免疫学检测技术课件

第十四章 免疫学检测技术第十四章第十四章 免疫学检测技术免疫学检测技术1免疫学检测技术课件免疫学检测技术课件2抗原和抗体可以发生高度专一性的结合抗原和抗体可以发生高度专一性的结合抗原和抗体可以发生高度专一性的结合3 抗原和抗体可以发生高度专一性的结合 抗原和抗体可以发生高度专一性的结合抗原和抗体可以发生高度专一性的结合4抗原和抗体可以发生高度专一性的结合抗原和抗体可以发生高度专一性的结合抗原和抗体可以发生高度专一性的结合5抗原或抗体抗原或抗体检测原理：原理：借助抗原和抗体在体外特异抗原和抗体在体外特异结合后合后出现的各种现象，对标本中的抗原或抗体进行定性或定量的检测。Equivalence Lattice formation抗原和抗体可以发生高度专一性的结合抗原或抗体检测原理：抗原或抗体检测原理：Equivalence Lattic6抗原或抗体抗原或抗体检测原理原理抗原或抗体检测原理抗原或抗体检测原理7免疫学免疫学（Immunology）：是研究抗原性物是研究抗原性物质、免疫系、免疫系统、免疫、免疫应答的答的规律及免疫律及免疫应答的答的调节的一的一门科学。科学。免疫的定免疫的定义（Immunity）：免疫是机体免疫是机体识别自我与非自我的自我与非自我的过程。排除异己，程。排除异己，维护自身自身稳定的生理反定的生理反应。免疫学（免疫学（Immunology）：）：8免疫的功能：免疫的功能：1.抵抗感染（抵抗感染（Defense）：机体能抵抗病原微生物）：机体能抵抗病原微生物侵侵袭的能力。又称免疫防御。的能力。又称免疫防御。抗菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫免疫抗菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫免疫2.自身自身稳定（定（Homeostasis）：机体在新）：机体在新陈代代谢过程中，程中，产生大量的衰老死亡生大量的衰老死亡细胞，免疫的第二个功能胞，免疫的第二个功能就是清除就是清除这些些细胞，胞，维持机体的生理平衡。持机体的生理平衡。3.免免 疫疫监视（Immunological surveillance）：机）：机体体细胞会因物理、化学和病毒等生物因素的影响，使胞会因物理、化学和病毒等生物因素的影响，使细胞胞发生癌生癌变，形成，形成肿瘤等，机体可瘤等，机体可识别、清除、清除这些些细胞，胞，这是免疫系是免疫系统的第三个功能。当的第三个功能。当这一功能低下一功能低下或失或失调时，会，会导致致肿瘤或癌症。瘤或癌症。免疫的功能：免疫的功能：9抗原抗原 （Antigen）抗原概念抗原概念 凡能刺激机体凡能刺激机体产生特异性抗体和致敏淋巴生特异性抗体和致敏淋巴细胞，胞，并能与相并能与相应抗体或致敏淋巴抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外胞在体内或体外发生生反反应的物的物质。抗原性抗原性（Antigenicity）：包括免疫原性和反）：包括免疫原性和反应原性原性二个方面二个方面免疫原性免疫原性：抗原能：抗原能刺激机体刺激机体产生抗体生抗体和致敏淋巴和致敏淋巴细胞的性能。胞的性能。反反应原性原性：抗原与特异性抗体或致敏淋巴：抗原与特异性抗体或致敏淋巴细胞在体胞在体内或体外内或体外发生反生反 应的性能。的性能。抗原抗原 （Antigen）抗原概念）抗原概念10抗原抗原 （Antigen）构成抗原的条件构成抗原的条件1.异物性：机体免疫异物性：机体免疫细胞能胞能识别自身和异己物自身和异己物质，只只有外源性的物有外源性的物质才具有免疫原性，才具有免疫原性，产生免疫反生免疫反应。亲缘关系越关系越远，差异越大，抗原性越，差异越大，抗原性越强。自身抗原：自身自身抗原：自身组织发生异常生异常变异、免疫功能紊乱、眼球晶体异、免疫功能紊乱、眼球晶体蛋白、精子蛋白、甲状腺蛋白蛋白、精子蛋白、甲状腺蛋白2.大分子胶体：一般在大分子胶体：一般在10 kD以上以上。3.具有复具有复杂的立体的立体结构或空构或空间构象构象.如明胶分子量如明胶分子量虽然然为100 kD，但，但结构构简单，免疫原性差。，免疫原性差。抗原抗原 （Antigen）构成抗原的条件）构成抗原的条件11抗原如何被抗原如何被识别抗原的特异性抗原的特异性 抗原决定簇：抗原分子表面具有免疫活抗原决定簇：抗原分子表面具有免疫活性的化学基因性的化学基因,是抗原与抗体是抗原与抗体结合的部位。合的部位。抗原分子中抗原的特异性由抗原分子中抗原的特异性由抗原决定簇抗原决定簇决定。决定。抗原如何被识别抗原的特异性抗原如何被识别抗原的特异性12免疫学检测技术课件免疫学检测技术课件13一种细菌可以刺激多少种抗体产生？