引物设计教程 课件

PCR引物设计及相关软件使引物设计及相关软件使用用PCR引物设计及相关软件使用主要内容主要内容n n背景n nPCR引物设计原则n n常用PCR引物设计软件n nPrimer Premier 5.0 介绍n nOligo 6.22 介绍n n在线Primer3 介绍主要内容背景PCR聚合酶链反应聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction(Polymerase Chain Reaction,PCR),PCR)是是8080年代中期发展起来的体外核酸扩年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNADNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNADNA供分析研究和检测鉴定。供分析研究和检测鉴定。PCR聚合酶链反应(Polymerase Chain ReaPCR引物设计引物设计n n引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。PCR引物设计引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不引物设计的原则引物设计的原则n n引物与模板的序列要紧密互补n n引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构n n引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。引物设计的原则引物与模板的序列要紧密互补n n如引物长度（如引物长度（primer lengthprimer length），产物长度），产物长度（product lengthproduct length），序列），序列Tm Tm 值值(melting(melting temperature)temperature)，引物与模板形成双链的内部，引物与模板形成双链的内部稳定性稳定性(internal stability,(internal stability,用用 G G 值反映值反映)，形成引物二聚体，形成引物二聚体(primer dimer)(primer dimer)及发夹及发夹结构（结构（duplex formation and hairpinduplex formation and hairpin）的）的能值，在错配位点（能值，在错配位点（false priming sitefalse priming site）的引发效率，引物及产物的的引发效率，引物及产物的GC GC 含量含量（compositioncomposition），等等。必要时还需对引），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。进突变等。具体因素具体因素如引物长度（primer length），产物长度（prod一般原则一般原则n n引物的长度一般为引物的长度一般为15-30 bp15-30 bp，常用的是，常用的是18-24 bp18-24 bp，但不应大于，但不应大于3838。n n引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于长度大于16bp16bp是必要的（不容易引起错配）。是必要的（不容易引起错配）。n n例如：一个长度为例如：一个长度为12bp12bp的引物在人类基因组上存的引物在人类基因组上存在在200200个潜在的退火位点个潜在的退火位点(3 x 10(3 x 109 9/4/41212=200).=200).而一个而一个长度为长度为20bp20bp的引物在人基因组上存在的退火位点的引物在人基因组上存在的退火位点只有只有1/4001/400个个.n n较长的引物（较长的引物（28-35bp)28-35bp)n n一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点于产生一些突变位点一般原则引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24n nTm值的计算n n一般的公式n nTm=4(G+C)+2(A+T)n n对于长一些的引物可用更为准确的n nnearest-neighbor（Frier et al.(1986)）Tm值的计算一般原则一般原则2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。一般原则2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3一般原则一般原则3，引物3端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。一般原则3，引物3端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效一般原则一般原则4.引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推荐45-55%或50-60%一般原则4.引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或一般原则一般原则5.G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G 值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G 值相对较高的引物。引物的3端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（能值越高越容易结合）一般原则5.G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值一般原则一般原则6.对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。一般原则6.对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据一般原则一般原则7.引物二级结构对PCR反应的影响。尽可能少的引物二聚体。一般原则7.引物二级结构对PCR反应的影响。常用的引物设计软件常用的引物设计软件n nOligo 6（引物评价）*n nPrimer Premier（自动搜索）*n nVector NTI Suitn nDnasisn nOmigan nDnastarn nPrimer3 （在线服务）*常用的引物设计软件Oligo 6（引物评价）*Primer Premier 5.0 Primer Premier 5.0 的使的使用技巧简介用技巧简介主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA 基元(motif)查找4、同源性分析Primer Premier 5.0 的使用技巧简介主要功能简并引物设计简并引物设计n n根据氨基酸序列来设计引物DNA引物Premier Primer 5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择1 1、纤毛虫大核（、纤毛虫大核（Ciliate MacronuclearCiliate Macronuclear）2 2、无脊椎动物线粒体（、无脊椎动物线粒体（Invertebrate MitochondrionInvertebrate Mitochondrion）3 3、支原体（、支原体（MycoplasmaMycoplasma）4 4、植物线粒体（、植物线粒体（Plant MitochondrionPlant Mitochondrion）5 5、原生动物线粒体（、原生动物线粒体（Protozoan MitochondrionProtozoan Mitochondrion）6 6、一般标准（、一般标准（StandardStandard）7 7、脊椎动物线粒体（、脊椎动物线粒体（Vertebrate MitochondrionVertebrate Mitochondrion）8 8、酵母线粒体（、酵母线粒体（Yeast MitochondrionYeast Mitochondrion）简并引物设计根据氨基酸序列来设计引物DNA引物Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0使用介绍使用介绍(1)(1)Preimer Premier 启动界面Load sequenceLoad sequencePrimer Premier 5.0使用介绍(1)Preim基本信息基本信息Sequence nameOriginal sequenceUse these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好Choose