微生物限度检查法培训课件

微生物限度微生物限度检查法法1微生物限度检查法概述2我国药品微生物限度标准的发展情况3我国药品微生物限度检验方法的发展情况4微生物限度检查法所需的材料5微生物限度检查试验用物品的准备6无菌室技术要求7细菌、霉菌与酵母菌的检查方法供试品的抽样、保存及检验量试验操作前的准备供试液的制备对照用菌液的制备2微生物限度检查法菌数测定阴性对照试验细菌、霉菌（酵母菌）检验程序供试液的稀释（10倍递增稀释法）注平皿倾注培养基培养菌落计数菌数报告规则注意事项8.细菌、霉菌（酵母菌）的其他检查方法管稀释法（试管法、MPN法）滤膜法计数板法仪器法平板涂布法3微生物限度检查法表面涂抹平板法滤膜培养法酵母菌镜检计数法9.大肠杆菌检查法概述、原理检验程序增菌培养分离培养纯培养、革兰染色、镜检生化试验（IMViC）实验中的注意事项10沙门菌检查法11铜绿假单胞菌检查法12金黄色葡萄球菌检查法13破伤风梭菌检查法14活螨检查法15结果判断4微生物限度检查法1微生物限度检查法的意义药品是防病治病、关系用药者生命健康的特殊商品，必须保证其质量，用药的安全与有效。微生物污染药品引起的药源性疾病屡见不鲜，在国内外均有报道。为保证药品质量，必须对微生物污染进行必要的控制和检验。其意义在于：已有许多实例表明，药品污染微生物不仅危及病人用药安全，而且也直接影响药品的有效性，所以药品卫生质量是药品质量不可分割的部分。反映药品生产工艺的科学性、合理性及质量管理水平。通过检验，凡工艺条件、生产管理水平、生产人员的素质差，不注意文明生产的单位和企业，其生产的药品，染菌必然严重，不合格率无疑就高。微生物限度的检验是提供药品卫生质量状况的重要依据，因而保证销售与使用过程中药品的有效性与安全性，是促进与提高生产单位全面质量管理水平与提高药品质量的重要依据。微生物限度检查法概述5微生物限度检查法2微生物限度检查的范围根据药品使用的要求，可划分为两大类：规定灭菌的药品：包括注射剂和输液剂，及用于体腔、严重烧伤、溃疡、出血及眼科用药等制剂。非规定灭菌药品：包括常用的口服制剂与一般外用制剂。对这一部分制剂一般不要求绝对无菌，允许一定限量的微生物存在，但同时规定不得有可疑致病的细菌存在。由于致病菌的范围很广，各国药典都规定了几个常见的致病菌或指标菌作为控制菌。在非规定灭菌的制剂中，对每克或每毫升的药品按剂型或品种不同规定：染菌量检查：包括细菌数、霉菌数及酵母菌数测定，以检查这几类微生物对药品的污染程度。控制菌检查：包括大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌的检查等。6微生物限度检查法3药品微生物限度检查抽样量与检验量药品微生物限度检验中的困难，最根本的原因在于检验对象本身的特殊性。药品微生物限度检验对象的特性：不确定性：药品受外来微生物的污染，这种污染是可无可有；在有中又可多可少；其种类可以多样。污染的情况可依生产、设备、原材料、管理、剂型等条件而定，非药品本身所固有。所以微生物限度检查的对象是不确定的。药品所规定的检查项目，除无菌检查、热原检查具有上述性质，其他项均无此特征。这一点往往被忽视。污染对药品而言是一个意外事件。污染批号中的不合格品是一个随机变量。分布的不均匀性：不均匀性是不确定性的另一种表现形式，在一个批号内产品有的被污染，有的不被污染，分布不匀；在被污染的部分中有的数量极多，有的较少，种类上可以复杂或较单一。这种不均匀性源于污染源的复杂性；原辅料污染、工艺污染、空间污染7微生物限度检查法和操作人员污染等等构成污染量的多少差异，形成不均态。再者，微生物具有簇团性；簇团大小、紧密程度是可遗传的，簇团的分散性差异极大，该特点无疑强化了不均匀性。活体特征：药典中以活的微生物作为检验对象也是独特特性。由于以上特殊性，抽样对微生物限度检测值将产生很大的影响。当药品无污染时，抽样将不影响检验，当批产品存在污染品时，抽样的样本是随机变量，抽样的影响如下：抽样方法：不同的抽样方法对批产品总体的代表性是不同的，测定值也是有差异的。如抽取可疑样品与随机抽样，其检出率与数字显然前者大于后者。抽样量：抽样量的多少，对样本的代表性极为重要，如含10不合格率的批产品，从中抽取2件数为样本进行控制菌检验时，有81机率判定为合格品，而抽取30件数时，会有96机率判定为不合格品。8微生物限度检查法以上表明抽样方法、抽样数量、抽样次数均影响测定结果。以控制菌检验为例，决定染菌检出与否必须具备两个条件：（A）样品是否是含染菌的样品；（B）检验操作正确无误，其中（A）是前提条件。中国药典2000年版关于抽验方法与抽样数量规定：供试品为随机抽样，一般抽样量为检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量。对异常的供试品应针对性的抽样，对外观可疑污染或对有争议复验的样品应抽取可以污染和有争议复验的原样品。对异常的供试品应针对性的抽样，对外观可疑污染或对有争议复验的样品应抽取可以污染和有争议复验的原样品。凡能从药品、瓶（外盖内侧及瓶口周围）外观看出发霉、生虫以及变质的药品不必再继续检验，应直接判为不合格。不能以有时外观有上述情况而检验内容为合格，来判定该药品合格，因为瓶口染菌，对服用者是不安全的，如自瓶口直接服药时，所染菌随之进入人体，同时发现瓶口一旦染菌，瓶内药液最终要受到污染。检验量与抽样量是两种不同范畴的量，后者指从全批产品9微生物限度检查法（或抽样全过程）抽取的单位包装，前者是指检验用量，一般抽样量大于检验量。检验量只是抽样量各包装的混合样品的一部分。中国药典2000年版规定检验量为每次最少应分取两瓶（盒）以上的样品共10克或10毫升，中药蜜丸至少应分取4丸以上共10克。目前我国以1克或1毫升、膜剂以10cm2作为报告单位；英美药典及欧洲药典也是以1克或1毫升作为限量，但控制菌有的是以10克或10毫升作为限量，比我国的限量规定严格。总之，抽样量和检验量大小对检验结果影响较大（尽管目前抽样方案还存在不科学，漏检率高）。由于药品微生物检验是破坏性检验，检验1瓶（盒）会破坏1瓶（盒），检验量愈大，则破坏性愈大，尤其对贵重药品，生产单位、经营单位损失也就越大。因此，如何确定适宜的既能满足抽样检验基本要求，又能使生产、经营者可接受的抽样方案，是目前需要解决的问题。