抗原抗原一种细菌可以刺激多少种抗体产生？抗原一种细菌可以刺激多少种抗体产生？抗原14一种细菌可以刺激多少种抗体产生？根据抗原的化学性根据抗原的化学性质分：分：天然抗原：微生物及其天然抗原：微生物及其产物抗原如物抗原如菌体抗原（菌体抗原（O 抗原）抗原）鞭毛抗原（鞭毛抗原（H 抗原）抗原）表面抗原（如大表面抗原（如大肠杆菌的杆菌的K 抗原）抗原）细菌的毒素抗原菌的毒素抗原病毒抗原（病毒抗原（V 抗原）抗原）人工抗原：人工合成多人工抗原：人工合成多肽、蛋白等、蛋白等一种细菌可以刺激多少种抗体产生？根据抗原的化学性质分：一种细菌可以刺激多少种抗体产生？根据抗原的化学性质分：15抗体（抗体（Antibody)一、概念一、概念 是抗原刺激是抗原刺激B淋巴淋巴细胞胞,使之增殖分化成使之增殖分化成浆细胞而胞而产生的能与抗原生的能与抗原发生特异性反生特异性反应的的免疫球蛋白免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)抗体（抗体（Antibody)一、概念一、概念16抗体（抗体（Antibody)一、概念一、概念二、免疫球蛋白的基本二、免疫球蛋白的基本结构构免疫球蛋白：在人和免疫球蛋白：在人和动物血液、物血液、组织液及其液及其他分泌液中的一他分泌液中的一类结构相似的球蛋白。构相似的球蛋白。1.由由4 条条肽链组成：成：2 条重条重链，2 条条轻链2.一个抗体一个抗体单分子：分子：2 个抗原个抗原结合位合位点点抗体（抗体（Antibody)一、概念一、概念17抗体（抗体（Antibody)抗体（抗体（Antibody)18抗体（抗体（Antibody，Ab)免疫球蛋白的双重性免疫球蛋白的双重性 免疫球蛋白是一种蛋白免疫球蛋白是一种蛋白质，是抗体，是抗体(Ab1)；同；同时又可引起机体又可引起机体产生抗体（抗抗体生抗体（抗抗体,Ab2），所以既是），所以既是抗体又是抗原抗体又是抗原。Ag Ab1 Ab2 抗体（抗体（Antibody，Ab)免疫球蛋白的双重性免疫球蛋白的双重性19免疫学检测技术课件免疫学检测技术课件20抗体（抗体（Antibody，Ab)免疫球蛋白的双重性免疫球蛋白的双重性免疫球蛋白的功能免疫球蛋白的功能 1.与抗原与抗原结合合 2.激活激活补体体 3.组织结合合 4.调理作用理作用 5.抗体依抗体依赖细胞介胞介导的的细胞毒作用胞毒作用(ADCC）抗体（抗体（Antibody，Ab)免疫球蛋白的双重性免疫球蛋白的双重性21免疫球蛋白的功能免疫球蛋白的功能免疫球蛋白的功能免疫球蛋白的功能22抗体（抗体（Antibody)的的产生与功能生与功能抗体（抗体（Antibody)的产生与功能的产生与功能23抗体产生的主要过程抗体抗体抗体抗体抗体产生的主要过程抗体抗体产生的主要过程抗体24免疫学检测技术课件免疫学检测技术课件25注射注射注射注射抗原抗原（如（如类毒素）毒素）血清血清抗体？抗体？抗体？抗体？抗原？抗原？抗原？抗原？抗体的制抗体的制备注射抗原（如类毒素）血清抗体？注射抗原（如类毒素）血清抗体？抗体的制备抗体的制备26抗体的制抗体的制备抗血清：指抗原人工免疫抗血清：指抗原人工免疫实验动物，物，获得含得含 特异性抗体的血清。特异性抗体的血清。多克隆抗体多克隆抗体 (PAbPAb)：多个抗原决定簇免疫机体多个抗原决定簇免疫机体 所所产生的多种抗体的混合物。生的多种抗体的混合物。单克隆抗体克隆抗体（monoclonal antibodymonoclonal antibody，MAbMAb）：只只针对某一特定的抗原决定簇，某一特定的抗原决定簇，纯度高的抗体。度高的抗体。抗体的制备抗体的制备27多克隆抗体多克隆抗体与与单克隆抗体克隆抗体多克隆抗体与单克隆抗体多克隆抗体与单克隆抗体28多克隆抗体多克隆抗体与与单克隆抗体克隆抗体的制的制备多克隆抗体与单克隆抗体的制备多克隆抗体与单克隆抗体的制备29单克隆抗体的制克隆抗体的制备 骨髓瘤骨髓瘤细胞胞 脾脾脏淋巴淋巴细胞胞 （HGPRT-TK-)HGPRT-TK-)（HGPRT+TK+HGPRT+TK+）在在HATHAT中不能生中不能生长 体外培养体外培养过程中死亡程中死亡 PEGPEG 杂交瘤交瘤细胞胞 (HGPRT+(HGPRT+、TK+)TK+)在在HATHAT中大量中大量长期繁殖期繁殖 克隆化克隆化 产生生单抗抗 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 30第一节 免疫学检测技术原理抗原或抗体检测原理：抗原抗体的抗原抗体的结合具有高度合具有高度专一性一性 借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对标本中的抗原或抗体进行定性或定量的检测。