五毛细管电泳课件

v电泳电泳是电解质中带电粒子在电场力作用下，以不同是电解质中带电粒子在电场力作用下，以不同的速度向电荷相反方向迁移的现象的速度向电荷相反方向迁移的现象.利用这种现象对利用这种现象对化学和生物化学组分进行分离的技术称之为化学和生物化学组分进行分离的技术称之为电泳技电泳技术术。丛。丛20世纪世纪3040年代起年代起,相继发展了多种基于相继发展了多种基于抗对流介质的电泳技术抗对流介质的电泳技术(如如纸电泳纸电泳，凝胶电泳凝胶电泳等等).传传统的电泳技术由于受到焦耳热的限制，只能在低电统的电泳技术由于受到焦耳热的限制，只能在低电场强度下进行电泳操作，分离时间长，效率低场强度下进行电泳操作，分离时间长，效率低.80年年代初代初,细径毛细管被用于电泳，由此产生了一种新型细径毛细管被用于电泳，由此产生了一种新型的分析技术的分析技术毛细管电泳。毛细管电泳。毛细管的结构毛细管的结构：毛细管电泳通常使用内径为：毛细管电泳通常使用内径为25-100m25-100m的弹性（聚酰亚胺）涂层熔融石英管。的弹性（聚酰亚胺）涂层熔融石英管。一一.概述概述6/15/20241电泳是电解质中带电粒子在电场力作用下，以不同的速度向电荷相反v毛细管的毛细管的特点特点是：容积小；侧面是：容积小；侧面/截面积大而散热快、截面积大而散热快、可承受高电场；可使用自由溶液、凝胶等为支持介可承受高电场；可使用自由溶液、凝胶等为支持介质；在溶液介质下能产生平面形状的电渗流。质；在溶液介质下能产生平面形状的电渗流。v原理原理v毛细管电泳毛细管电泳(CE)又称又称高效毛细管电泳高效毛细管电泳(HPCE),是是指离子或带电粒子以指离子或带电粒子以毛细管毛细管为分离室为分离室,以以高压直流电高压直流电场为驱动力场为驱动力,依据样品中各组分之间依据样品中各组分之间淌度淌度和和分配行为分配行为上的差异而实现分离的液相分离分析技术。由于毛上的差异而实现分离的液相分离分析技术。由于毛细管内径小，表面积和体积的比值大细管内径小，表面积和体积的比值大,易于散热，易于散热，v因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生,这是这是CE和和传统电泳技术的根本区别。传统电泳技术的根本区别。6/15/20242毛细管的特点是：容积小；侧面/截面积大而散热快、可承受高电场n n CE开始主要用于蛋白质，多肽的分析蛋白质，多肽的分析,以后逐渐被广泛应用于生物生物，化学化学，医药医药，环保环保等领域。它具有分离效率高分离效率高，分析速分析速度快度快，样品及试剂用量少样品及试剂用量少,洁净无污染洁净无污染等特点,和HPLC(高效液相色谱法高效液相色谱法)成为分析化学中互补的技术。随着生命科学的发展，毛细管电泳技术也有了广阔的发展空间.目前，不同分离模式的毛细管电泳技术正成为最重要的生物样品分离分析手段。6/15/20243CE开始主要用于蛋白质，多肽的分析,以后逐渐被广泛应根据分离原理分为以下几种类型根据分离原理分为以下几种类型 毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresiscapillary zone electrophoresis，CZECZE）；）；）；）；毛细管等速电泳（毛细管等速电泳（毛细管等速电泳（毛细管等速电泳（capillary chromatographycapillary chromatography，CITPCITP）；）；）；）；毛细管胶速电动色谱（毛细管胶速电动色谱（毛细管胶速电动色谱（毛细管胶速电动色谱（miceller electrokinetic miceller electrokinetic capillary chromatographycapillary chromatography，MECCMECC）；）；）；）；毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（capillary gelelectrophoresiscapillary gelelectrophoresis，CGECGE）；）；）；）；毛细管等电聚焦（毛细管等电聚焦（毛细管等电聚焦（毛细管等电聚焦（capillary isoelectric focusing capillary isoelectric focusing，CIEFCIEF）。）。）。）。6/15/20244根据分离原理分为以下几种类型毛细管区带电泳（capill二二.