但目前的规定必须遵循，不能随意变动，尤其不能减少（除对贵重、微量包装的药品可酌情减少检验量除外）。10微生物限度检查法微生物限度检验方法的发展情况11980年我国药品微生物限度检验工作正式发行药品卫生检验方法。21984年出版第二版药品卫生检验方法。31990.12年中检所出版第三版，主要对原方法中各地反映意见较多的问题进行了改写；增加了部分检验方法和供试液的制备方法；为了同国内外检验方法相协调，对某些内容作了相应的更改，此外，还参照国家标准的编写格式作了编排。41990年版药典第二增补本收载了微生物限度检查法。这也是我国首次在药典上收载此方法。51995年版药典也收载了此检查法，少数剂型收载了限度规定。（20个化学药品规定限度）。11微生物限度检查法6、2000年版药典一、二部同时收载了检查法和限度标准。首次把微生物限度检查法和限度标准同时发布。12微生物限度检查法微生物限度标准发展情况11972年开展此项工作21978年颁布我国第一个“药品卫生标准”31986年颁布修改后的“药品卫生标准”，1987年12月1日起供内部执行41989年下达“药品卫生标准补充规定和说明”51990年版药典第二增补本收载了20个化学药品种的微生物限度标准规定，与国际惯例一致61995年版药典少数几个剂型（滴眼剂等）收载了微生物限度。规定按微生物限度检查法检查不得有菌生长72000年版药典按剂型、中西药分类规定微生物限度，还对几个生化药品在各论中项下作了具体规定13微生物限度检查法实验所用的培养基营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）胆盐乳糖培养基（BL）4甲基伞形酮葡糖苷酸蛋白胨培养基（MUG）乳糖培养基5乳糖培养基蛋白胨水培养基磷酸盐葡萄糖胨水培养基枸橼酸盐培养基曙红亚甲蓝琼脂（EMB）麦康凯琼脂（MacC）营养肉汤14微生物限度检查法微生物限度检查常用检验设备及器材恒温培养箱3035361霉菌培养箱2528恒温水浴箱451净化工作台生物显微镜1500X体视显微镜或放大镜电冰箱电热干燥箱250300高压蒸汽消毒器电子天平或药物天平感量0.1g匀浆仪或研钵锥形瓶100ml，250ml，500ml，1000ml15微生物限度检查法直形吸管1ml，10ml量杯10ml试管18x180mm，13x200mm，30 x200mm试管筒培养皿9cm培养皿筒陶瓦盖12cm量筒100ml，500ml，1000ml滤器及微孔滤膜孔径0.450.02um注射器1ml，5ml，10ml，30ml载玻片及盖玻片接种针及接种环试管架16微生物限度检查法乙醇灯康氏振荡器离心机5004000min紫外灯365nm玻璃或搪瓷消毒缸（带盖）大、小橡皮乳头乙醇棉球或碘伏棉球灭菌剪刀、镊子、钢锥灭菌称样纸灭菌不锈钢药匙火柴、记号笔（玻璃铅笔）白瓷盘、洗手盆实验记录纸17微生物限度检查法细菌、霉菌与酵母菌的检查方法（平皿菌落计数法）（一）供试品的抽样、保存及检验量1供试品应随机抽样。一般抽样量（2个以上最小包装单位）为检验量的3倍量。2对异常的供试品应针对性的抽样。抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）、外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需在抽样检验。不能以外观有上述情况而检查内容物合格，来判断该药品合格。3供试品收检后应及时检验，若有困难，应存放在该品种规定的储存条件下（一般为阴凉干燥处），勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死、损伤或繁殖。18微生物限度检查法4供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。5供试品的取样必须在净化条件下无菌操作，严防再污染。（原料药、装量大的药）6有剂型检验量均需取自2个以上包装单位（中药蜜丸、膜剂，除需取自2个以上包装外，还应取4丸、片以上样品）。7固体及半固体（粘稠性供试品）制剂检验量为10克。8液体制剂检验量为10毫升。9膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为3050cm2，化学膜剂及生化药膜剂检验量为100cm2。10贵重的或微量包装的供试品检验量可以酌减，除另有规定外，口服固体制剂不低于3克，液体制剂采用原液者不得少于6毫升，采用供试液者不得少于3毫升，外用药品不得少于5克619微生物限度检查法（二）实验操作前的准备1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、研钵、吸管（1ml10ml）、量筒、稀释剂等移至无菌室内。每次实验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。编号后将全部外包装（牛皮纸、布）取掉。另外还有增菌液、培养基（营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基，保持在45左右的水浴中）、MUG培养基试管等.湿热灭菌的物品称量纸、手术镊子、剪子等.干热灭菌的物品2开启无菌室紫外杀菌灯和空气净化装置，并使其工作不少于30分钟。3操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩。20微生物限度检查法4操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。（三）供试液的制备（1：10供试液）按供试品的理化特性与生物学特性采取适宜的方法制备供试液。不得改变污染微生物的数量和种类。1液体供试品取供试品10ml，加入到稀释剂90ml中，混匀，作为供试液。（有的书上讲取10ml，置灭菌锥形瓶中，加入90ml稀释剂，摇匀）。油剂可加适量聚山梨酯80；21微生物限度检查法气雾剂、喷雾剂供试品将供试品置冰室内2hr后，取出，用灭菌钢锥小心钻孔，使抛射剂缓慢释放，然后用灭菌注射器加入稀释剂，混匀后吸取相当于10g或10ml供试品，再稀释成1：10供试液。