植物生物工程实验二（植物DNA的提取）课件

植物生物工程实验植物植物DNADNA提取、质量检测提取、质量检测及特定基因片段操作及特定基因片段操作综合实验二郝大海郝大海植物生物工程实验植物DNA提取、质量检测综合实验二郝大海实验目的了解植物DNA提取方法，熟悉操作步骤掌握植物大分子操作注意事项及试剂用具准备方法掌握DNA质量紫外分光光度计检测方法了解PCR原理，熟悉操作步骤掌握核酸的琼脂糖电泳检测方法实验目的了解植物DNA提取方法，熟悉操作步骤保保证DNA一一级结构的完整性构的完整性 排除其它分子的排除其它分子的污染染RNA、蛋白、蛋白质、多糖等、多糖等DNA提取的原则提取的原则实验原理（DNA提取）保证DNA一级结构的完整性DNA提取的原则实验原理（DNADNA存在部位主主要要存存在在于于细胞胞核核中中，线粒粒体体和和叶叶绿体体中中也也少少量量存在存在DNA存在部位主要存在于细胞核中，线粒体和叶绿体中也少量存在基因基因组DNA的提取的提取 CTAB法法 SDS法法质粒粒DNA的提取的提取 碱裂解法碱裂解法 煮沸法煮沸法线粒体、叶粒体、叶绿体体DNA的提取的提取 差速离心差速离心结合合SDS裂解法裂解法DNA提取的方法提取的方法基因组DNA的提取DNA提取的方法在在浓氯化化钠溶溶液液(12mol/L)中中,DNA核核蛋蛋白白的的溶溶解解度度很很大大,RNA核核蛋蛋白白的的溶溶解解度度很很小小;而而在在稀稀氯化化钠溶溶液液(0.14mol/L)中中,DNA核核蛋蛋白白的的溶溶解解度度很很小小,RNA核核蛋蛋白白的的溶溶解解度度很很大大.因因此此,可可利利用用不不同同浓度度的的氯化化钠溶溶液液将将DNA核核蛋蛋白白和和RNA核核蛋蛋白白从从样品品中中分分别抽抽提提出来出来.l分离得到核蛋白后分离得到核蛋白后,需进一步将蛋白等杂质除去需进一步将蛋白等杂质除去,常采用的去除蛋常采用的去除蛋白的方法有白的方法有3种种:用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液,使其乳化使其乳化,然后离心然后离心除去变性蛋白质除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间,而而DNA溶于上层水相溶于上层水相.用两倍体积用两倍体积95%乙醇溶液将乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出钠盐沉淀出来来.如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀,得到的是游离的得到的是游离的DNA.用十二烷基硫酸钠用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性等去污剂使蛋白质变性,与核酸分离与核酸分离,从而从材料中直接提取出从而从材料中直接提取出DNA.用苯酚处理用苯酚处理,然后离心分层然后离心分层,DNA或溶于上层水相或溶于上层水相,或存在于中间或存在于中间残留物中残留物中,蛋白变性后则停留在酚层内蛋白变性后则停留在酚层内.吸出上面水层吸出上面水层,将其注入两将其注入两倍体积的倍体积的95%乙醇溶液中乙醇溶液中,得到白色纤维状得到白色纤维状DNA沉淀沉淀在浓氯化钠溶液(12mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很CTAB法原理 CTABCTAB（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物高盐溶液中（高盐溶液中（高盐溶液中（高盐溶液中（0.7mol/L NaCl0.7mol/L NaCl），该复合物可溶的），该复合物可溶的），该复合物可溶的），该复合物可溶的 有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质上清加入乙醇沉淀上清加入乙醇沉淀上清加入乙醇沉淀上清加入乙醇沉淀DNADNA。CTABCTAB溶液在低于溶液在低于15 15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于1515。