检检查查相相应应抗抗体的方法称为荧光抗原法。体的方法称为荧光抗原法。u用用免免疫疫荧荧光光技技术术显显示示和和检检查查细细胞胞或或组组织织内内抗抗原原或或半半抗抗原原物物质质等等方方法法称称为为免免疫疫荧荧光光细细胞胞（或或组织）化学技术。组织）化学技术。77以荧光物质标记抗体进行抗原定位称为荧光抗体法；三、免疫荧光技以荧光物质标记抗体进行抗原定位称为荧光抗体法；三、免疫荧光技能与蛋白质分子形成共价键，结合后不易解离，未能与蛋白质分子形成共价键，结合后不易解离，未结合及其降解产物易清除；结合及其降解产物易清除；荧光效率高，与蛋白质结合仍保持较高的效率；荧光效率高，与蛋白质结合仍保持较高的效率；荧光的颜色与背景组织的颜色对比鲜明荧光的颜色与背景组织的颜色对比鲜明结合蛋白质后，不影响其活性结合蛋白质后，不影响其活性标记方法简单、结合物稳定，易于保存；标记方法简单、结合物稳定，易于保存；安全无毒，不具有附加的抗原性。安全无毒，不具有附加的抗原性。78能与蛋白质分子形成共价键，结合后不易解离，未结合及其降解产物能与蛋白质分子形成共价键，结合后不易解离，未结合及其降解产物 u异异硫硫氰氰酸酸荧荧光光素素（黄黄），FITCFITC，应应用用最最广广泛泛,呈黄绿色荧光，分子量为呈黄绿色荧光，分子量为389.4389.4。u四四乙乙基基罗罗丹丹明明，RB200RB200，荧荧光光效效率率低低，多多用用于于FITCFITC的衬比染色或双标记，橙色荧光的衬比染色或双标记，橙色荧光u四四甲甲基基异异硫硫氰氰酸酸罗罗丹丹明明，TRITCTRITC，发发橙橙红红色色荧荧光光 。u藻藻红红蛋蛋白白，PEPE，发发橙橙色色荧荧光光 ，荧荧光光强强度度比比FITCFITC强强1919倍。倍。79异硫氰酸荧光素（黄），异硫氰酸荧光素（黄），FITC，应用最广泛，应用最广泛,呈黄绿呈黄绿 1.Marsshall1.Marsshall方法方法 u依据欲标记的蛋白总量依据欲标记的蛋白总量(溶于生理盐水或碳酸盐溶于生理盐水或碳酸盐缓冲液缓冲液 )，按每毫克蛋白加，按每毫克蛋白加0.01mgFITC0.01mgFITC。u边搅拌边将称取的边搅拌边将称取的FITCFITC粉末逐渐加入球蛋白溶液粉末逐渐加入球蛋白溶液中（中（510min510min内加完），加完后内加完），加完后44持续搅拌持续搅拌1218h1218h。u结合完毕后，将球蛋白溶液结合完毕后，将球蛋白溶液2500r/min 2500r/min 离心离心20min20min，取上清装入透析袋中，用，取上清装入透析袋中，用pH8.0pH8.0缓冲盐水透缓冲盐水透析（析（0404）过夜。）过夜。u取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶G-25G-25或或G-50G-50柱，分离游离柱，分离游离FITCFITC，。，。80荧光的标记荧光的标记1.Marsshall方法方法80 2.Chadwick2.Chadwick方法方法 u用用04 pH8.0 PBS04 pH8.0 PBS溶液将球蛋白溶液稀释至浓溶液将球蛋白溶液稀释至浓度为度为3040mg/ml3040mg/ml，后冰浴。，后冰浴。u按每毫克蛋白加入按每毫克蛋白加入FITC 0.01mgFITC 0.01mg，用，用3%3%重碳酸钠重碳酸钠水溶液溶解。水溶液溶解。u将准备的抗体与将准备的抗体与FITCFITC等量混合，充分搅匀后，在等量混合，充分搅匀后，在0404冰浴结合冰浴结合1824h1824h。u透析和层析同透析和层析同MarshallMarshall方法。方法。81荧光的标记荧光的标记2.Chadwick方法方法81免疫荧光技术反应类型免疫荧光技术反应类型82免疫荧光技术反应类型免疫荧光技术反应类型82 滴加适当稀释的荧光标记的抗滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，保温体溶液，保温30min30min。取出玻片，先用取出玻片，先用PBSPBS冲洗后，再冲洗后，再按顺序过按顺序过PBSPBS溶液三缸浸泡，每溶液三缸浸泡，每缸缸3-5 min3-5 min，不时振荡。，不时振荡。取出玻片，用滤纸吸去多余水取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，缓冲甘分，但不使标本干燥，缓冲甘油封固，荧光显微镜观察油封固，荧光显微镜观察 。AgFluorochromeLabeled AbTissue Section83直接法滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，保温直接法滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，保温30m 标本自发荧光对照：标本加标本自发荧光对照：标本加1 12 2滴滴0.01mol/L pH7.40.01mol/L pH7.4的的PBSPBS。特异性对照（抑制试验）：标本加未特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。特异性抗体。阳性对照：已知的阳性标本加荧光标阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。记的特异性抗体。84直接法需设置的对照直接法需设置的对照标本自发荧光对照：标本加标本自发荧光对照：标本加12 滴加适当稀释的抗体，滴加适当稀释的抗体，3737保温保温30min30min。取出玻片，先用取出玻片，先用PBSPBS冲洗冲洗1 12 2次，然次，然后按顺序过后按顺序过PBSPBS三缸浸泡，每缸三缸浸泡，每缸5min5min，不时振荡，不时振荡 。取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴一定稀释度荧光标记的抗人球加一滴一定稀释度荧光标记的抗人球蛋白抗体。蛋白抗体。3737保温保温30min30min。重复操作重复操作2 2。取出玻片，用滤纸吸去多余水分，缓取出玻片，用滤纸吸去多余水分，缓冲甘油封固，荧光显微镜观察冲甘油封固，荧光显微镜观察 。AgAgFluorochromeFluorochromeLabeled Anti-IgLabeled Anti-IgTissue SectionTissue Section85间接法滴加适当稀释的抗体，间接法滴加适当稀释的抗体，37保温保温30min。A 阳性对照：阳性血清阳性对照：阳性血清+荧光标记物。荧光标记物。阴性对照：阴性血清阴性对照：阴性血清+荧光标记物。荧光标记物。荧光标记物对照：荧光标记物对照：PBS+PBS+荧光标记物。荧光标记物。阳性阳性对照对照阴性阴性对照对照86间接法需设置的对照间接法需设置的对照阳性对照：阳性血清阳性对照：阳性血清+荧光标记物荧光标记物 吸取经适当稀释的免疫血清及补体等量混吸取经适当稀释的免疫血清及补体等量混合液滴于切片上，合液滴于切片上，3737作用作用30min30min。用缓冲盐水洗用缓冲盐水洗2 2次，每次次，每次5min5min，吸干标本，吸干标本周围水液。周围水液。滴加经过适当稀释的抗补体荧光抗体，滴加经过适当稀释的抗补体荧光抗体，3737作用作用30min30min，水洗同上。，水洗同上。蒸馏水洗蒸馏水洗1min1min，缓冲甘油封固，荧光显微，缓冲甘油封固，荧光