USPXXIV规定是抛射剂导出后，吸取10ml或取10g供试品，加稀释液使成100ml。合剂（系指含蜂蜜或王浆者）与滴眼剂可用供试品作为供试液。（滴眼剂不得检出霉菌和酵母菌）。含蜂蜜、王浆的制剂2固体、半固体或粘稠供试品称取供试品10g，置装有0.9无菌氯化钠100ml的匀浆杯中，用匀浆仪（30005000r24min），或其他适宜方法（振荡器或研钵研磨等方法分散混匀，作为供试液。在制备过程中，必要时可加适量聚山梨酯80，并适当加温，但不应超过45。22微生物限度检查法3非水溶性供试品软膏剂、乳化剂称取供试品5g(5ml)，加入含已灭菌熔化并保温45左右的司盘8050g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯8010g混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45左右的0.9无菌氯化钠溶液约80ml，（实际测可能是85ml），边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为供试液（1：20）。油剂取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯8058ml，摇匀，再加入稀释剂至100ml。栓剂称取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量稀释剂，置45左右水浴保温10min，使溶，加入无菌聚山梨酯8058ml，振摇使之乳化，再加稀释剂（稀释剂和聚山梨酯80总量为100ml），摇匀23微生物限度检查法茶剂取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂100ml，振摇30秒，以灭菌纱布过滤（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1：10加稀释剂，浸泡30分钟）。胶丸剂（如鱼肝油丸等）同胶囊剂胶剂（如阿胶）取胶剂若干，捣碎，称取10g，再用研钵研细，转入250ml锥形瓶内，加入稀释剂100ml，置451水浴中，振摇使溶，即为1：10供试液。胶丸剂（如鱼肝油丸等）同胶囊剂胶剂（如阿胶）取胶剂若干，捣碎，称取10g，再用研钵研细，转入250ml锥形瓶内，加入稀释剂100ml，置451水浴中，振摇使溶，即为1：10供试液。24微生物限度检查法4含抑菌成分供试品（仅限检查控制菌时用）凡含防腐剂或抑菌成分且影响检验（供试品按常规检查法，加入规定量的对照菌，不能检出时）的供试品，可根据供试品的性质，控制菌的特性及检验条件等按以下方法之一或两种以上方法联合应用处理后，依法检查。同时做阳性和阴性对照。药典规定：供试品如干扰控制菌检验，按以下方法处理后，依法检查。实际操作中：先把供试液离心（500r/min5min）这样菌体在上层，吸取上清液过滤，把滤膜直接贴在培养基上培养即可，具体吸取上清液10ml还是100ml按品种要求自己定。取10ml过滤测出来的是个克，取100ml过滤测出来的是个10克。（限度检查）稀释法：将供试品种入较大量的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度（使该供试液稀释至阳性对照菌能生长的浓度）。此法用作控制菌检查和限度检查。本法适用于抑菌作用不强的中药、化学药品的检验。25微生物限度检查法离心沉淀集菌法：取规定量的供试液于无菌刻度离心管中，离心（每分钟3000转）30分钟，弃去上清液，留底部集菌液约2ml，再稀释成原规定的供试液。如有不溶性药渣，可先离心（每分钟500转）5分钟，取全部上层液，再行集菌处理。本法适用于一些抑菌作用不强的中、西药品，如蜜丸、水丸、片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂及液体制剂。应用本法需严防操作污染，并注意上层液或上清液和底部残渣的分离，避免沉渣混入其中。薄膜过滤法：取规定量的供试液，置稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45um0.02um的微孔滤膜过滤器中，减压抽干后，用稀释剂冲洗滤膜3次，每次50100ml，取出滤膜备检。冲洗时每次最好不少于100ml，可以将培养基加入滤器或取出滤膜，加入增菌培养基中，可以用加入滤器中供试品的量来控制检验量，也可以把滤膜取出来剪成24片，使每片相当于供试品1g或1ml，放入增菌培养基中，作控制菌检验。26微生物限度检查法本法适用于水溶性抑菌成分的中、西药品和滴眼剂等制剂的“灭活”处理。安放滤膜时，注意滤膜与滤器应密合，防止滤膜破损、漏液。本法所用滤膜孔径0.45um0.02um。（钝化）中和法：凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品，可用相应的试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试液。磺胺类药物中和法取规定量含磺胺类的供试品，于100ml增菌液中加入含1对氨基苯甲酸约15ml（以前讲加入0.5ml）。本法用于含磺胺较少的制剂，如：三黄软膏、消炎眼药水、斑马眼药水等。应用本法可因供试品的不同，对氨基苯甲酸的用量可适当调整。含砷、汞等重金属药物中和法，取规定量的供试品，加入硫乙醇酸盐培养基100ml中，作增菌培养。27微生物限度检查法本法适用于含重金属盐类药物的检验，如磺胺嘧啶银软膏等。含洗必泰等防腐剂的供试品中和法，取规定量的供试品，加入含适量聚山梨酯80等表面活性剂的100ml增菌液中（表面活性剂的用量应预试，用量过大有抑菌作用）。本法适用于洗必泰含片、洗必泰栓、霉滴栓剂及其它含抑菌成分的供试品。应用本法需注意，由于供试品不同，表面活性剂的用量应预试，用量不宜过大，否则本身易产生抑菌作用。沉降法：（药典上没收载此法）取规定量的供试液，自然沉降5分钟，取上层液于100ml增菌液中，作增菌培养。本法用于单一成分固体制剂如磺胺嘧啶片。取规定量的供试液，自然沉降5分钟，吸取上层液于（含1对氨基苯甲酸1ml）100ml增菌液中，作增菌培养。