a function 基本信息Sequence nameOriginal sequ引物设计界面引物设计界面First you can design the primer manuallySense strand or anti-sense strandUseful information of the primer引物设计界面First you can design the引物搜索选项设定引物搜索选项设定引物类型搜索模式5引物位置范围3引物位置范围产物大小范围引物长度引物搜索选项设定引物类型搜索模式5引物位置范围3引物位置搜索结果搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物搜索结果28对引物引物分值每对引物的信息双击选中一对引物引物信息引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,di一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But 一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最引物编辑引物编辑引物编辑引物编辑引物编辑Edit primer hereAnalysis the edit resultAccept the edit result Return to the main window引物编辑Edit primer hereAnalysis tSome other useful function of PP5Some other useful function of EnzymeEnzymeMelting temperature graphPer 25-merMelting temperature graphPer 2GC%graphPer 25-merGC%graphPer 25-merStability Per 5-merStability Per 5-merOligo 6.44 Oligo 6.44 使用说明使用说明主要功能：专门的引物设计软件Oligo 6.44 使用说明主要功能：专门的引物设计软件Oligo 6.44 启动界面启动界面Open sequence fileOligo 6.44 启动界面Open sequence f3个弹出窗口个弹出窗口Melting temperatureMelting temperature3个弹出窗口Melting temperatureG Internal StabilityG Internal StabilityFrq为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。Frq为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中用用Oligo 设计引物时的设计引物时的3个标准个标准n nTm 值曲线以选取5到3的下降形状有利于引物引发聚合反应。n nFrq 曲线宜选用3端Frq 值相对较低的片段。n nG 值在5端和中间值比较高，而在3端相对低用Oligo 设计引物时的3个标准Tm 值曲线以选取5到3引物设计教程 课件选中引物选中引物上游引物下游引物只是示意图选中引物上游引物下游引物只是示意图引物分析引物分析n n首先检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。引物分析首先检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。引物分析引物分析n n二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。引物分析二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，引物分析引物分析n n第三项检查为GC 含量，以45-55为宜。n n第四False priming 检查引物分析第三项检查为GC 含量，以45-55为宜。引物分析引物分析Key information of primerHairpinDimer and cross DimerGC%Total PCR information引物分析Key information of primerHFinal PCR informationFinal PCR informationSearch for primer using Oligo 6.44Search primerSearch for primer using Oligo Online primer3 service n nhttp:/frodo.wi.mit.edu/Online primer3 service http:/PCR引物引物设计及相关及相关软件使用件使用PCR引物设计及相关软件使用主要内容主要内容n nPCR介绍n n引物设计原理n n引物设计的优化原则n nPrimer Premier 5.0 介绍n n举例说明引物的设计主要内容PCR介绍PCR介绍介绍1、什么是PCR2、PCR的组成3、如何提高PCR成功率 （定量，对照）PCR介绍1、什么是PCR引物引物设计原理原理 引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计总体上包含三个程序：序列下载，同源性比较，引物设计筛选。引物设计原理 引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片引物设计教程 课件引物引物设计的原的原则1、引物长度 大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(1618)的引物；若产物长5 kb，则用24个核苷酸的引 物。有人用2023个核苷酸引物得到40 kb的产物。引物设计的原则1、引物长度引物引物设计的原的原则2、引物GC含量 GC含量在40%60%之间，以45-55为宜。这可为有效退火提供足够热。引物设计的原则2、引物GC含量引物引物设计的原的原则3、引物Tm 引物所对应模板序列的Tm 值最好72左右。至少要在5580之间。Tm=2(A+T)+4(C+G)引物设计的原则3、引物Tm引物引物设计的原的原则4、引物3端 引物3末端和模板的碱基完全配对 防止一对引物内的同源性 考虑末端5个碱基的G 引物3端要避开密码子的第3位 引物设计的原则4、引物3端引物引物设计的原的原则5、引物序列与模板序列引物序列与模板序列组成的相似性成的相似性 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高。引物设计的原则5、引物序列与模板序列组成的相似性 引物引物设计的原的原则6、最好在模板最好在模板cDNA的保守区内的保守区内设计 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。引物设计的原则6、最好在模板cDNA的保守区内设计 引物引物设计的原的原则7、引物自身及引物之引物自身及引物之间不不应存在互存在互补序序 列列 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物设计的原则7、引物自身及引物之间不应存在互补序 列 引物引物设计的原的原则8、碱基要随机分布碱基要随机分布 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。引物设计的原则8、碱基要随机分布 引物引物设计的原的原则9、引物引物应具有特异性具有特异性 引物设计完成以后，应对其进行检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。引物设计的原则9、引物应具有特异性 引物引物设计的原的原则10、G值 G值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间G值较高，而3端G值相对较低，且不要超过9（G值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。