第一节第一节 免疫学检测技术原理免疫学检测技术原理抗原或抗体检测原理：抗原或抗体检测原理：31对抗原或抗体进行定性或定量的检测的原理 Ab excessAg excessEquivalence Lattice formation对抗原或抗体进行定性或定量的检测的原理对抗原或抗体进行定性或定量的检测的原理 Ab excessA32对抗原或抗体进行定性或定量检测的原理 根据抗原抗体形成的免疫复合物的浓度进行定量检测。P 312对抗原或抗体进行定性或定量检测的原理对抗原或抗体进行定性或定量检测的原理 33第一节 免疫学检测技术原理可作为抗原进行检查的物质：微生物及其大分子产物 人和动物细胞 人和动物体内的各种大分子 各种半抗原第一节第一节 免疫学检测技术原理免疫学检测技术原理可作为抗原进行检查的物质：可作为抗原进行检查的物质：34抗原或抗体抗原或抗体检测原理原理抗原或抗体检测原理抗原或抗体检测原理35较早的抗原抗体反早的抗原抗体反应检测方法方法1、凝集反、凝集反应 （Agglutination)2、沉淀反、沉淀反应 (Precipitation)3、补体体结合合试验 (Complement fixation test)4、中和、中和试验 (Neutralization test)较早的抗原抗体反应检测方法较早的抗原抗体反应检测方法1、凝集反应、凝集反应 （Agglut36 一、凝聚反一、凝聚反应(Agglutination)(Agglutination)二、沉淀反二、沉淀反应 1 1、溶液中的沉淀反、溶液中的沉淀反应 2 2、凝胶、凝胶扩散沉淀散沉淀 3 3、免疫、免疫电泳泳 血清免疫血清免疫电泳泳 火箭火箭电泳泳 对流免疫流免疫电泳泳 三、三、补体参与的反体参与的反应 四、免疫四、免疫标记的抗原抗体技的抗原抗体技术 酶联免疫吸附（免疫吸附（ELISAELISA）一、凝聚反应一、凝聚反应(Agglutination)37一、凝集反应 凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。一、凝集反应一、凝集反应 凝集反应是指颗粒抗原与相应抗凝集反应是指颗粒抗原与相应抗38一、凝集反应 凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一定条件下出现凝集。一、凝集反应一、凝集反应 凝集反应是指颗粒抗原与相应抗凝集反应是指颗粒抗原与相应抗39二、沉淀反应 当抗原是可溶性分子时，与抗体结合则形成沉淀。1、絮状沉淀反应 一系列试管中加入等量的抗体和递增量的抗原，在中性条件下37度保温1-2h，便可见到絮状的蛋白质沉淀。可用于寻找抗原抗体反应的合适比例，检测抗原抗体的分子比。2、环状沉淀反应 在试管中加入抗体后，小心加入相应抗原，使抗原抗体步混合，37度保温10-20min，在二者界面上出现环状沉淀。不能用于定量测定。二、沉淀反应二、沉淀反应 当抗原是可溶性分子时，与抗体结当抗原是可溶性分子时，与抗体结403、双向扩散：又称琼脂扩散，是利用琼脂凝胶作介质的一种沉淀反应。琼脂是多孔的网状结构，可使大分子物质通过，分子的扩散作用使分别两处的抗原抗体相遇，比例合适时形成沉淀。可观测到沉淀弧。沉淀弧的特征与位置取决于抗原分子的大小、结构、扩散系数和浓度等。当抗原、抗体存在多种体系时，会出现多条沉淀弧。二、沉淀反应3、双向扩散：又称琼脂扩散，是利用琼脂凝胶作介质的一种沉淀反、双向扩散：又称琼脂扩散，是利用琼脂凝胶作介质的一种沉淀反41双向扩散法的操作：生理盐水配制1%-5%的琼脂，取4mL倒在普通载玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗体用于测定抗体效价，中心孔滴入抗体，外周孔滴入抗原，用于检测抗原的存在和定性抗原。双向扩散法的操作：生理盐水配制双向扩散法的操作：生理盐水配制1%-5%的琼脂，取的琼脂，取4mL倒在倒在42二、沉淀反应 抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同，沉淀弧的特征不同：抗原抗体为多体系时，出现的沉淀弧有多条，彼此互不干扰。二、沉淀反应二、沉淀反应 抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同，沉淀弧抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同，沉淀弧434、单向免疫扩散：又称单向琼脂扩散，是定量抗原的一种检测方法。与双向扩散不同的是在琼脂中含有一定量的抗体，孔内加入未知量的相应抗原。在37度保温过程中，孔内的抗原向周围扩散，与抗体形成沉淀圈。