本法适用于复方磺胺制剂，如复方磺胺嘧啶片、复方新诺明片等28微生物限度检查法以上两法适用于难溶于水的抗菌制剂。如磺胺类药应用沉降法时，供试品应充分研细，并与稀释剂充分摇匀，使污染菌分散于液相中；沉降时间不宜超过5分钟，以防菌细胞下沉；取上清液时，避免吸入药渣。（四）对照用阳性菌液控制菌检查均应作相应已知菌的阳性对照试验。对照菌株为大肠杆菌CMCC(B)44102、沙门菌CMCC(B)50094、铜绿假单胞菌、CMCC(B)10104及金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003制备：取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，培养1820小时后，稀释至1：106。对照菌的加入量为50100个。CMCC医学微生物菌种保藏管理中心。国内药品微生物检验所用的菌种主要是CMCC(B)、CMCC(F)菌号，B(bacteria)代表细菌，F(fungi)代表真菌。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供这些干燥菌种。29微生物限度检查法（五）平皿菌落计数法取均匀供试液，进一步稀释成1：1021：103等适宜的稀释级。分别取连续三级10倍稀释的供试品液各1ml，置直径约9mm的平皿中，再注入约45的培养基约15ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释级应作23个平皿。营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。在特殊情况下，前者同时点记霉菌、酵母菌菌落数，后者同时点记细菌菌落数。酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。含蜂蜜、王浆的制剂用玫瑰红钠琼脂培养基与酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基分别测定霉菌、酵母菌菌落数，合并计数。含糖的液体及半固体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基同时点计霉菌菌落数及酵母菌菌落数。（六）菌数测定阴性对照试验取供试验用的稀释剂各1ml，置4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养，检查，不得长菌。（七）检验程序30微生物限度检查法细菌、霉菌（酵母菌）检验程序31微生物限度检查法32微生物限度检查法33微生物限度检查法34微生物限度检查法（八）供试液的稀释（10倍递增稀释法）取23支灭菌试管，分别加入9ml灭菌稀释剂。另取1支1ml灭菌吸管吸取1：10均匀供试液1ml，加入装有9ml灭菌稀释剂的试管中混匀，即得1：100供试液。依此类推，根据供试品的污染程度，可稀释至1：103、1：104等适宜稀释级（至少共三级）。一般取1：101：1021：103三级稀释液检验。每递增一个稀释级，必须另换一支吸管。在作10倍递增稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，再沿第2支稀释管的内壁靠近液面（勿接触液面）缓慢地吹出全部供试液（吸管内应无粘附或残留液体），然后将吸管放入消毒液缸内。35微生物限度检查法（九）注平皿在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取各级稀释液各1ml至每个平皿中，每一稀释剂注23个平皿。（此时，一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注平皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。同时做阴性对照（待各级稀释液注皿完成后，用一支1ml吸管吸取稀释剂各1ml，分别注入4个平皿中。其中两个作细菌阴性对照；另2个作霉菌、酵母菌阴性对照，如另用YPD琼脂测定酵母菌数时，再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照）。（十）倾注培养基将预先配制好的培养基（细菌计数用营养琼脂，霉菌、酵母菌计数一般用玫瑰红钠琼脂，含蜂蜜、王浆液体制剂另加用YPD琼脂）溶化，冷至约45时，36微生物限度检查法倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速旋转平皿，使试液与培养基混匀，（注意，混匀时切勿将培养基溅到平皿边及皿盖上），置操作台上待凝。（十一）培养细菌计数平板倒置于3035培养箱中培养48h，霉菌、酵母菌计数平板于2528培养箱中培养72h。（十二）菌落计数1细菌培养时间为48小时，分别在24小时及48小时点记菌落数，一般以48小时菌落数为准，霉菌、酵母菌培养时间为72小时，分别在48小时及72小时点记菌落数，一般以72小时菌落数为准。菌落如蔓延生长成片，此平板不宜计数。点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。37微生物限度检查法2一般将平皿置菌落计数器或从平皿的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落与霉菌菌落和酵母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等的区别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。如仍难区别，可延长培养时间47天，细菌菌落常会生长增大而加以区别。3供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点记在细菌、霉菌和酵母菌数内。排除的方法须按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征及染色形态。