引物设计的原则10、G值 引物引物设计的原的原则11、引物的引物的5端端 引物的5端可以修饰，而3端不可修饰，引物5 端修饰包括：加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物设计的原则11、引物的5端 引物引物设计的原的原则12、在在DNA测序和序和PCR中最好用中最好用5末端末端稳定定(如如GC含量含量较多多)，而，而3末端不太末端不太稳定定(如如AT含量含量较多多)的引物的引物 引物设计的原则Primer Premier 5.0 Primer Premier 5.0 简介介主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA 基元(motif)查找4、同源性分析Primer Premier 5.0 简介主要功能:Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0使用介使用介绍Preimer Premier 启动界面Load sequenceLoad sequencePrimer Premier 5.0使用介绍Preimer 基本信息基本信息Sequence nameOriginal sequenceUse these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好Choose a function 基本信息Sequence nameOriginal sequ引物引物设计界面界面First you can design the primer manuallySense strand or anti-sense strandUseful information of the primer引物设计界面First you can design the引物搜索引物搜索选项设定定引物类型搜索模式5引物位置范围3引物位置范围产物大小范围引物长度引物搜索选项设定引物类型搜索模式5引物位置范围3引物位置搜索搜索结果果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物搜索结果28对引物引物分值每对引物的信息双击选中一对引物引物信息引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,di一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But 一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最引物引物编辑引物编辑引物引物编辑Edit primer hereAnalysis the edit resultAccept the edit result Return to the main window引物编辑Edit primer hereAnalysis t任务用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1举例说明任务举例说明SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid 1:Plasmid 2GFPSPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid 1:PSPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFPSPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aG 121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagccacccg cctactccca acgaccactt 541 cactcccacc cctgtctcct acacagctgg cttctacaga atccctgtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca 721 catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gcttggagac 781 gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctg cagtttgacc caggaaccaa NR1的编码序列(4000bp)红色为信号肽,蓝色为BamHI酶切位点,下划线标出酶切位点的阅读框 NR1的编码序列(4000bp)红色为信号肽,蓝色为BaATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTCGGCTACG GCCTGCAGTG CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCTAC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAAGFP序列(700bp)GFP序列(700bp)引物要求引物要求n nPCRPCR扩扩增增GFPGFPn nGFPGFP两两边边添加添加BamHIBamHI酶酶切位点切位点n n保保证证NR1NR1的的阅读阅读框不改框不改变变引物要求PCR扩增GFP5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGAGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5GFP序列5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5Primer1:5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5 Primer2Primer1:5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.Primer2:5 TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.Primer1:5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.Primer2:5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.第一步：扩增GFP基本序列变性,引物复性GFP序列3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG第二步：第二步：GC比比值；Tm值Primer1:5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA.Primer2:5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.Primer1:5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）第二步：GC比值；Tm值Primer1:5 ATG第三步：第三步：酶切位点切位点Primer1:5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）BamHI:ggatccPrimer1:5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2:5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC 第三步：酶切位点Primer1:5 ATGGTGA第四步：阅读框atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct.Primer1:5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGANR1序列：Primer1:5 ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA第四步：阅读框atgagcaccatgcacctgctgacatgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacctNR1序列：5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 GFP序列cgc gcg gat ccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG?ggat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct插入GFP后的组合序列atgagcaccatgcacctgctgacattcgccPrimer2:5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCCPrimer2:5 gg atc cct CTTGTACAGCTCGTCCATGCCPrimer2:5 ggatccCTTGTACAG第五步第五步 保保护序列序列Primer1:5 GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2:5 GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC第五步 保护序列Primer1:5 GCGGgg