CTABCTAB法原理CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），CTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方 组份组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl CTAB-巯基乙巯基乙醇醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用）使用前加入前加入CTAB提取缓冲液的经典配方组份Tris-HCSDS法原理原理SDS 阴离子去垢阴离子去垢剂高温（5565）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析高高盐(KAc或或NH4Ac)或降低温度（冰浴）或降低温度（冰浴）使蛋白质及多糖杂质沉淀上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提仿抽提乙醇沉淀水相中的DNASDSSDS法原理SDS 组份组份 Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl SDS 终浓终浓度度 100mM 20 mM1.4M2%(W/V)SDS提取缓冲液的配方提取缓冲液的配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pHDNA提取基本步骤提取基本步骤材料准备材料准备材料准备材料准备细胞裂解细胞裂解细胞裂解细胞裂解核酸分离纯化核酸分离纯化核酸分离纯化核酸分离纯化核酸沉淀核酸沉淀核酸沉淀核酸沉淀核酸溶解保存核酸溶解保存核酸溶解保存核酸溶解保存DNA提取基本步骤材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶 基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA 新鲜材料，低温保存新鲜材料，低温保存新鲜材料，低温保存新鲜材料，低温保存 细胞培养时间不能过长细胞培养时间不能过长细胞培养时间不能过长细胞培养时间不能过长材料准备材料准备基因组DNA材料准备基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA材料过多影响裂解，导致材料过多影响裂解，导致材料过多影响裂解，导致材料过多影响裂解，导致DNADNADNADNA量少，纯度低量少，纯度低量少，纯度低量少，纯度低针针针针对对对对不不不不同同同同材材材材料料料料，选选选选择择择择适适适适当当当当的的的的裂裂裂裂解解解解预预预预处处处处理理理理方方方方式式式式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨 培养细胞蛋白酶培养细胞蛋白酶培养细胞蛋白酶培养细胞蛋白酶K K K K细胞裂解细胞裂解基因组DNA细胞裂解l l采用吸附材料吸附分离采用吸附材料吸附分离采用吸附材料吸附分离采用吸附材料吸附分离DNADNA，应提供相应的缓冲体系，应提供相应的缓冲体系，应提供相应的缓冲体系，应提供相应的缓冲体系l l采用有机溶剂（酚采用有机溶剂（酚采用有机溶剂（酚采用有机溶剂（酚/氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀l l离心分离两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的转速和时间l l针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法质的方法质的方法质的方法核酸分离纯化核酸分离纯化采用吸附材料吸附分离DNA，应提供相应的缓冲体系核酸分离纯化l多糖的去除：多糖的去除：l多糖水解酶多糖水解酶l蛋白质的去除：蛋白质的去除：l酚酚/氯仿抽提氯仿抽提l使用变性剂（使用变性剂（SDS、异硫氰酸胍、异硫氰酸胍等）等）l蛋白酶处理蛋白酶处理l多酚的去除：多酚的去除：l加入还原剂：加入还原剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等l加入易与酚类结合的试剂：如加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG，可防止酚类与，可防止酚类与DNA的结合的结合l盐离子的去除：盐离子的去除：l70的乙醇洗涤的乙醇洗涤多糖的去除：蛋白质的去除：多酚的去除：l l预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀l l加入加入加入加入1/101/10体积的体积的体积的体积的NaAcNaAc（pH5.2pH5.2，3M3M）更充）更充）更充）更充分沉淀分沉淀分沉淀分沉淀l