4供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，（特别是1：10级别）培养基注皿后亦可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多且难与菌落用肉眼相区别的有形物。为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿38微生物限度检查法（12个平皿），注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作为对照。或用0.001TTC营养琼脂注皿，经培养后可将细菌菌落与其他有形物区别开来。0.001%TTC肉汤琼脂培养基（0.001%2、3、5氯化三苯四氮唑琼脂），在每1000ml营养琼脂内加入灭菌的1TTC溶液1ml混匀后倾注平皿，防止菌落蔓延。有些软膏等非水溶性供试品，经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的菌落不易辨认和点计，为防止这种情况，也可用0.001TTC营养琼脂注皿，经培养后生长的菌落为红色，衬以白色背景上易于点计。5若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个菌落或2个以上菌落计数；若平板生长有链状菌落，菌落间无明显界限，一条链作为一个菌落计，但若链上出现性状与链状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延较大的片状菌落或花斑样菌落，一般不宜作为计数用。39微生物限度检查法附表：细菌、霉菌、酵母菌形态特征比较（营养琼脂及玫瑰红钠琼脂平板）40微生物限度检查法6如同一稀释级2个平板菌落数超过1倍以上，不应计数，菌落蔓延成片不应计数。7当2个平板菌落数均在15（含15）以下时，按菌落计数的Poisson分布菌数的95%可信限计。二个平板最大差值分别在04，17，29，310，412，514，615，以上各数分别为菌落平均值1、2、3、4、5、6、7的上限及下限，超出以上限度，视为操作误差，不得作为计数依据。每个稀释级使用3个平板时，平板菌落数均在10个以下的情况。03，15，27，39，410，512，613，714。8对有疑议的供试品以YPD培养基作酵母菌计数时，可培养至1周再点计菌落数。（十三）菌数报告规则1细菌数选取平均菌落数在30300（国外近年有选取25250的趋向）之间的稀释级，霉菌、酵母菌选取平均菌落数在30100之间的稀释级作为报告菌41微生物限度检查法数计算的依据。如只有1个稀释级平均菌落数在30300（30100）之间，则将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告。2如有2个相邻稀释级平均菌落数在30300（30100）之间时，则按比值计算。当比值2时，则以2个稀释级的均值报告。当比值2时，则以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告。比值（高稀释级平均菌落数稀释倍数）（低稀释级平均菌落数稀释倍数）3如有3个稀释级平均菌落数均在30300（30100）之间时，则以后2个稀释级计算级间比值报告。4如各稀释级平均菌落数均在300（100）以上，则按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在30以下，一般则按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。42微生物限度检查法5如各稀释级平均菌落数均不在30300（30100）之间，则以最接近30或300（100）的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。6如各稀释剂的平板均无菌落生长或仅最低稀释级平均菌落数小于1时，则报告菌数为小于10个g或ml。如供试品原液平板均未生长霉菌及酵母菌，则报告未检出霉菌及酵母菌ml。7当各稀释级平均菌落数均小于30时，如高稀释级平均菌落数大于或等于低稀释级平均菌落数时，应以培养基稀释法重新测定，按测定结果报告菌数。培养基稀释法：取低稀释级供试液（原液或1：10供试液）3份，每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿中（每皿0.2ml或0.2ml)，每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。5个或5个以上平板点计的菌落数之和，即为每1ml菌落数，共得3组数据。以3份低稀释级供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。43微生物限度检查法8结果报告菌落数在100以内时，按实有数报告。菌落数大于100时，取两位有效数字报告，第三位按数值修约规则处理。复试供试品细菌数、霉菌数及酵母菌数其中任一项一次检验不合格，应重新取2倍包装量供试品，依法作单项复试两份，以三次检验结果的平均值报告。44微生物限度检查法（十四）注意事项1供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用灭菌用具时，不能接触可能污染的任何器物，灭菌吸管不得用口吹吸。2从供试品稀释至倾注琼脂培养基操作应在1小时内完成，避免由于时间过长导致菌细胞繁殖或死亡。3供试液稀释及注皿应取均匀的供试液，以免造成实验误差。4为避免细菌菌落蔓延生长，宜采取下列方法处理：开盖干燥换陶瓦盖加TTC(0.001%)5在净化工作台上操作时，应避免双手来回出入工作台；在无菌室操作时，应避免操作者来回出入无菌室。45微生物限度检查法细菌、霉菌及酵母菌的其他检验方法（一）细菌计数其他测定方法细菌计数除平板菌落计数法外，还有其他方法，大体上可分两大类：1活菌计数包括试管稀释法、滤膜法、毛细血管法等前者是液体培养法，后两者是固体培养法。其特点都是检测具有繁殖能力的细菌数。2总菌数计数法是以细菌（或其它菌类）的形态特征检测细菌总数，包括无生殖能力的菌细胞在内。