毛细管电泳基本概念和原理毛细管电泳基本概念和原理1.基本概念基本概念有效长度有效长度(Ld,cm)：毛细管的入口端到检测器窗口的距离；毛细管的入口端到检测器窗口的距离；迁移时间迁移时间(tmmin)：带电粒子在电场作用下做定向移动的时间；带电粒子在电场作用下做定向移动的时间；电泳速度电泳速度（Uepcm/s）：在单位时间内，带电粒子在毛细管中定向）：在单位时间内，带电粒子在毛细管中定向移动的距离；移动的距离；电场强度电场强度(EV/cm)：在给定长度毛细管的两端施加一个电场后：在给定长度毛细管的两端施加一个电场后所形成的电效应的强度；所形成的电效应的强度；电泳淌度电泳淌度（epcm2/(V.s)）带电粒子在毛细管中定向移动的速）带电粒子在毛细管中定向移动的速度与所在电场强度之比；度与所在电场强度之比；6/15/20245二.毛细管电泳基本概念和原理1.基本概念有效长度(Ld,电渗流电渗流：毛细管内壁表面的电荷所引起的管内液体的整体流动，：毛细管内壁表面的电荷所引起的管内液体的整体流动，来源于外加电场对管壁溶液双电层的作用；来源于外加电场对管壁溶液双电层的作用；电渗流电渗流方向方向样品分子泳样品分子泳动方向动方向1.基本概念基本概念使液体沿毛细管壁均匀移动；使液体沿毛细管壁均匀移动；使携带不同电性的分子均向负极移动，使携带不同电性的分子均向负极移动，中性分子也随着电渗流一起移动。中性分子也随着电渗流一起移动。电渗流的电渗流的作用特点作用特点6/15/20246电渗流：毛细管内壁表面的电荷所引起的管内液体的整体流动，电毛细管电泳的基本原理：毛细管电泳的基本原理：毛细管电泳毛细管电泳是以高压电场（是以高压电场（30kV）为驱动力，以毛细管为分）为驱动力，以毛细管为分离通道。其管内填充了缓冲液或凝胶，根据样品中各组分之离通道。其管内填充了缓冲液或凝胶，根据样品中各组分之间间淌度淌度和和分配的差异分配的差异而实现分离的一类液相分离技术。而实现分离的一类液相分离技术。在电泳过程中，毛细管两端插入电极液，此电极液通常与管中在电泳过程中，毛细管两端插入电极液，此电极液通常与管中的缓冲液一致。正负电极连接至高电压装置，进样时样品盘的缓冲液一致。正负电极连接至高电压装置，进样时样品盘移动，使毛细管的进样端及此端的电极准确插入样品管中，移动，使毛细管的进样端及此端的电极准确插入样品管中，给予一定电场或压力后，样品被吸入毛细管内，然后再将毛给予一定电场或压力后，样品被吸入毛细管内，然后再将毛细管移至电极液中开始电泳。细管移至电极液中开始电泳。在毛细管电泳中，为了维持电荷平衡，溶液中的正离子吸附至在毛细管电泳中，为了维持电荷平衡，溶液中的正离子吸附至石英表面形成双电子层，当在毛细管两端施加电压后，这层石英表面形成双电子层，当在毛细管两端施加电压后，这层正离子趋向负极移动，并带动毛细管中的溶液以液流形式移正离子趋向负极移动，并带动毛细管中的溶液以液流形式移向负极（向负极（电渗电渗）。由于毛细管的表面积与体积比大，加上电泳时使用了高压，由于毛细管的表面积与体积比大，加上电泳时使用了高压，电电渗在毛细管电泳中具有两大特点渗在毛细管电泳中具有两大特点：液体液体沿着毛细管壁沿着毛细管壁均匀流均匀流动动，其前沿是平的；携带，其前沿是平的；携带不同电荷的分子朝一个方向移动不同电荷的分子朝一个方向移动，中性分子也能随着电渗一起移动而实现分离中性分子也能随着电渗一起移动而实现分离6/15/20247毛细管电泳的基本原理：毛细管电泳是以高压电场（30kV）为驱6/15/202488/9/202382.毛细管电泳基本分离原理毛细管电泳基本分离原理毛细管的两端分别浸在含有电解质的储液槽中，管内也充满同毛细管的两端分别浸在含有电解质的储液槽中，管内也充满同样的电解质样的电解质,其中一端与检测器相连其中一端与检测器相连.当样品被引入后当样品被引入后,便开始施便开始施加电压，样品中各组分向检测器方向移动加电压，样品中各组分向检测器方向移动,溶质的迁移时间为溶质的迁移时间为:tm=l Lt/UVLt-有效长度有效长度V-施加电压施加电压U-溶质总流速溶质总流速Uep-电泳速度电泳速度Ueo-电渗流速度电渗流速度U=Uep+Ueo其中，其中，可见，在毛细管长度一定，某时刻电压可见，在毛细管长度一定，某时刻电压相同的条件下，迁移时间决定于相同的条件下，迁移时间决定于电泳速电泳速度度UepUep和和电渗流速度电渗流速度UeoUeo,而两者均随组而两者均随组分的不同荷质比而异分的不同荷质比而异;所以，基于荷质所以，基于荷质比的差异就可以实现组分的分离。