第3节-高效液相色谱的类型(基础教学)课件

第三节第三节高效液相色谱的类型高效液相色谱的类型1专业课件第三节高效液相色谱的类型1专业课件 根据固定相和分离机理不同，根据固定相和分离机理不同，高效液相色谱可分为多种类型：高效液相色谱可分为多种类型：n液液-液吸附色谱液吸附色谱n液液-固分配色谱固分配色谱n化学键合相色谱化学键合相色谱n离子交换色谱离子交换色谱n离子色谱离子色谱n尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱.2专业课件 根据固定相和分离机理不同，高效液相色谱可分为多一、液一、液固吸附色谱固吸附色谱(一一)原理原理n 基于各组分在固体吸附剂表面上具有不同基于各组分在固体吸附剂表面上具有不同的吸附能力而进行分离。的吸附能力而进行分离。当流动相携带试样组分通过吸附剂时，各组分当流动相携带试样组分通过吸附剂时，各组分分子和流动相分子与吸附剂表面活性中心发生竞争分子和流动相分子与吸附剂表面活性中心发生竞争吸附，与吸附剂性质类似的组分易被吸附，与吸附吸附，与吸附剂性质类似的组分易被吸附，与吸附剂表面活性中心的几何结构相适应的组分也易被吸剂表面活性中心的几何结构相适应的组分也易被吸附附,结果不同组分由于结构的不同，受到的吸附力也结果不同组分由于结构的不同，受到的吸附力也不同，则保留值也不同，最终被分离。不同，则保留值也不同，最终被分离。3专业课件一、液固吸附色谱(一)原理 基于各组分在固体吸(二)固定相n液液固吸附色谱常用的固定相是：固吸附色谱常用的固定相是：固体吸附剂固体吸附剂，n主要有：主要有：n 极性：极性：硅胶、氧化铝、分子筛硅胶、氧化铝、分子筛n 非极性：非极性：活性炭活性炭4专业课件(二)固定相液固吸附色谱常用的固定相是：4专业课件(三三)用途用途n 主主要要用用于于分分离离极极性性不不同同或或含含极极性性基基团团相相同同但但数数目目不不同同的的试试样样，也也适适合合分离异构体，但不宜分离同系物。分离异构体，但不宜分离同系物。n 液液固固吸吸附附色色谱谱的的分分离离效效果果不不太太好，目前使用较少。好，目前使用较少。5专业课件(三)用途 主要用于分离极性不同或含极性基团二、液二、液液分配色谱液分配色谱(一一)原理原理 根据各待测组分在互不相溶的两相中分根据各待测组分在互不相溶的两相中分配系数不同而进行分离的。配系数不同而进行分离的。在色谱柱中，随着流动相的移动，被在色谱柱中，随着流动相的移动，被分离各组分在固定相和流动相之间的分配分离各组分在固定相和流动相之间的分配平衡需进行多次，造成各组分的迁移速率平衡需进行多次，造成各组分的迁移速率不同，从而实现分离的过程。不同，从而实现分离的过程。6专业课件二、液液分配色谱(一)原理 根据各待测组分在(二二)固定相n 原原则则上上，用用于于GC的的固固定定相相也也可可用用于于HPLC作作固固定定相相，常常用用硅硅胶胶做做载载体体。但但HPLC固固定定液液易易流流失失，因因此此常常用用的的只只有有几几种种，按按极极性性由由高高到到低低为为：,-氧氧二二丙丙腈腈(ODPN)、聚聚乙乙二二醇醇(PEM)、三三甲甲撑撑二二醇醇(TMG)、十十八八烷烷(C18)、角鲨烷、角鲨烷(SQ)等。等。7专业课件(二)固定相 原则上，用于GC的固定相也可(三)流动相流动相n HPLC分分析析中中，为为防防止止固固定定相相的的流流失失，流流动动相相与与固固定定液液应应尽尽量量不不互互溶溶，或或者者说说二二者者的的极极性性相相差差越越大大越越好好。因因此此，根根据据流流动动相相与与固固定定相相极极性性的的差差别别程度，可将液液色谱分为：程度，可将液液色谱分为：8专业课件(三)流动相 HPLC分析中，为防止固定相的1.1.正相分配色谱正相分配色谱n定定义义：固固定定相相为为极极性性，流流动动相相为为非非极极性性的液的液液分配色谱称正相分配色谱。液分配色谱称正相分配色谱。