l晾干晾干晾干晾干DNADNA，让乙醇充分挥发，让乙醇充分挥发，让乙醇充分挥发，让乙醇充分挥发核酸沉淀核酸沉淀p若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解缓冲液溶解p pH值为值为8.0，可防止，可防止DNA发生酸解发生酸解预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀核酸沉淀若长期储存建议使用TDNA质量检测紫紫 外外 分分 光光 光光 度度 计 检 测 法法嘌呤呤和和嘧啶的的母母环含含有有共共轭双双键，因因此此也也 有有 紫紫 外外 吸吸 收收 现 象象，且且 在在 260nm和和280nm处也也存存在在吸吸收收峰峰。蛋蛋白白质中中含含苯苯环的的氨氨基基酸酸在在这两两个个波波长下下也也会会发生生光光吸吸收收。因因此此，通通过260nm和和280nm下下样品的吸收品的吸收值比率可判断核酸比率可判断核酸纯度度DNA质量检测紫外分光光度计检测法嘌呤和嘧啶的母环含有共轭A：测：测DNA：纯纯的的DNA样样品品OD260/OD280应应为为1.8，OD260mOD230应大于应大于2.0。1)OD260/OD280大于大于1.9时，表明有时，表明有RNA污染。污染。2)小于小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；3)OD260/OD230小小于于2.0时时，表表明明溶溶液液中中有有残残存存的的盐盐和和小小分分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。注注：可可能能出出现现既既含含蛋蛋白白质质又又含含RNA的的DNA溶溶液液比比值值为为1.8的的情情况。况。测定结果分析测定结果分析A：测DNA：测定结果分析琼脂糖电泳琼脂脂糖糖凝凝胶胶电泳泳是是常常用用的的用用于于分分离离、鉴定定DNA、RNA分分子子混混合合物物的的方方法法，这种种电泳泳方方法法以以琼脂脂凝凝胶胶作作为支支持持物物，利利用用DNA分分子子在在泳泳动时的的电荷荷效效应和和分分子子筛效效应，达达到到分分离离混混合合物物的的目目的的。DNA分分子子在在高高于于其其等等电点点的的溶溶液液中中带负电，在在电场中中向向阳阳极极移移动。在在一一定定的的电场强度度下下，DNA分分子子的的迁迁移移速速度度取取决决于于分分子子筛效效应，即即分分子子本本身身的的大大小小和和构构型型是是主主要要的的影影响响因因素素。DNA分分子子的的迁移速度与其相迁移速度与其相对分子量成反比。分子量成反比。琼脂糖电泳琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNADNA、RNA在在荧光光染染料料溴溴乙乙锭(EB)嵌嵌入入碱碱基基平平面面之之间后后，DNA、RNA样品品在在紫紫外外光光激激发下下，可可发出出红色色荧光光，荧光光强度度与与核核酸酸含含量量成成正正比比。使使用用一一系系列列已已知知的的不不同同浓度度DNA溶液作溶液作标准准对照，可比照，可比较出被出被测DNA溶液溶液浓度。度。注意：此法的比注意：此法的比较主要基于目主要基于目测，是估，是估计水平。水平。当当 用用 低低 浓 度度 的的 荧 光光 嵌嵌 入入 染染 料料 溴溴 化化 乙乙 啶(Ethidium bromide,EB)染染色色，在在紫紫外外光光下下至至少少可可以以检出出1-10ng的的DNA条条带，从从而而可可以以确确定定DNA片片段段在在凝凝胶胶中中的的位位置置。此此外外，还可可以以从从电泳泳后后的的凝凝胶胶中中回回收收特特定定的的DNA条条带，用用于以后的克隆操作于以后的克隆操作DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，D根据OD260定量：測定260nm吸光值，OD=1.0代表值如下：a.dsDNA(doublestrandedDNA)=50mg/mlb.ssDNA(singlestrandedDNA)=40mg/mlc.oligonucleotide=33mg/ml根据OD260定量：植物生物工程实验二（植物DNA的提取）课件PCR实验原理聚聚合合酶链式式反反应(polymerase chain reaction,PCR)，是是一一种种在在体体外外快快速速扩增增特特定定基基因因或或DNA序序列列的的方方法法，故又称故又称为基因的体外基因的体外扩增法。增法。在在待待扩增增的的DNA片片断断两两侧和和与与其其两两侧互互补的的两两个个寡寡核核苷苷酸酸引引物物，经变性性、退退火火和和延延伸伸若若干干个个循循环后后，DNA扩增增2n倍。