比的差异就可以实现组分的分离。6/15/202492.毛细管电泳基本分离原理毛细管的两端分别浸在含有电解质的储3、毛细管电泳仪系统、毛细管电泳仪系统电泳仪电泳仪进样系统进样系统分离系统分离系统检测系统检测系统数据处理系统数据处理系统Comeon6/15/2024103、毛细管电泳仪系统电泳仪进样系统分离系统检测系统数据处理三三.毛细管电泳的分离模式毛细管电泳的分离模式CE毛细管区带电泳毛细管区带电泳毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳胶束电动力学毛细管色谱胶束电动力学毛细管色谱毛细管等电聚焦电泳毛细管等电聚焦电泳毛细管电泳有多种分离模式，给样品分离提供了不毛细管电泳有多种分离模式，给样品分离提供了不同的选择机会同的选择机会.根据分离原理可分为根据分离原理可分为:6/15/202411三.毛细管电泳的分离模式CE毛细管区带电泳毛细管凝胶电泳胶束毛细管电泳的分离模式（一）毛细管区带电泳（一）毛细管区带电泳（capillaryzoneelectrophoresis，CZE）：）：毛细管和电极槽内充有相同组分和相同浓度的电解质溶液毛细管和电极槽内充有相同组分和相同浓度的电解质溶液（缓冲液）。它是最基本、应用最普遍的一种分离模式，（缓冲液）。它是最基本、应用最普遍的一种分离模式，尤其对于亲水多肽的分离具有一定的优越性。尤其对于亲水多肽的分离具有一定的优越性。（二）微团电动毛细管色谱（二）微团电动毛细管色谱（micellarelectrokineticcapillarychromatography，MECC）：）：通常有一些离子型表面活性剂（如通常有一些离子型表面活性剂（如SDS）加到缓冲液中，）加到缓冲液中，这类分子一端为亲水基团，其余部分为疏水内核，亲水基这类分子一端为亲水基团，其余部分为疏水内核，亲水基团在表面，中性粒子因其本身疏水性不同而得以分离。团在表面，中性粒子因其本身疏水性不同而得以分离。6/15/202412毛细管电泳的分离模式（一）毛细管区带电泳（capillar（三）毛细管等电聚焦（三）毛细管等电聚焦（capillaryisoelectricfocusing，CIEF）：）：选用内壁中性共价涂层消除电渗的毛细管，利用两性电解选用内壁中性共价涂层消除电渗的毛细管，利用两性电解质形成质形成pH梯度。梯度。CIEF具有较高的分辨力。具有较高的分辨力。（四）毛细管筛分电泳（四）毛细管筛分电泳（capillarysievingelectrophoresis，CSE）：）：在毛细管内填充了多聚物作为分离介质，如甲基纤维素对在毛细管内填充了多聚物作为分离介质，如甲基纤维素对分子的泳动起着阻碍作用。其作用机制类似平板电泳凝胶分子的泳动起着阻碍作用。其作用机制类似平板电泳凝胶的筛网作用，大分子较小分子所受的阻碍大，泳动速度减的筛网作用，大分子较小分子所受的阻碍大，泳动速度减慢。慢。毛细管电泳的分离模式 6/15/202413（三）毛细管等电聚焦（capillaryisoelectrp（六）毛细管阵列电泳（六）毛细管阵列电泳（capillaryarrayelectrophoresis，CAE）：）：CAE是在常规是在常规CE原理和技术的基础上，结合微型制造技原理和技术的基础上，结合微型制造技术设计出来的一种检测技术由微通道或反应池等构成通道术设计出来的一种检测技术由微通道或反应池等构成通道型微阵列型微阵列芯片芯片，通过加载生物样品，进行一种或连续多种，通过加载生物样品，进行一种或连续多种反应，达到快速高效分析的目的，是一种新型的生物反应，达到快速高效分析的目的，是一种新型的生物芯片芯片。p（七）免疫亲和毛细管电泳（七）免疫亲和毛细管电泳（immunoaffinitycapillaryelectrophoresis，ACE）：）：ACE是把蛋白质（抗原或抗体）事先固定在毛细管柱内，是把蛋白质（抗原或抗体）事先固定在毛细管柱内，利用抗原利用抗原-抗体的特异性识别反应，抗体的特异性识别反应，CE的高效、快速分离的高效、快速分离能力，能力，LIF的高灵敏度来分离检测样品混合物中能与固定的高灵敏度来分离检测样品混合物中能与固定化蛋白质特异结合的组分。化蛋白质特异结合的组分。毛细管电泳的分离模式 6/15/202414（六）毛细管阵列电泳（capillaryarrayele毛细管区带电泳毛细管区带电泳毛细管区带电泳毛细管区带电泳(CZE)也也称为称为自由溶液毛细管电泳自由溶液毛细管电泳,是毛细管电泳中最简单，是毛细管电泳中最简单，应用最广泛的一种形式。