根据沉淀圈的大小确定抗原的含量二、沉淀反应4、单向免疫扩散：又称单向琼脂扩散，是定量抗原的一种检测方法、单向免疫扩散：又称单向琼脂扩散，是定量抗原的一种检测方法44二、沉淀反应 另外还有其他众多的免疫检测技术和手段，其机理都利用了抗原抗体的沉淀反应。例如微量免疫微量免疫电泳、泳、对流免疫流免疫电泳、泳、火箭火箭电泳泳等。二、沉淀反应二、沉淀反应 另外还有其他众多的免疫检测另外还有其他众多的免疫检测45免疫电泳免疫电泳免疫电泳46二、抗原或抗体检测的现代方法：P3121.免疫荧光技术2.酶联免疫分析法3.放射免疫分析法二、抗原或抗体检测的现代方法：二、抗原或抗体检测的现代方法：47第一节免疫学检测技术原理二、抗原或抗体检测的方法：1.免疫荧光技术 将将结合有合有荧光素的光素的荧光抗体光抗体进行抗原抗体反行抗原抗体反应的技的技术 常用的常用的荧光素有异硫光素有异硫氰酸酸荧光素（光素（fluorescein isothiocyanate,FITC)和和罗丹明（丹明（rhodamine B200,RB200)等。它等。它们可与抗体球蛋白中可与抗体球蛋白中赖氨酸氨酸的氨基的氨基结合，在合，在蓝紫光激紫光激发下，可分下，可分别出出现鲜明明的黄的黄绿色及玫瑰色及玫瑰红色。色。第一节免疫学检测技术原理第一节免疫学检测技术原理二、抗原或抗体检测的方法：二、抗原或抗体检测的方法：48第一节 免疫学检测技术原理二、抗原或抗体检测的方法：1.免疫荧光技术n直接荧光法n 间接荧光法 第一节第一节 免疫学检测技术原理免疫学检测技术原理二、抗原或抗体检测的方法：二、抗原或抗体检测的方法：49第一节 免疫学检测技术原理二、抗原或抗体检测的现代方法：P3132.酶联免疫分析法3.放射免疫分析法第一节第一节 免疫学检测技术原理二、抗原或抗体检测的现代方法：免疫学检测技术原理二、抗原或抗体检测的现代方法：50第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用 一、基本原理：将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫免疫荧光素技光素技术。第二节第二节 免疫荧光技术在食品检测中免疫荧光技术在食品检测中的应用的应用 一、基本原理：一、基本原理：51第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用 一、基本原理：免疫免疫荧光素技光素技术第二节第二节 免疫荧光技术在食品检测中免疫荧光技术在食品检测中的应用的应用 一、基本原理：一、基本原理：52第二节免疫荧光技术在食品检测中的应用二、抗体的荧光标记 P315（一）荧光抗体的制备搅拌法透析法（二）荧光抗体的鉴定 鉴定指标：效价、荧光素与蛋白质的结合比率第二节免疫荧光技术在食品检测中第二节免疫荧光技术在食品检测中的应用二、抗体的荧光标记的应用二、抗体的荧光标记 53第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用三、标本的制作 P316 食品卫生检验中，荧光标记抗体检测标本的制作方法是将样品增菌液涂在载玻片上，涂片应薄而均匀，干燥后用化学方法固定，然后进行荧光染色。第二节第二节 免疫荧光技术在食品检测中免疫荧光技术在食品检测中的应用三、标本的制作的应用三、标本的制作 54第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用五、荧光显微镜检查 染色当天即作镜检 通风良好的暗室内进行 选择好光源或滤光片第二节第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用五、荧光显微镜检查免疫荧光技术在食品检测中的应用五、荧光显微镜检查55第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用五、荧光显微镜检查 染色当天即作镜检 通风良好的暗室内进行 选择好光源或滤光片第二节第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用五、荧光显微镜检查免疫荧光技术在食品检测中的应用五、荧光显微镜检查56第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用四、荧光抗体染色方法 直接法 间接法第二节第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用免疫荧光技术在食品检测中的应用四、荧光抗体染色方四、荧光抗体染色方57第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用四、荧光抗体染色方法 直接法直接法 间接法接法第二节第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用四、荧光抗体染色方法免疫荧光技术在食品检测中的应用四、荧光抗体染色方法58 使用了两种抗体：一抗、二抗一抗、二抗 二抗如何二抗如何获得？