倍。PCR实验原理聚合酶链式反应(polymerasechaiDNA复制复制（replication）起始起始解旋解旋引物引物酶结合合延伸延伸连接接终止止解链方向解链方向335 35353533 5 3 DNA复制（replication）起始解旋引物酶结植物生物工程实验二（植物DNA的提取）课件植物生物工程实验二（植物DNA的提取）课件温度温度温度温度（）时间时间时间时间（minmin）9494727260609494变性变性变性变性（1min1min）6060退火退火退火退火（1min1min）7272延伸延伸延伸延伸（1.5min1.5min）循环循环循环循环11循环循环循环循环22循环循环循环循环3 3PCRPCRPCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期PCR PCR PCR PCR 反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由DNADNADNADNA变性、引物退火和反应变性、引物退火和反应变性、引物退火和反应变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94949494变性变性变性变性1min1min1min1min，60 60 60 60 退火退火退火退火1min1min1min1min，72 72 72 72 延伸延伸延伸延伸1.5min1.5min1.5min1.5min。如此周而复始，重复进行，直。如此周而复始，重复进行，直。如此周而复始，重复进行，直。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。至扩增产物的数量满足实验需求为止。至扩增产物的数量满足实验需求为止。至扩增产物的数量满足实验需求为止。温度（）时间（min）9494变性（1min）60退一般一般PCR反应条件反应条件一般PCR反应条件仪器药品1.5ml离离心心管管；5ml离离心心管管；研研磨磨棒棒；5ml吸吸头；1000ul吸吸头（盒盒）；200ul吸吸头（盒盒）；10ul吸吸头（盒盒）；5ml移移液液器器；1000ul移移液液器器；200ul移移液液器器；30ul移移液液器器；2ul移移液液器；器；试剂瓶；量筒瓶；量筒恒恒温温水水浴浴锅；高高速速离离心心机机；紫紫外外分分光光光光度度计；电泳泳仪；电泳槽；酸度泳槽；酸度计；电子天平；子天平；PCR仪CTAB；NaCl；Tris；HCl；H3BO4；EDTA；NaOH；PVP；琼脂糖；脂糖；EB；引物；引物；dNTP；Taq酶；EB仪器药品1.5ml离心管；5ml离心管；研磨棒；5ml吸头；实验步骤试剂配制试剂配制贮存液存液最最终含量含量100mlTris（121.14）1M12.114g1MTrisHCl,pH8.0先用蒸先用蒸馏水溶解加至水溶解加至90ml左右，再用左右，再用HCl调整整pH至至8.0，定容至，定容至100ml贮存液存液最最终含量含量100mlEDTA（292.25）0.5M14.613g0.5MEDTA,pH8.0先用蒸先用蒸馏水，再加入水，再加入NaOH（固体）（固体）调pH至至8.0，定容至，定容至100ml贮存液存液最最终含量含量100mlNaCl（58.44）5M29.22g蒸馏水蒸馏水定容至定容至100ml5MNaCl实验步骤试剂配制贮存液最终含量100mlTris（121.1贮存液存液最最终含量含量100mlCTAB2%2g5M NaCl1.4M28ml0.5M EDTA20mM4ml1M Tris HCl pH8.0100mM10mlPVP1%1g蒸蒸馏水水定容至定容至100ml2CTAB贮存液存液最最终含量（含量（10ml）3mlCTAB1g0.3g5M NaCl1.4ml0.42ml蒸蒸馏水水8.6ml2.58ml10%CTAB贮存液最终含量100mlCTAB2%2g5MNaCl1.4贮存液存液最最终含量含量100ml1MTrisHCl,pH8.010mM10ml0.5MEDTA,pH8.01mM2ml蒸蒸馏水水定容至定容至1000mlT10E1贮存液存液最最终含量（含量（1000ml）100mlTris54g5.4gH3BO427.5g2.75g0.5MEDTA,pH8.020ml2ml蒸蒸馏水水定容至定容至100ml5TBE贮存液最终含量100ml1MTrisHCl,pH8.