应用最广泛的一种形式。分离机理：不同离子按照各分离机理：不同离子按照各自表面电荷密度的差异即自表面电荷密度的差异即淌度淌度的差异的差异,以不同的速度以不同的速度在电解质中移动在电解质中移动,实现分离。实现分离。但中性物质的淌度差为零但中性物质的淌度差为零,所以不能以这种形式分离。所以不能以这种形式分离。6/15/202415毛细管区带电泳毛细管区带电泳(CZE)也8/9/2023四、毛细管电泳仪的基本结构电泳仪工作示意图6/15/202416四、毛细管电泳仪的基本结构电泳仪工作示意图8/9/20231进样系统进样系统静压力进样和电动进静压力进样和电动进样样进样体积一般在纳升进样体积一般在纳升级级进样长度必须控制在进样长度必须控制在毛细管总长度的毛细管总长度的1%2%，否则将影响，否则将影响分离效率分离效率6/15/202417进样系统静压力进样和电动进样8/9/202317分离系统分离系统毛细管毛细管:由熔融石英制成由熔融石英制成,内径通常为内径通常为2575m,外外径为径为350400m，有效长，有效长度为度为80100cm;恒温系统恒温系统:控制柱温变化在控制柱温变化在0.10C；高压电源高压电源:电流电流0300A电电压压030KV,电压稳定性在电压稳定性在0.1%;6/15/202418分离系统毛细管:由熔融石英制成,内径通常为2575back6/15/202419back8/9/202319检测系统检测系统常用的检测方式是紫紫外外-可见光吸收可见光吸收.检测器位于距样品盘约毛细管总长的2/34/5处,对毛细管壁内部分进行光聚焦；此外，荧光荧光，激光诱激光诱导荧光导荧光，质谱质谱等检测方法也被应用于毛细管电泳;6/15/202420检测系统常用的检测方式是紫外-可见光吸收.检测器位于距样品盘高效毛细管电泳仪实图高效毛细管电泳仪实图6/15/202421高效毛细管电泳仪实图8/9/2023211 1、离子分析离子分析analysisofion2 2、药物分析药物分析analysisofpharmaceutics3 3、手性化合物分析、手性化合物分析analysisofchiralcompounds4 4、氨基酸分析、氨基酸分析analysisofaminoacids5 5、核酸分析及核酸分析及DNADNA测序测序analysisofnucleicacidsandsequenceofDNA6 6、新进展及热点问题、新进展及热点问题advancesandspecialtopics五、高效毛细管五、高效毛细管电泳应用与进展电泳应用与进展application and advances of HPCE6/15/2024221、离子分析五、高效毛细管电泳应用与进展applicatio1 1、离子分析离子分析 analysisofion阳离子分析阳离子分析 迁移方向和电渗流迁移方向和电渗流方向一致；方向一致；4.5min 4.5min内分离了内分离了2424种金属离子；种金属离子；阳极进样，阴极检测；阳极进样，阴极检测；具有很高的灵敏度；具有很高的灵敏度；6/15/2024231、离子分析analysisofion阳离子分析8/阴离子分析阴离子分析 阴离子电泳方向和电渗阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低；析时间长、效率低；质量小、电荷密度大的质量小、电荷密度大的离子如：离子如：SOSO4 42-2-、ClCl-、F F-等，等，电泳速率大于电渗流，阳极电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；端流出，在阴极端无法检测；加入电渗流改性剂，十加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，电泳方向和电渗流方向一致，可在可在3.1min3.1min内分离内分离3636种阴离种阴离子；阴极进样，阳极检测；子；阴极进样，阳极检测；离子价态及存在形态分析；离子价态及存在形态分析；毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（CZECZE）；）；）；）；6/15/202424阴离子分析阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分2 2、药物分析、药物分析analysisofpharmaceutics 