得？使用了两种抗体：一抗、二抗使用了两种抗体：一抗、二抗 二抗如何二抗如何59第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用六、在食品检验中的应用 P317 免疫荧光检测技术已经广泛应用于医药卫生领域，可检测细菌、病毒、寄生虫等，在食品卫生领域也应用的越来越多。第二节第二节 免疫荧光技术在食品检测中免疫荧光技术在食品检测中的应用六、在食品检验中的应用六、在食品检验中60第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用 一、基本原理 P319 利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。酶联免疫吸附剂测定 enzyme linked immunosorbent assay，ELISA第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用61第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用ELISA 基本原理 使抗原或抗体结合到某种固相合到某种固相载体表面体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗抗原或抗体体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用ELISA 基本原理基本原理 62第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用ELISA 基本原理 在测定时，把受检酶标抗体或抗原和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相合在固相载体上的体上的酶量与量与标本本中受中受检物物质的量成一定的比例的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据可根据颜色反色反应的深浅刊物定的深浅刊物定性或定量分析性或定量分析。第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用ELISA 基本原理基本原理 63第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用ELISA 基本原理 碱碱性性磷磷酸酸酶或或过氧氧化化物物酶第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用ELISA 基本原理基本原理 64第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用酶联免疫吸附剂测定 enzyme linked immunosorbent assay，ELISA 二、ELISA的种类 P320直接法直接法测定抗原定抗原间接法接法测定抗体定抗体双抗体双抗体夹心法心法测定抗原定抗原双抗原双抗原夹心法心法测定抗原定抗原竞争法争法测定抗原定抗原第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用酶联免疫吸附剂测定免疫酶技术在食品检测中的应用酶联免疫吸附剂测定 65第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用免疫酶技术在食品检测中的应用66第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用二、ELISA的种类双抗原夹心法测定抗原第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用二、免疫酶技术在食品检测中的应用二、ELISA的种类的种类67第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用二、ELISA的种类双抗体夹心法测定抗原第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用二、免疫酶技术在食品检测中的应用二、ELISA的种类的种类68免疫学检测技术课件免疫学检测技术课件69免疫学检测技术课件免疫学检测技术课件70 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。