异丙醇；异丙醇；70%乙醇；乙醇；90%乙醇；乙醇；10mg/ml EB贮存液存液最最终含量（含量（100ml）4.2ml异戊醇异戊醇4ml168ul氯仿仿96ml4032ul抽提液抽提液1M Tris HCl；0.5M EDTA；5M NaCl；T10E1以及以及所有需使用的离心管，各种吸头均需灭菌所有需使用的离心管，各种吸头均需灭菌异丙醇；70%乙醇；90%乙醇；10mg/mlEB贮存液最操作流程操作操作规程程1.称称取取100mg新新鲜叶叶片片，置置于于预冷冷1.5ml离离心心管管中中，加加入入液液氮氮，研研为细粉粉。加加入入350l新新鲜2CTAB缓冲冲液液，再仔再仔细研磨。（研磨。（CTAB用于抽提用于抽提DNA）2.用用350l新新鲜2CTAB缓冲冲液液，冲冲洗洗研研磨磨棒棒，加加入入2l巯基基乙乙醇醇，混混匀匀。65水水浴浴45分分钟，每每15分分钟摇动一次。冷却至室温，静置一次。冷却至室温，静置2分分钟。3.每每支支离离心心管管加加入入700l氯仿仿：异异戊戊醇醇（24：1）（672氯仿仿:28异异戊戊醇醇）混混合合液液。轻柔柔短短暂地地混混和和，避避免免DNA断断裂裂。颠倒倒几几次次。（氯仿仿、异异戊戊醇醇、苯苯酚酚都都用用于于沉淀蛋白沉淀蛋白质）4.在在微微型型离离心心机机中中，以以14，000rpm离离心心5分分钟。移移取取上上层水水层，置置于于新新的的、标识好好的的1.5ml离离心心管管中中。注注意意避免取到中避免取到中层物物质。将。将氯仿：异戊醇仿：异戊醇废液倒入液倒入废液缸。液缸。5.加加入入50l 10CTAB（溶溶于于0.7M NaCl），轻柔柔混混和和，并保并保证混和完全。混和完全。操作流程操作规程6.重复第重复第3、第、第4步。步。7.每每支支离离心心管管中中加加入入等等体体积异异丙丙醇醇（400500l）。上上下下颠倒倒几几次次，4静静置置20分分钟（或或20，15分分钟）。（异丙醇用于沉淀（异丙醇用于沉淀DNA）8.14，000rpm离离心心20分分钟。小小心心倒倒出出上上清清夜夜，避避免免DNA颗粒粒丢失。倒置离心管，空气干燥（失。倒置离心管，空气干燥（12分分钟）。）。9.用用1ml70乙乙醇醇清清洗洗DNA（3分分钟），14,000rpm离离心心30分分钟。小小心心倒倒出出70%乙乙醇醇，用用1ml 90乙乙醇醇清清洗洗DNA，14,000rpm离离心心30分分钟，小小心心地地倒倒去去乙乙醇醇。倒倒置置离离心心管管，空空气气中中干干燥燥，或或用用真真空空泵干干燥燥15分分钟。（乙醇用于去除低分子量寡核苷酸和核苷三磷酸）（乙醇用于去除低分子量寡核苷酸和核苷三磷酸）10.以以150l T10E1或或蒸蒸馏水水溶溶解解DNA，加加入入12l不不含含DNA酶的的RNA酶A（10mg/ml）。37反反应1小小时。11.4保存（保存（20长期保存）。期保存）。6.重复第3、第4步。冷却至冷却至室室温温2l-巯基乙醇巯基乙醇100mg鲜叶鲜叶水水浴浴1.5ml离心管离心管液液N2研研磨磨700lCTAB65，45离离心心/15加入加入700l氯仿：异戊醇氯仿：异戊醇（672:28）静置静置2min涡旋混和，涡旋混和，加入加入50l10CTAB温和温和短时短时514,000rpm上清夜上清夜短时短时温和温和轻柔混和轻柔混和加入等体积加入等体积异异丙丙醇醇循环循环一次一次离心离心静置静置304，20沉淀沉淀离心离心14,000rpm20空气干燥空气干燥121ml70乙醇乙醇沉淀沉淀314,000rpm沉淀沉淀加入加入150lT10E11ml90乙醇乙醇离心离心14,000rpm30空气干燥空气干燥12lRNAseA37，1h-20保存保存-20，15冷却至冷却至室室温温冷却至2l100mg鲜叶水浴1.5ml离心管液N2研琼脂糖凝胶电泳1.取取5TBE缓缓冲冲液液20mL加加水水至至100mL，配配制制成成1 1TBE稀稀释缓冲液，待用。冲液，待用。2.胶胶液液的的制制备备：称称取取0.4g琼脂脂糖糖，置置于于200mL锥形形瓶瓶中中，加加入入50mL 1TBE稀稀释缓冲冲液液，放放入入微微波波炉炉里里加加热至至琼脂脂糖糖全全部部熔熔化化，取取出出摇匀匀，此此为为1琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶液液。加加热过程程中中要不要不时摇动，使附于瓶壁上的，使附于瓶壁上的琼脂糖脂糖颗粒粒进入溶液。入溶液。琼脂糖凝胶电泳取5TBE缓冲液20mL加水至100mL，配3.胶胶板板的的制制备：将将有有机机玻玻璃璃胶胶槽槽两两端端分分别用用橡橡皮皮膏膏紧密密封封住住。将将封封好好的的胶胶槽槽置置于于水水平平支支持持物物上上，插插上上样品品梳梳子子，注注意意观察察梳梳子子齿下下缘应与与胶胶槽槽底底面面保保持持1mm左左右右的的间间隙隙。