n用途：主要用于极性组分的分离。用途：主要用于极性组分的分离。n流流出出顺顺序序：被被分分离离组组分分按按极极性性从从小小到到大大的的顺顺序序流流出出，即即极极性性小小的的先先流流出出，极极性性大的后流出。大的后流出。9专业课件1.正相分配色谱定义：固定相为极性，流动相为非极性的液液2.2.反相分配色谱反相分配色谱n定定义义：固固定定相相为为非非极极性性，流流动动相相为为极极性性的液的液液分配色谱称反相分配色谱。液分配色谱称反相分配色谱。n用途：主要用于非极性组分的分离。用途：主要用于非极性组分的分离。n流流出出顺顺序序：被被分分离离组组分分按按极极性性从从大大到到小小的的顺顺序序流流出出，即即极极性性大大的的先先流流出出，极极性性小的后流出。小的后流出。10专业课件2.反相分配色谱定义：固定相为非极性，流动相为极性的液液三、化学键合相色谱三、化学键合相色谱(一一)化学键合固定相化学键合固定相 是通过化学反应以共价键形是通过化学反应以共价键形式将有机固定液键合在硅胶载体式将有机固定液键合在硅胶载体表面，而得到的各种性能的固定表面，而得到的各种性能的固定相。相。11专业课件三、化学键合相色谱(一)化学键合固定相 是通过(二二)优点优点n(1)固定液不流失。固定液不流失。n(2)热稳定性和化学稳定性好，热稳定性和化学稳定性好，能在能在pH=2 8.5的介质中使用。的介质中使用。n(3)消除了机械涂渍固定液表面不均匀消除了机械涂渍固定液表面不均匀 带来的弊病。带来的弊病。n(4)可键合各种不同类型的固定液，可键合各种不同类型的固定液，制备适应于各种色谱的固定相。制备适应于各种色谱的固定相。n(5)适合于梯度淋洗。适合于梯度淋洗。12专业课件(二)优点(1)固定液不流失。12专业课件(三三)化学键合方法化学键合方法通常，化学键合相的载体主要是硅胶通常，化学键合相的载体主要是硅胶(表面有硅醇基表面有硅醇基)：方法一方法一(硅酯化硅酯化)：方法二方法二(氯化氯化)：方法三方法三(硅烷化硅烷化)：13专业课件(三)化学键合方法通常，化学键合相的载体主要是硅胶(表面有硅特点：特点：n(1)Si-O-R：对对热热不不稳稳定定、遇遇水水、乙乙醇醇等等极极性性溶溶剂剂会会发发生生水水解解，使使酯酯链链断断裂裂，因因此此只只适适合合于不含水或醇的流动相体系。于不含水或醇的流动相体系。n(2)Si-R(或或Si-N)：抗水解能力强，热稳定性比抗水解能力强，热稳定性比硅酸酯好。但所用的格氏反应不方便。硅酸酯好。但所用的格氏反应不方便。n(3)Si-O-Si-R：不不水水解解，热热稳稳定定性性好好，在在pH=2-8范围内对水稳定。范围内对水稳定。注意事项：化学键合固定相不适于酸、碱度过大注意事项：化学键合固定相不适于酸、碱度过大或含有氧化剂的缓冲溶液作流动相。或含有氧化剂的缓冲溶液作流动相。14专业课件特点：(1)Si-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇等极性溶剂(四四)原理原理n 这这种种固固定定相相分分离离机机理理既既不不是是简简单单的的吸吸附附，也也不不是是单单一一的的液液-液液分分配配，而而是是二二者者兼兼而而有有之之。化化学学键键合合表表面面的的覆覆盖盖度度决决定定哪哪种种机机理理起起主主要要作作用用。对对多多数数键键合合相相来来说说，以以分分配配机机理理为为主。主。15专业课件(四)原理 这种固定相分离机理既不是简单的吸附(五五)分类分类1.正相键合相色谱正相键合相色谱正相键合色谱中，随流动相极性增加，组分分配比正相键合色谱中，随流动相极性增加，组分分配比k减小。减小。正相键合正相键合相色谱相色谱固定相极性大固定相极性大硅胶硅胶-OH(或双或双-OH)，硅胶，硅胶-CN流动相极性小流动相极性小烃类烃类(己烷、庚烷、异辛烷等己烷、庚烷、异辛烷等)+适量适量极性溶剂极性溶剂(CHCl3,CH3OH,CH3CN)分析对象分析对象多用于极性或中等极性化合物的分离，多用于极性或中等极性化合物的分离，以及极性不同化合物的分离。