（一）双抗体（一）双抗体夹心法心法 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体可用于测定抗原，也可用于测定抗体71 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。可设计出各种不同类型的检测方法。（一）双抗体（一）双抗体夹心法心法双抗体双抗体夹心法心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。（3）加酶标抗体：（4）加底物：ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体可用于测定抗原，也可用于测定抗体72（一）双抗体（一）双抗体夹心法心法双抗体双抗体夹心法心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：（2）加受检标本：（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。（一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法73二、ELISA的种类双抗体夹心法测定抗原二、二、ELISA的种类的种类74三、抗体的酶标记 P321 戊二醛法 过碘酸盐氧化法第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用三、抗体的酶标记三、抗体的酶标记 P321第三节第三节 免疫酶技术在食品检免疫酶技术在食品检75第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用四、酶与底物 酶与抗原、抗体或半抗原在交联剂作用下连接。是ELISA成败的关键试剂。P323 表表14-1 五、固相载体 最常用的是聚苯乙烯 ELISA载体的形状主要有三种：小试管、小珠、微量反应板（酶标板）第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用四、酶与底物免疫酶技术在食品检测中的应用四、酶与底物76免疫学检测技术课件免疫学检测技术课件77第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用六、最适工作浓度的选择 以夹心法测抗原为例，可用棋盘滴定法。P323 表表14-2 第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用六、最适工作浓度的选择免疫酶技术在食品检测中的应用六、最适工作浓度的选择78第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用七、ELISA测定方法 1、加样 2、保温 3、洗涤 4、比色 5、结果判定第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用七、免疫酶技术在食品检测中的应用七、ELISA测定方法测定方法79第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用封闭 P330 封封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相吸收后固相载体表面尚有未被占体表面尚有未被占据的空隙，封据的空隙，封闭就是就是让大量不相关的蛋白大量不相关的蛋白质充填充填这些空隙，从而排斥在些空隙，从而排斥在ELISA其后的步其后的步骤中干中干扰物物质的再吸附的再吸附。封闭的操作与包被相类似。最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋牛血清白蛋白白，也有用10%的小牛血清小牛血清或1%明胶明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，可以高浓度使用（5%）。第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用封闭免疫酶技术在食品检测中的应用封闭 P330 80采用酶标法（ELISA）进行三聚氰胺检测 Thermo MK3型酶标仪采用酶标法（采用酶标法（ELISA）进行三聚氰胺检测）进行三聚氰胺检测 Thermo MK81 酶标仪原理与结构 酶标仪原理与结构酶标仪原理与结构 82第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用八、酶免疫技术在食品检验中的应用 用于细菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生虫的检测。