向向冷冷却却至至50-60的的琼琼脂脂糖糖胶胶液液中中加加入入溴溴化化乙乙锭锭(EB)溶溶液液使使其其终终浓浓度度为为0.5g/mL。用用移移液液器器吸吸取取少少量量融融化化的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶封封橡橡皮皮膏膏内内侧侧，待待琼琼脂脂糖糖溶溶液液凝凝固固后后将将剩剩余余的的琼琼脂脂糖糖小小心心地地倒倒入入胶胶槽槽内内，使使胶胶液液形形成成均均匀匀的的胶胶层层。待待胶胶完完全全凝凝固固后后拨拨出出梳梳子子，注注意意不不要要损损伤伤梳梳底底部部的的凝凝胶胶，然然后后向向槽槽内加入内加入1TBE稀稀释缓释缓冲液至液面恰好没冲液至液面恰好没过过胶板上表面。胶板上表面。3.胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏紧密封住。将4.加加样样：取取10LDNA样样品品与与2L6上上样样液液混混匀匀，用用微微量量移移液液枪枪小小心心加加入入样样品品槽槽中中。若若DNA含含量量偏偏低低，则则可可依依上上述述比比例例增增加加上上样样量量，但但总总体体积积不不可可超超过过样样品品槽槽容容量量。每每加加完完一一个个样样品品要要更更换换tip头头，以以防防止止互互相相污污染染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。5.电电泳泳：加加完完样样后后,合合上上电电泳泳槽槽盖盖，立立即即接接通通电电源源。控控制制电电压压保保持持在在60-80V，电电流流在在40mA以以上上。当当溴溴酚酚蓝蓝条条带带移移动动到到距距凝凝胶胶前前沿沿约约2cm时时，停止电泳。停止电泳。6.染染色色：未未加加EB的的胶胶板板在在电电泳泳完完毕毕后后移移入入0.5g/mL的的EB溶溶液液中中，室室温温下下染色染色20-25min。7.观观察察和和拍拍照照：在在波波长长为为254nm的的长长波波长长紫紫外外灯灯下下观观察察染染色色后后的的或或已已加加有有EB的电泳胶板。的电泳胶板。8.加样：取10LDNA样品与2L6上样液混匀，用微量紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤a a吸吸取取一一定定量量的的DNADNA样样品品或或RNARNA样样品品，加加水水至至特特定定体体积积后后，转转入入分分光光度计的光光度计的石英比色杯石英比色杯中。中。b b分光光度计先用一定量的水分光光度计先用一定量的水校正零点校正零点。c c测定待测样品在测定待测样品在230nm230nm、260nm260nm和和280nm280nm的的ODOD值。值。d d计算浓度。计算浓度。双双链链DNADNA样样品品浓浓度度(g/l)(g/l)=ODOD260260核核酸酸稀稀释释倍倍数数 50/100050/1000；e e分析纯度。分析纯度。紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤a吸取一定量的DNA样PCR反应体系成分体积DNA模板1ug前向引物(10uM)1ul后向引物(10uM)1ulMasterMix(Taq酶+缓冲液+染料)12.5ulddH2O补至25ulPCR反应体系成分体积DNA模板0.7mol/LNaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。CTAB(hexadecyltrimethylammoniu历史岳麓版第13课交通与通讯的变化资料精品课件欢迎使用历史岳麓版第13课交通与通讯的变化资料精品课件欢迎使用植物生物工程实验二（植物DNA的提取）课件植物生物工程实验二（植物DNA的提取）课件植物生物工程实验二（植物DNA的提取）课件自读教材自读教材填要点填要点一、铁路，更多的铁路一、铁路，更多的铁路1地位地位铁路是铁路是建设的重点，便于国计民生，成为国民经济建设的重点，便于国计民生，成为国民经济发展的动脉。发展的动脉。2出现出现1881年，中国自建的第一条铁路年，中国自建的第一条铁路唐山唐山至胥各庄铁至胥各庄铁路建成通车。路建成通车。1888年，年，宫廷宫廷专用铁路落成。专用铁路落成。交通运输交通运输开平开平自读教材填要点一、铁路，更多的铁路交通运输开平3发展发展(1)原因：原因：甲午战争以后列强激烈争夺在华铁路的甲午战争以后列强激烈争夺在华铁路的。修路成为中国人修路成为中国人的强烈愿望。的强烈愿望。(2)成果：成果：1909年年建成通车；民国以后，各条商路修筑建成通车；民国以后，各条商路修筑权收归国有。