以及极性不同化合物的分离。流出顺序流出顺序极性小的先流出，极性大的后流出极性小的先流出，极性大的后流出16专业课件(五)分类1.正相键合相色谱正相键合色谱中，随流动相极性2.反相键合相色谱反相键合相色谱反相键合反相键合相色谱相色谱固定相极性小固定相极性小硅胶硅胶-C18，硅胶，硅胶-苯基苯基流动相极性大流动相极性大甲醇甲醇-水，乙腈水，乙腈-水，水和无机盐的缓冲水，水和无机盐的缓冲溶液溶液分析对象分析对象多用于多环芳烃等低极性化合物的分离；多用于多环芳烃等低极性化合物的分离；改变流动相配比也可用于分离极性化合改变流动相配比也可用于分离极性化合物；缓冲液可用于易解离的化合物，如物；缓冲液可用于易解离的化合物，如有机酸、有机碱和酚类的分离。有机酸、有机碱和酚类的分离。流出顺序流出顺序极性大的先流出，极性小的后流出极性大的先流出，极性小的后流出分离机理用分离机理用“疏水效应疏水效应”来解释。来解释。17专业课件2.反相键合相色谱反相键合相色谱固定相极性小硅胶-C18四、离子交换色谱四、离子交换色谱n 此此法法是是利利用用离离子子交交换换原原理理和和液液相相色色谱谱技技术术相相结结合合，分分离离各各类类阴阴、阳阳离离子子的的分分离离分分析析方方法法。它它既既适适合合于于无无机机离离子子，也也适适于于有有机机物物分分离离，如蛋白质、氨基酸、核酸等。如蛋白质、氨基酸、核酸等。18专业课件四、离子交换色谱 此法是利用离子交换原理和液1.1.原理原理n 根根据据离离子子交交换换树树脂脂上上可可解解离离的的离离子子与与流流动动相相中中所所带带相相同同电电荷荷的的组组分分离离子子进进行行可可逆逆交交换换，不不同同组组分分离离子子对对固固定定相相的的亲亲和和力力(或或离离子子交交换换能能力力)的差别来实现分离的。的差别来实现分离的。19专业课件1.原理 根据离子交换树脂上可解离的离子与流动2.2.可逆交换反应可逆交换反应(1)对阳离子，滞留顺序为：对阳离子，滞留顺序为：Fe3+,Ba2+,Pb2+,Sr2+,Ca2+,Co2+,Zn2+,Mg2+,Ag+,Cs+,Rb+,K+,NH4+,Na+,H+,Li+(2)对阴离子，滞留顺序为：对阴离子，滞留顺序为：柠檬酸根柠檬酸根,SO42-,C2O42-,HSO4-,NO3-,CrO42-,Br-,SCN-,Cl-,OH-,F-阳离子交换：阳离子交换：阴离子交换：阴离子交换：R-SO3-H+M+R-SO3-M+H+R-NR3+Cl-+X-R-NR3+X-+Cl-(1)电电 荷：电荷越高，结合越牢固，流出越慢。荷：电荷越高，结合越牢固，流出越慢。(2)离子半径：半径越大，结合越牢固，流出越慢。离子半径：半径越大，结合越牢固，流出越慢。20专业课件2.可逆交换反应(1)对阳离子，滞留顺序为：Fe3+,3.3.固定相固定相按离子交换剂类型分四种：按离子交换剂类型分四种：类类 型型官官 能能 团团阳离子交换剂阳离子交换剂强阳离子交换剂强阳离子交换剂-SO3-弱阳离子交换剂弱阳离子交换剂-COO-阴离子交换剂阴离子交换剂强阴离子交换剂强阴离子交换剂-NR3+弱阴离子交换剂弱阴离子交换剂-NH2+把这些离子交换剂用化学键合的方法键合在：把这些离子交换剂用化学键合的方法键合在：(1)微粒硅胶，微粒硅胶，(2)苯乙烯与二乙烯苯的交联共聚物上，构成固定相。苯乙烯与二乙烯苯的交联共聚物上，构成固定相。21专业课件3.固定相按离子交换剂类型分四种：类 型官 能 团阳离4.4.流动相流动相n离子交换色谱常用的流动相是使用一定离子交换色谱常用的流动相是使用一定pH和离子强度的缓冲溶液。和离子强度的缓冲溶液。n可以通过改变流动相可以通过改变流动相pH、缓冲盐类型、缓冲盐类型、离子强度、添加有机溶剂离子强度、添加有机溶剂(如甲醇或乙醇如甲醇或乙醇)或配位离子来提高选择性。