试管稀释法（试管法、MPN法）46微生物限度检查法滤膜法（BP、JP已收载此法）计数板法（采用血球计数板或其它计数板进行细菌计数）仪器法（应用仪器测定菌数是现代菌数检测技术的一种发展动向。细菌细胞则属不导电的粒子，可被计数）平板涂布法（二）霉菌、酵母菌数测定的其他方法1表面涂抹平板法本法适用于污染比较严重的供试品2滤膜培养法3酵母菌镜检计数法血球计数板或其它的计数板进行酵母菌计数47微生物限度检查法大肠杆菌检查法大肠杆菌即大肠埃希菌(Escherichiacoli)，为肠杆菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希菌等四个种（有的资料说五种）。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠杆菌，表明该样品受到了人和温血动物粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠杆菌外尚有致病性大肠杆菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠杆菌。用4甲基伞形酮葡糖苷酸(4MethylumbelliferylDglucuronide，即MUG)和靛基质（Indole）试验检验大肠杆菌是一项新技术，专一性强，试验证明94大肠埃希菌MUG阳性，且在大肠埃希菌属中，除E.coli以外，其他5种48微生物限度检查法大肠埃希杆菌MUG皆为阴性。其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌种分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果，如MUG、Indole试验不一致时，则需分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。原理：利用目标菌限定酶作用的低物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指标系统来鉴定目标菌。试验证明96的大肠杆菌含葡糖苷酸酶（glucuronidase,GUD），约10的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠杆菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠杆菌其漏检率达6，这不符合药典检查方法的准确度要求，鉴于98的大肠杆菌靛基质试验为阳性，故将MUG靛基质试验结合，用EMB琼脂平板分离，辅以IMViC试验，在理论上可使大肠杆菌的检出率达99。49微生物限度检查法（一）大肠杆菌检验程序（见下页图表）供试液的制备方法：1液体供试品2固体、半固体或粘稠液体供试品3非水溶性供试品4含抑菌成分的供试品（稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过 滤法、中和法、沉降法）（二）增菌培养取胆盐乳糖（BL）培养基3份，每份各100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌50100个作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。37培养1824小时（必要时可延长至48小时）。阴性对照应无菌生长。50微生物限度检查法摇匀上述胆盐乳糖增菌液，以灭菌吸管吸取供试品胆盐乳糖增菌液、供试品阳性对照增菌液、阴性对照培养液各0.2ml，分别加入5mlMUG蛋白胨培养基管，37培养，分别于5小时、24小时，取未接种的MUG培养基管作本底对照，将各管置365nm紫外灯下观察。阳性对照管呈现荧光，MUG阳性，供试液的MUG管呈现荧光，MUG阳性；无荧光，MUG阴性。然后加数滴靛基质试液于MUG管内，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。（三）分离培养如MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时，将上述供试品BL51微生物限度检查法大肠杆菌检验程序图示52微生物限度检查法增菌液轻轻摇动，以接种环沾取12环培养液划线于EMB或麦康凯琼脂平板上，培养1824小时。当阴性对照呈阴性，阳性对照的平板呈典型菌落生长时，如上述供试液培养物的分离平板无菌落生长，判未检出大肠杆菌。如果有菌落生长，应挑选23个可疑菌落作靛基质试验（I）、甲基红试验（M）、乙酰甲基甲醇生成试验（VP）、枸橼酸盐利用试验（C）及革兰染色，镜检。按表中规定判断结果：（见下页）53微生物限度检查法大肠杆菌菌落形态特征培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂（EMB）典型菌落呈紫黑色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，有金属光泽。非典型菌落呈浅紫色、粉红色，或菌落中心紫色或无明显暗色中心，无金属光泽。麦康凯琼脂典型菌落呈鲜桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。非典型菌落呈微红色，或菌落中心呈红色。54微生物限度检查法（四）纯培养（复壮）如生长菌落与（大肠杆菌菌落形态特征表）所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选23个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养1824小时，作以下检查。如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液划线接种于EMB琼脂平板，培养1824小时，在挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下检查。（五）革兰染色、镜检1以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面培养物少许，轻轻研开，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰23次（载玻片不烫手为宜）固定。