权收归国有。4制约因素制约因素政潮迭起，军阀混战，社会经济凋敝，铁路建设始终未入政潮迭起，军阀混战，社会经济凋敝，铁路建设始终未入正轨。正轨。修筑权修筑权救亡图存救亡图存京张铁路京张铁路3发展修筑权救亡图存京张铁路二、水运与航空二、水运与航空1水运水运(1)1872年年,正式成立，标志着中国新式航运业的诞生。正式成立，标志着中国新式航运业的诞生。(2)1900年前后，民间兴办的各种轮船航运公司近百家，几乎都是年前后，民间兴办的各种轮船航运公司近百家，几乎都是在列强排挤中艰难求生。在列强排挤中艰难求生。2航空航空(1)起步：起步：1918年，附设在福建马尾造船厂的海军飞机工程处开始年，附设在福建马尾造船厂的海军飞机工程处开始研制研制。(2)发展：发展：1918年，北洋政府在交通部下设年，北洋政府在交通部下设“”；此后十年间，航空事业获得较快发展。；此后十年间，航空事业获得较快发展。轮船招商局轮船招商局水上飞机水上飞机筹办航空事宜筹办航空事宜处处二、水运与航空轮船招商局水上飞机筹办航空事宜处三、从驿传到邮政三、从驿传到邮政1邮政邮政(1)初办邮政：初办邮政：1896年成立年成立“大清邮政局大清邮政局”，此后又设，此后又设，邮传正式脱离海关。，邮传正式脱离海关。(2)进一步发展：进一步发展：1913年，北洋政府宣布裁撤全部驿站；年，北洋政府宣布裁撤全部驿站；1920年，中国首次参加年，中国首次参加。邮传部邮传部万国邮联大会万国邮联大会三、从驿传到邮政邮传部万国邮联大会2电讯电讯(1)开端：开端：1877年，福建巡抚在年，福建巡抚在架设第一条电报线，成为中国自架设第一条电报线，成为中国自办电报的开端。办电报的开端。(2)特点：进程曲折，发展缓慢，直到特点：进程曲折，发展缓慢，直到20世纪世纪30年代情况才发生变年代情况才发生变化。化。3交通通讯变化的影响交通通讯变化的影响(1)新式交通促进了经济发展，改变了人们的通讯手段和新式交通促进了经济发展，改变了人们的通讯手段和，转变了人们的思想观念。转变了人们的思想观念。(2)交通近代化使中国同世界的联系大大增强，使异地传输更为便交通近代化使中国同世界的联系大大增强，使异地传输更为便捷。捷。(3)促进了中国的经济与社会发展，也使人们的生活促进了中国的经济与社会发展，也使人们的生活。台湾台湾出行出行方式方式多姿多彩多姿多彩2电讯台湾出行方式多姿多彩合作探究合作探究提认知提认知电视剧电视剧闯关东闯关东讲述了济南章丘朱家峪人朱开山一家，讲述了济南章丘朱家峪人朱开山一家，从清末到九一八事变爆发闯关东的前尘往事。下图是朱开山从清末到九一八事变爆发闯关东的前尘往事。下图是朱开山一家从山东辗转逃亡到东北途中可能用到的四种交通工具。一家从山东辗转逃亡到东北途中可能用到的四种交通工具。合作探究提认知电视剧闯关东讲述了济南章丘依据材料概括晚清中国交通方式的特点，并分析其成因。依据材料概括晚清中国交通方式的特点，并分析其成因。提示：提示：特点：新旧交通工具并存特点：新旧交通工具并存(或：传统的帆船、独轮车，或：传统的帆船、独轮车，近代的小火轮、火车同时使用近代的小火轮、火车同时使用)。原因：近代西方列强的侵略加剧了中国的贫困，阻碍社会发原因：近代西方列强的侵略加剧了中国的贫困，阻碍社会发展；西方工业文明的冲击与示范；中国民族工业的兴起与发展；展；西方工业文明的冲击与示范；中国民族工业的兴起与发展；政府及各阶层人士的提倡与推动。政府及各阶层人士的提倡与推动。依据材料概括晚清中国交通方式的特点，并分析其成因。串点成面串点成面握全局握全局串点成面握全局植物生物工程实验二（植物DNA的提取）课件一、近代交通业发展的原因、特点及影响一、近代交通业发展的原因、特点及影响1原因原因(1)先进的中国人为救国救民，积极兴办近代交通业，促先进的中国人为救国救民，积极兴办近代交通业，促进中国社会发展。进中国社会发展。(2)列强侵华的需要。为扩大在华利益，加强控制、镇压列强侵华的需要。为扩大在华利益，加强控制、镇压中国人民的反抗，控制和操纵中国交通建设。中国人民的反抗，控制和操纵中国交通建设。(3)工业革命的成果传入中国，为近代交通业的发展提供工业革命的成果传入中国，为近代交通业的发展提供了物质条件。了物质条件。一、近代交通业发展的原因、特点及影响2特点特点(1)近代中国交通业逐渐开始近代化的进程，铁路、水运和航近代中国交通业逐渐开始近代化的进程，铁路、水运和航空都获得了一定程度的发展。空都获得了一定程度的发展。(2)近代中国交通业受到西方列强的控制和操纵。近代中国交通业受到西方列强的控制和操纵。(3)地域之间的发展不平衡。地域之间的发展不平衡。