或配位离子来提高选择性。22专业课件4.流动相离子交换色谱常用的流动相是使用一定pH和离子强度5.5.用途用途n广泛用于无机离子的分离；广泛用于无机离子的分离；n也也可可用用于于有有机机物物、生生物物物物质质的的分分离离，如如：蛋蛋白白质质、氨氨基基酸酸、核核酸酸、糖类等糖类等23专业课件5.用途广泛用于无机离子的分离；23专业课件五、离子色谱五、离子色谱n 离离子子色色谱谱(IC)是是20世世纪纪70年年代代发发展展的的新新方方法法。使使用用强强离离子子交交换换树树脂脂作作为为固固定定相相，强强电电解解质质溶溶液液为为流流动动相相，用电导检测器检测。用电导检测器检测。1.原理：原理：n 分离原理与离子交换色谱原理一样。分离原理与离子交换色谱原理一样。24专业课件五、离子色谱 离子色谱(IC)是20世纪70年代发2.离子交换色谱与离子色谱的关系离子交换色谱与离子色谱的关系n离子色谱是在离子交换色谱的基础上派生离子色谱是在离子交换色谱的基础上派生出来的一种液相色谱。出来的一种液相色谱。n原因：原因：在离子交换色谱中，对于没有紫外在离子交换色谱中，对于没有紫外吸收的无机离子常需用电导检测器进行检吸收的无机离子常需用电导检测器进行检测，但由于使用强电解质为流动相，其在测，但由于使用强电解质为流动相，其在电导检测器上产生强的背景信号，严重干电导检测器上产生强的背景信号，严重干扰待测组分离子的检测。为了解决这一问扰待测组分离子的检测。为了解决这一问题，建立了离子色谱。题，建立了离子色谱。25专业课件2.离子交换色谱与离子色谱的关系离子色谱是在离子交换色谱的基3.离子色谱如何消除强电解质的干扰离子色谱如何消除强电解质的干扰n 为了消除流动相中强电解质中离子为了消除流动相中强电解质中离子产生的强背景干扰，在分离柱后设置了产生的强背景干扰，在分离柱后设置了一个抑制柱，通过抑制柱的交换，将高一个抑制柱，通过抑制柱的交换，将高背景电导的流动相转变为低背景电导的背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，进而消除本底电导的影响，即流动相，进而消除本底电导的影响，即消除了强背景干扰。消除了强背景干扰。26专业课件3.离子色谱如何消除强电解质的干扰 为了消除流例如：在阴离子分析中例如：在阴离子分析中n待测阴离子组分随流动相待测阴离子组分随流动相(NaOH)通过阴离子交换柱时，通过阴离子交换柱时，与树脂上的阴离子发生离子交换反应，此时流动相中与树脂上的阴离子发生离子交换反应，此时流动相中含大量强电解质含大量强电解质NaOH。然后通过设置的强阳离子交换。然后通过设置的强阳离子交换抑制柱，通过交换将高背景电导的流动相转变成低背抑制柱，通过交换将高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相景电导的流动相(H2O)，消除了本底电导的影响。，消除了本底电导的影响。R-SO3-H+Na+OH-R-SO3-Na+H2On同时使试样中的阴离子同时使试样中的阴离子(A-)转变为相应的酸转变为相应的酸(HA)，由于，由于H+的淌度比的淌度比Na+大的多，因此，大大提高了待测阴离子大的多，因此，大大提高了待测阴离子的检测灵敏度。的检测灵敏度。n R-SO3-H+Na+A-R-SO3-Na+H+A-27专业课件例如：在阴离子分析中待测阴离子组分随流动相(NaOH)通过阴六、尺寸排阻色谱六、尺寸排阻色谱(凝胶色谱凝胶色谱)n 凝凝胶胶色色谱谱是是基基于于试试样样中中各各组组分分分分子子的的大大小小和和形形状状的的不不同来实现分离的。同来实现分离的。28专业课件六、尺寸排阻色谱(凝胶色谱)凝胶色谱是基于试1.1.