检测体液或细胞中检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；某些代谢产物的分析；尿液中的氨基酸含尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；的辅助手段；采用毛细管区带电采用毛细管区带电泳方式，在泳方式，在11min11min内分离内分离1717种药物；种药物；6/15/2024252、药物分析analysisofpharmaceut采用MEKC模式，鉴定违禁药物；效果优于HPLG法毛细管电动力学色毛细管电动力学色谱谱(MEKC)6/15/202426采用MEKC模式，鉴定违禁药物；效果优于HPLG法毛细管电动3 3、手性化合物分析、手性化合物分析analysisofchiralcompounds 合成获得单一手性化合物相当困难；合成获得单一手性化合物相当困难；528528种手性合成药物，种手性合成药物，6161中以单一对映体形式销售，其他为外消旋体；检测分析也中以单一对映体形式销售，其他为外消旋体；检测分析也相当困难；研究热点；相当困难；研究热点；R-R-反应是安眠药，反应是安眠药，S-S-式致胎儿畸形；式致胎儿畸形；HPCE HPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；形成配合物的稳定常数有差异，结合形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCEHPCE的高效率；的高效率；常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）6/15/2024273、手性化合物分析analysisofchiral4 4、氨基酸与蛋白质分析、氨基酸与蛋白质分析 analysisofaminoacids采用采用MEKCMEKC模式，在模式，在2525分钟内分离了分钟内分离了2323种丹酰化氨基酸；种丹酰化氨基酸；HPCEHPCE可取代传统的氨基酸分析仪；可取代传统的氨基酸分析仪；问题：吸附和检测；问题：吸附和检测；毛细管电动力学色谱毛细管电动力学色谱(MEKC)6/15/2024284、氨基酸与蛋白质分析analysisofamino蛋白质分析蛋白质分析6/15/202429蛋白质分析8/9/2023295 5、核酸分析及、核酸分析及DNADNA排序排序 analysisofnucleicacidsandsequenceofDNA重要分析手段；重要分析手段；图，酶解的双螺旋图，酶解的双螺旋DNADNA限制性片段的限制性片段的分离；分离；毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（CGECGE）6/15/2024305、核酸分析及DNA排序analysisofnucl6 6、新进展、新进展advancesandspecialtopics1.1.微型化微型化 整体化学分析系统（整体化学分析系统（TASTAS）及）及TASTAS微型化微型化 在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数理论塔板数10105 5/m/m；2.2.联用仪器联用仪器 CE-MS CE-MS；3.3.阵列毛细管凝胶电泳阵列毛细管凝胶电泳 应用于人类基因应用于人类基因DNADNA测序；测序；5 51010万个基因，万个基因，3030亿个碱基对，目前最有效的亿个碱基对，目前最有效的DNADNA序列序列分析仪，分析仪，1010小时小时/次；可同时电泳次；可同时电泳2424个样品；速度个样品；速度12001200碱基对碱基对/小时，提高速度！小时，提高速度！100100支毛细管阵列电泳；速度支毛细管阵列电泳；速度280280碱基对碱基对/小时小时/支支6/15/2024316、新进展advancesandspecialtop参考文献参考文献仪器分析仪器分析,吴谋成主编,北京:科学出版社，2003现代生物样品分离分析方法现代生物样品分离分析方法,张玉奎等编,北京:科学出版社,2003蛋白质化学与蛋白质组学蛋白质化学与蛋白质组学,夏其昌等编著,北京:科学出版社,2004毛细管电泳技术发展及应用前景毛细管电泳技术发展及应用前景,王雅杰,张银等毛细管电泳原理及在药学领域的应用毛细管电泳原理及在药学领域的应用,卞红平6/15/202432参考文献仪器分析,吴谋成主编,北京:科学出版社，2003