55微生物限度检查法2滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗3滴加碘液，媒染1分钟，水洗，以滤纸吸干余水4滴加95乙醇，脱色2030秒，水洗。或将95乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满涂片脱色10秒，水洗、吸干5滴加沙黄染液，复染1分钟，待干后，镜检染色结果：革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。大肠杆菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。注意事项：1玻片必须洁净，涂片菌量宜少，菌量不可浓，否则，菌细胞成堆或连成片。看不清单个菌体形态。染色反应难于判断，菌细胞形态难于观察。2待检菌菌龄以1624小时为宜。革兰阳性菌易受菌龄影响，老化细胞易呈阴性。3脱色是本法的关键步骤，脱色时间不足菌细胞易染成阳性，脱色时间过长易染成阴性。56微生物限度检查法（六）生化试验1靛基质试验（I）取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养2448小时，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。98的大肠杆菌I试验为阳性。一般24小时即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1ml或2ml培养液进行检查，如靛基质试验是阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24小时，作靛基质试验。2甲基红试验(M)取可疑菌落或斜面培养物，接种磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48小时2小时，于管内加入甲基红指示液23滴（约每1ml培养液加指示液1滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。57微生物限度检查法3乙酰甲基甲醇生成试验(VP)取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48小时2小时，于每2ml培养液中加入萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40KOH溶液0.4ml，充分振摇，在4小时（通常在30min）内出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性。4枸橼酸盐利用试验(C)取可疑菌落或斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基的斜面上，一般培养4872小时，培养基斜面有菌落生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变为阴性。（七）注意事项1本法（MUG法）不必从混合菌中分离单个菌落。除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙门菌属的菌株；亦有极少数革兰阳性球菌、杆菌和芽孢菌，其MUG为阳性。因此在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠，可排除革兰阳性58微生物限度检查法菌的干扰。至于志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难生长，即使有生长，本法能检出。既然药品中不得检出大肠杆菌，更不允许检出志贺菌、沙门菌。2配制MUG培养基时，务必校正PH值，灭菌后PH不得过7.4，否则PH值偏高，MUG管本身分解则显荧光，分装MUG培养基的试管应挑选，试管本身不得显荧光。3培养时间供试品培养液接种于MUG培养基中的培养时间，一般在5小时、24小时观察是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断时，可延长培养至48小时再观察结果。由于大肠埃希菌各菌株间的GUD（葡萄糖醛酸苷酶）的活性不完全相同，对低物和低物的浓度反应的差异；培养基中选择因子的影响；培养时间、温度；PH的改变；大量竞争菌和样品本身物质成分的干扰等，对结果的判断亦有影响。59微生物限度检查法4结果观察取供试品的MUG试验管、阳性对照管、阴性对照管同时在365nm紫外灯下观察，阳性对照管应有较强蓝白色荧光，阴性对照管无荧光。供试品MUG管是否有荧光，应仔细观察比较，或将各管调换位置（阴性管居中间），适当倾斜试管。如阳性对照管荧光强烈，影响供试品管与阴性对照管的观察时，亦可移去阳性对照管。5药品中污染的大肠杆菌，亦受生产工艺及药物的影响。在曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上的菌落形态特征时有变化，挑取可疑菌落往往凭经验，主观性较大，务必挑选23个以上菌落分别做IMViC试验鉴别，挑选菌落越多，检出阳性菌的机率越高，如仅挑选一个菌落做IMViC试验鉴别，则易漏检。60微生物限度检查法8在各类供试品中检测大肠杆菌及其他控制菌，按一次检出结果为准，不再抽样复验。检出的大肠杆菌及其他控制菌培养物须保留备查。（一般保留1个月）9大肠埃希杆菌（E.coli）是大肠埃希杆菌属中一种细菌，已知大肠埃希菌属有6种，其中IMViC试验模式为或。故中国药典大肠埃希杆菌检查法所指的IMViC试验结果与BP1998的E.coli检查法比较，判断检出或未检出大肠埃希杆菌，均有其局限性。