原理原理n 固固定定相相为为化化学学惰惰性性的的多多孔孔凝凝胶胶，凝凝胶胶内内有有许许多多不不同同尺尺寸寸的的孔孔穴穴，试试样样中中分分子子体体积积大大的的组组分分不不能能渗渗入入孔孔穴穴中中而而被被排排阻阻，因因此此它它们们直直接接通通过过柱柱子子，较较早早地地被被淋淋洗洗出出来来，首首先先在在色色谱谱图图上上出出现现；另另一一些些尺尺寸寸小小的的分分子子则则完完全全渗渗透透，进进入入凝凝胶胶的的所所以以孔孔穴穴，这这些些组组分分在在柱柱中中保保留留值值最最大大，则则最最后后流流出出色色谱谱柱柱；试试样样中中中中等等尺尺寸寸的的分分子子则则可可渗渗透透到到凝凝胶胶中中的的某某些些孔孔穴穴中中，而而不不能能进进入入另另一一些些孔孔穴穴，所所以以以以中中等等速速度度通通过过色色谱谱柱柱，即即待待测测物物分分子子按按分分子子大大小小(分子量大小分子量大小)先后从柱中流出。先后从柱中流出。29专业课件1.原理 固定相为化学惰性的多孔凝胶，凝胶内有2.2.固定相和流动相固定相和流动相类类 型型材材 料料型型 号号特特 点点流动相流动相软性凝胶软性凝胶葡萄糖凝胶葡萄糖凝胶Sephadax溶胀，小分溶胀，小分子分离子分离水水聚苯乙烯聚苯乙烯Bio-Head-S有机溶剂有机溶剂半刚性凝胶半刚性凝胶聚苯乙烯聚苯乙烯Styragel溶胀较小溶胀较小流速较小流速较小有机溶剂有机溶剂聚乙酸酯聚乙酸酯Emgel(OR)有机溶剂有机溶剂刚性凝胶刚性凝胶玻璃珠玻璃珠CPG-10Porasil刚性大、高刚性大、高流速分离流速分离有机溶剂和水有机溶剂和水多孔硅胶多孔硅胶有机溶剂和水有机溶剂和水30专业课件2.固定相和流动相类 型材 料型 号特 点流动相软性凝胶3.3.流动相的要求流动相的要求n 能溶解试样且与凝胶相似能溶解试样且与凝胶相似(润润湿凝胶湿凝胶)、粘度小、粘度小(增加扩散速度增加扩散速度)。31专业课件3.流动相的要求 能溶解试样且与凝胶相似(润湿凝4.4.用途用途n分离相对分子量大于分离相对分子量大于2000的化合物。的化合物。n如有机聚合物、蛋白质和其它生物高如有机聚合物、蛋白质和其它生物高分子等。也可用来测定高分子聚合物分子等。也可用来测定高分子聚合物的相对分子质量和相对分子质量分布，的相对分子质量和相对分子质量分布，研究聚合机理。研究聚合机理。32专业课件4.用途分离相对分子量大于2000的化合物。32专业课件八、色谱分离方式的选择八、色谱分离方式的选择n1.相对分子量相对分子量(400)：采用气相色谱分离。采用气相色谱分离。n2.相对分子量相对分子量(2000)：选用凝胶色谱选用凝胶色谱n3.相对分子量相对分子量(400 2000)：具体情况具体分析。具体情况具体分析。33专业课件八、色谱分离方式的选择1.相对分子量(400)：33专业相对分子量相对分子量性性 质质分离方法分离方法 2000溶于水溶于水不溶于水不溶于水尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱400 2000溶于水：溶于水：酸酸 碱碱 酚，醚，胺等酚，醚，胺等大分子化合物大分子化合物阳离子交换色谱阳离子交换色谱阴离子交换色谱阴离子交换色谱化学键合相谱化学键合相谱尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱 溶于烃类溶于烃类不溶于水，溶于二氯甲烷，氯仿不溶于水，溶于二氯甲烷，氯仿 溶于甲醇，乙醇等溶于甲醇，乙醇等 液液-固吸附色谱固吸附色谱液液-固吸附色谱固吸附色谱或反相液或反相液-液色谱液色谱 400分子大小差别较大分子大小差别较大气体或低沸点化合物气体或低沸点化合物其它可气化物质其它可气化物质 尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱气气-固吸附色谱固吸附色谱气气-液分配色谱液分配色谱 表表5-8 色谱分离方法选择参考表色谱分离方法选择参考表(p355)34专业课件相对分子量性 质分离方法 2000溶于水尺寸排阻色