用于蛋白质、激素、其他生理活性物质、药物残留、抗生素等的检测。应用实例：ELISA法检测致泻性大肠埃希氏菌肠毒素。第三节第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用八、酶免疫技术在食品检免疫酶技术在食品检测中的应用八、酶免疫技术在食品检83常常规鉴定定ELISA法检测致泻性大肠埃希氏菌肠毒素常规鉴定常规鉴定ELISA法检测致泻性大肠埃希氏菌肠毒素法检测致泻性大肠埃希氏菌肠毒素84ELISA法检测肠毒素ELISA法检测肠毒素法检测肠毒素85 第四节 放射免疫技术在食品检测中的应用 第四节第四节 放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术在食品检测中的应用86标记免疫分析技免疫分析技术用用标记示踪技示踪技术观察抗原抗体一察抗原抗体一级反反应的分析方法的分析方法 特点：特点：敏感性高，反敏感性高，反应时间短，可用短，可用仪器器检测结果果三大三大标记免疫分析技免疫分析技术：放射免疫、放射免疫、荧光免疫、光免疫、酶免疫免疫 检测方法方法 检测范范围生化、常生化、常规免疫免疫 mgg（10-3 10-6 g）荧光免疫、光免疫、酶免疫免疫 gng（10-6 10-9 g）放射免疫放射免疫、发光免疫光免疫 ngpg（10-9 10-12 g）PCR pgfg（10-12 10-15 g）标记免疫分析技术标记免疫分析技术87 第四节 放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫分析（RIA）一、基本原理 放射免疫分析的基本原理是标记抗原抗原Ag*和和非非标记抗原抗原Ag对特异性抗体特异性抗体Ab的的竞争争结合反合反应。反应式为：Ag*+Ab Ag*Ab +Ag AgAb 第四节第四节 放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫分析（放射免疫分析（88标记抗原抗原抗体抗体非非标记抗原抗原图 14-6标记抗原抗体非标记抗原图标记抗原抗体非标记抗原图 14-689放射免疫放射免疫RIARIA以以标记抗原与反抗原与反应系系统中未中未标记抗原抗原竞争争结合特合特异性抗体来异性抗体来测定定待待检样品中抗原品中抗原量。量。免疫放射免疫放射IRMAIRMA以以过量量标记抗体抗体与抗原非与抗原非竞争争结合，采用固相免合，采用固相免疫吸附疫吸附载体分离体分离游离和游离和结合合标记抗体。抗体。放射受体分析放射受体分析RRARRA放射配体放射配体结合合分析分析RBARBA其它其它一、基本原理一、基本原理放射免疫免疫放射放射受体分析其它一、基本原理放射免疫免疫放射放射受体分析其它一、基本原理90第四节 放射免疫技术在食品检测中的应用二、标记物 P333常用的核素有两大类射线：131I、125I、57Cr和60Co射线：14C、3H和32P。使用最广泛的是：125I性质活泼、易制备标记物对被标记物的免疫活性影响小测量方法简便、已推广半衰期较长、核素丰度高第四节第四节 放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术在食品检测中的应用二、标记物二、标记物 91B、F分离技术 第二抗体沉淀法 B、F分离技术分离技术 第二抗体沉淀法第二抗体沉淀法 92第四节 放射免疫技术在食品检测中的应用 测量量仪器器（1）计数数仪（2）液液闪仪第四节第四节 放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术在食品检测中的应用 测量仪器测量仪器93 化学化学发光光（chemiluminescence）是指伴随化学是指伴随化学反反应过程所程所产生的光的生的光的发射射现象。象。化学化学发光光发光免疫分析技光免疫分析技术（Luminescent immunoassay，LIA）化学发光发光免疫分析技术（化学发光发光免疫分析技术（Luminescent immun94 光照光照发光光（photoluminescence）是指是指发光光剂（荧光素）光素）经短波短波长的入射光照射后，的入射光照射后，电子吸收能量子吸收能量跃迁到激迁到激发态，在其回复至基，在其回复至基态时，发射出射出较长波波长的可的可见光（光（荧光）。光）。