BP1998法中含IMViC试验为的菌株但BP1998法中不含IMViC试验为的菌株62微生物限度检查法附：典型大肠杆菌非典型大肠杆菌典型中间型大肠杆菌非典型中间型大肠杆菌典型产气肠杆菌非典型产气肠杆菌63微生物限度检查法沙门菌检查法（见页）铜绿假单胞菌检查法（见页）金黄色葡萄球菌检查法（见页）破伤风梭菌检查法（见页）64微生物限度检查法微生物限度检查法结果判断（一）细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数、控制菌三项均符合该品种微生物限度项下规定，应判为供试品符合规定；其中任何一项不符合该品种项下规定，应判供试品不合格。（二）细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数第一次测定结果超过该品种项下规定时，应从同一批号样品中随机抽样，复试2次，以3次结果平均值报告。（三）眼科用药的霉菌和酵母菌菌落数复试报告，须以2次复试结果均不得长菌，方可判供试品合格。65微生物限度检查法（四）如营养琼脂培养基平板生长霉菌（酵母菌）菌落数或玫瑰红钠琼脂培养基平板上生长细菌菌落数超过该品种项下微生物限度规定时，经复试2次，如3次结果平均值仍超过规定，应判供试品不合格。（五）各类制剂检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再抽样复试，即应判该供试品不符合规定。66微生物限度检查法沙门菌检验程序67微生物限度检查法铜绿假单胞菌检验程序68微生物限度检查法金黄色葡萄球菌检验程序69微生物限度检查法破伤风梭菌检验程序70微生物限度检查法无菌室技术要求微生物限度及无菌检查实验室条件应满足工作任务的要求，有完善的实验设施和管理制度。在未普遍采用现代化的无菌隔离器技术之前，无菌实验室仍是最常用的无菌环境之一。1.无菌室的建筑设计应充分考虑其合理布局，使用方便，操作安全等条件。应设在较洁净的环境内。远离交通干道、厕所及污染区，最好在二楼以上，应选上下水道及其他安装适宜的位置。2.专用无菌室无菌检查、微生物限度检查与抗生素微生物检定用实验室，应严格分开，具危险性的毒菌、毒素如破伤风梭菌、黄曲霉素需单独使用，以便控制、防止传播。71微生物限度检查法3、无菌室操作间面积不超过10m2、高不超过2.4m4、室内六面应光滑平整、无缝隙，不起灰不落尘，耐腐蚀、易清洗。墙与地面、墙壁之间相接处应有一定弧度，不留死角。室内门窗结构应密合，并尽量减少活动窗口面积，出入操作间和缓冲间的门不应直对。5、无菌室外应设两个缓冲间，其结构同无菌室，做进入无菌室之前更衣戴帽等准备工作。6、无菌室内采光面积要大，照明等应嵌装在天花板内，光照应分布均匀，光照度不低于300勒克斯，缓冲间和操作间均应按每平方米22.5W设置紫外线杀菌灯，距实验台面高度不超过1米，并应定期检查辐射强度，不低于70W.cm2（1m距离），对失效者应及时更换。72微生物限度检查法7、室内应装置空气除菌过滤层流装置及调温装置，温度控制在1826，相对湿度4060，操作间或净化工作台的洁净空气应保持相对环境形成正压，不低于4.9Pa，洁净度应不低于10000级，无菌室关键操作点及净化工作台操作区的净化级别应为100级，即平均菌落数1个，0.5m粒子数3.5个L（3500个立方米）。8、室内灯的电源开关应设在室外，室内应有人净、物净设置，所有实验器材消毒处理后，通过物净传递窗进入无菌室。9、室内应备有天平、乙醇灯、火柴、乙醇棉、大、小橡皮乳头等。缓冲间内应有洗手盆、消毒液、无菌衣、帽、拖鞋等，不应放置培养箱和其它杂物。73微生物限度检查法无菌室管理制度无菌环境要求除了在建筑上创造一个可控无菌空间外，尚需依靠科学的管理、使用，才能保证无菌环境的洁净。无菌环境管理的主要措施是科学的制定实验室管理制度，除制定实验室工作制度、检品的收验、检品留样制度等，微生物室还应制定：1无菌室定期检查制度，发现无菌室无菌状况（如洁净度、紫外线杀菌力等）不符合要求时应立即停止使用，彻底整改2严格的无菌操作制度3菌毒种管理制度4无菌室内仅存放最必需的检验用具，保持固定位置，不随便移动。74微生物限度检查法常用菌种保藏制度菌种的保藏是药品微生物检验和无菌检验工作中的一项常规技术，科学的保藏和管理直接关系到检验结果的正确、科学研究的成败及人民用药的安全。无菌检查中阳性对照实验，微生物限度检查中的控制菌检验均须用到阳性对照菌株。由于微生物具有生命活力，世代时间一般很短，传代过程中易发生变异甚至死亡的特征，所以如何保持菌种性状的稳定性是菌种保藏研究的重要课题。目前为止还没有一种方法能使菌种保持原有性状不变，只是使菌种变异和死亡降低到最低限度。因此在实际工作中，首先要考虑保藏方法能否长期的保持菌种原有的特性，其次还要考虑保藏方法的经济和简便。75微生物限度检查法一、菌种保藏的管理1管理人员应具有较强的责任心2认真做好记录药品试验用标准菌种，有“中国药品生物制品检定所”医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）提供冷冻干燥菌种。3做好使用情况记录4每次接种菌种，都要进行登记。登记内容包括菌种名称、菌种编号、来源、接种数量、接种时间。二、菌种保藏方法不同微生物根据其特征选择最适宜的保藏方法，菌种保藏方法一般分为四个阶段：（1）挑选特征典型的纯菌菌落。（2）能产生孢子或芽孢的微生物应用孢子和芽孢进行保存。（3）选择最适宜的方法保藏。（4）定期对保藏菌种进行检查。76微生物限度检查法常用的保藏方法有：琼脂斜面低温保藏法（铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，故不宜放冰箱中保藏，只需在室温保藏，每隔1月转种一次）、液体石蜡保藏法、半固体琼脂保藏法三、菌种检查与复壮经过长期保藏和传代的菌种，由于种种原因易发生衰退、变异或死亡，因此各类菌种在保藏期间必须定期检查，发现变异或衰退，应及时给与恢复。1定期检查菌种的定期检查是保藏菌种最基本的内容之一。通过定期检查可以考察菌种的形态特征、生理生化特性有否异常，以及保藏菌种的技术效果。在一定间隔时间需要重新复活、分离、纯化、鉴定再保藏。菌种定期检查的间隔日期可视保藏菌种的类型、特性、保藏方法和其它客观条件不同而定。77微生物限度检查法检查项目：菌落形态、革兰染色、显微镜下菌体形态、生化特征及血清学检查。2防止菌种的衰退（1）控制传代次数（2）创造适宜的培养条件（3）用不同类型的细胞进行传代（4）采用有效的保藏方法78微生物限度检查法