生物生物发光光（bioluminescence）是指是指发生在生生在生物体内的物体内的发光光现象，如象，如萤火虫的火虫的发光，反光，反应底物底物为萤火虫火虫荧光素，在光素，在荧光素光素酶的催化下，的催化下，利用利用ATPATP能能，生成激，生成激发态氧化型氧化型荧光素，它在回复基光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式多余的能量以光子的形式释放出来。放出来。光照发光（光照发光（photoluminescence）是指发）是指发95 化学化学发光光（chemiluminescence）是指伴随化学是指伴随化学反反应过程所程所产生的光的生的光的发射射现象。某些物象。某些物质(发光光剂)在化学反在化学反应时，吸收了反吸收了反应过程中所程中所产生的化学能生的化学能，使反使反应的的产物分子或反物分子或反应的中的中间态分子中的分子中的电子子跃迁到激迁到激发态，当，当电子从激子从激发态回复到基回复到基态时，以，以发射光子的形式射光子的形式释放出能量，放出能量，这一一现象称象称为化学化学发光。光。化学化学发光光化学发光化学发光96 一些化学反一些化学反应能能释放足放足够的能量把参加反的能量把参加反应的物的物质激激发到能到能发射光的射光的电子激子激发态，若被激若被激发的是一个反的是一个反应产物物分子，分子，则这种反种反应过程叫直程叫直接化学接化学发光。反光。反应过程可程可简单地描述如下：地描述如下：A A十十B C*B C*C*C C*C h h其中其中为光子，光子，C*C*表示表示C C处于于单线激激发态。一些化学反应能释放足够一些化学反应能释放足够97发光免疫分析技光免疫分析技术（Luminescent immunoassay，LIA）1.原理：原理：（1）LIA：在氧化在氧化还原反原反应中中电子被激子被激发，可，可释放光子，放光子，使使发光光剂鲁米米诺（氨基苯二（氨基苯二酰肼类）发光。用光。用发光光剂标记抗原或抗体抗原或抗体（2）发光光酶免疫免疫测定（定（LEIA）：）：用能催化用能催化发光反光反应的的酶（如葡萄糖氧化（如葡萄糖氧化酶）标记抗原或抗体，抗原或抗体，酶可使可使发光光剂发光。光。该法法经酶促放大，更灵敏促放大，更灵敏.根据根据发光的光的强弱弱对抗原或抗体定量抗原或抗体定量.2.优点：点：无放射性，故无放射性，故现正逐步取代正逐步取代 RIA发光免疫分析技术（发光免疫分析技术（Luminescent immunoass98 用用吖啶酯直接直接标记抗体抗体(抗原抗原)，与待，与待测标本中相本中相应的抗的抗原原(抗体抗体)发生免疫反生免疫反应后，形成固相包被抗体后，形成固相包被抗体-待待测抗原抗原-吖啶酯标记抗体复合物，抗体复合物，这时只需加入氧化只需加入氧化剂（H H2 2O O2 2）和）和NaOHNaOH使成碱性使成碱性环境，境，吖啶酯在不需要催化在不需要催化剂的情况下分解、的情况下分解、发光光 。由集光器和光由集光器和光电倍增管接收、倍增管接收、记录单位位时间内所内所产生的生的光子能，光子能，这部分光的部分光的积分与待分与待测抗原的量成正比，可从抗原的量成正比，可从标准准曲曲线上上计算出待算出待测抗原的含量。抗原的含量。直接化学直接化学发光免疫分析光免疫分析 用吖啶酯直接标记抗体用吖啶酯直接标记抗体(抗原抗原)，与待测标本中相应的抗原，与待测标本中相应的抗原99发光光Y Y Y YY Y磁微粒磁微粒被被测抗原抗原+抗体抗体+带丫丫啶酯标记物抗物抗体体Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y冲洗后冲洗后-夹心法心法（1 1）加入加入H H2 2O O2 2（pH10）直接化学直接化学发光的机理光的机理发光发光YYY磁微粒被测抗原磁微粒被测抗原+抗体抗体+带丫啶酯标记物抗体带丫啶酯标记物抗体YYYYY100磁磁微粒微粒模式模式图Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y特点特点已已结合合的抗原和抗体的抗原和抗体与与未未结合部分合部分的的易易分离分离磁微粒磁微粒技技术磁微粒模式图磁微粒模式图YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY101感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络，感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络，如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！感感谢亲观谢亲观看此幻灯片，此看此幻灯片，此课课件部分内容来源于网件部分内容来源于网络络，102