3影响影响(1)积极影响：促进了经济发展，改变了人们的出行方式，一积极影响：促进了经济发展，改变了人们的出行方式，一定程度上转变了人们的思想观念；加强了中国与世界各地的联定程度上转变了人们的思想观念；加强了中国与世界各地的联系，丰富了人们的生活。系，丰富了人们的生活。(2)消极影响：有利于西方列强的政治侵略和经济掠夺。消极影响：有利于西方列强的政治侵略和经济掠夺。2特点1李鸿章李鸿章1872年在上海创办轮船招商局，年在上海创办轮船招商局，“前前10年盈和，成年盈和，成为长江上重要商局，招商局和英商太古、怡和三家呈鼎立为长江上重要商局，招商局和英商太古、怡和三家呈鼎立之势之势”。这说明该企业的创办。这说明该企业的创办()A打破了外商对中国航运业的垄断打破了外商对中国航运业的垄断B阻止了外国对中国的经济侵略阻止了外国对中国的经济侵略C标志着中国近代化的起步标志着中国近代化的起步D使李鸿章转变为民族资本家使李鸿章转变为民族资本家1李鸿章1872年在上海创办轮船招商局，“前10年盈和，成解析：解析：李鸿章是地主阶级的代表，并未转化为民族资本家；李鸿章是地主阶级的代表，并未转化为民族资本家；洋务运动标志着中国近代化的开端，但不是具体以某个企业洋务运动标志着中国近代化的开端，但不是具体以某个企业的创办为标志；洋务运动中民用企业的创办在一定程度上抵的创办为标志；洋务运动中民用企业的创办在一定程度上抵制了列强的经济侵略，但是并未能阻止其侵略。故制了列强的经济侵略，但是并未能阻止其侵略。故B、C、D三项表述都有错误。三项表述都有错误。答案：答案：A解析：李鸿章是地主阶级的代表，并未转化为民族资本家；洋务运动二、近代以来交通、通讯工具的进步对人们社会生活的影二、近代以来交通、通讯工具的进步对人们社会生活的影响响(1)交通工具和交通事业的发展，不仅推动各地经济文化交交通工具和交通事业的发展，不仅推动各地经济文化交流和发展，而且也促进信息的传播，开阔人们的视野，加快流和发展，而且也促进信息的传播，开阔人们的视野，加快生活的节奏，对人们的社会生活产生了深刻影响。生活的节奏，对人们的社会生活产生了深刻影响。(2)通讯工具的变迁和电讯事业的发展，使信息的传递变得通讯工具的变迁和电讯事业的发展，使信息的传递变得快捷简便，深刻地改变着人们的思想观念，影响着人们的社快捷简便，深刻地改变着人们的思想观念，影响着人们的社会生活。会生活。二、近代以来交通、通讯工具的进步对人们社会生活的影响2清朝黄遵宪曾作诗曰：清朝黄遵宪曾作诗曰：“钟声一及时，顷刻不少留。虽钟声一及时，顷刻不少留。虽有万钧柁，动如绕指柔。有万钧柁，动如绕指柔。”这是在描写这是在描写()A电话电话B汽车汽车C电报电报D火车火车解析：解析：从从“万钧柁万钧柁”“动如绕指柔动如绕指柔”可推断为火车。可推断为火车。答案：答案：D2清朝黄遵宪曾作诗曰：“钟声一及时，顷刻不少留。虽植物生物工程实验二（植物DNA的提取）课件典题例析典题例析例例1上海世博会曾吸引了大批海内外人士利用各种上海世博会曾吸引了大批海内外人士利用各种交通工具前往参观。然而在交通工具前往参观。然而在19世纪七十年代，江苏沿江世纪七十年代，江苏沿江居民到上海，最有可能乘坐的交通工具是居民到上海，最有可能乘坐的交通工具是()A江南制造总局的汽车江南制造总局的汽车B洋人发明的火车洋人发明的火车C轮船招商局的轮船轮船招商局的轮船D福州船政局的军舰福州船政局的军舰典题例析例1上海世博会曾吸引了大批海内外人解析解析由材料信息由材料信息“19世纪七十年代，由江苏沿江居民世纪七十年代，由江苏沿江居民到上海到上海”可判断最有可能是轮船招商局的轮船。可判断最有可能是轮船招商局的轮船。答案答案C解析由材料信息“19世纪七十年代，由江苏沿江居题组冲关题组冲关1中国近代史上首次打破列强垄断局面的交通行业是中国近代史上首次打破列强垄断局面的交通行业是()A公路运输公路运输B铁路运输铁路运输C轮船运输轮船运输D航空运输航空运输解析：解析：根据所学根据所学1872年李鸿章创办轮船招商局，这是洋务年李鸿章创办轮船招商局，这是洋务运动中由军工企业转向兼办民用企业、由官办转向官督商运动中由军工企业转向兼办民用企业、由官办转向官督商办的第一个企业。具有打破外轮垄断中国航运业的积极意办的第一个企业。具有打破外轮垄断中国航运业的积极意义，这在一定程度上保护了中国的权利。据此本题选义，这在一定程度上保护了中国的权利。据此本题选C项。项。答案：答案：C题组冲关1中国近代史上首次打破列强垄断局面的交通行业是2.右图是右图是1909年年民呼日报民呼日报上登载的上登载的一幅漫画，其要表达的主题是一幅漫画，其要表达的主题是()A帝国主义掠夺中国铁路权益帝国主义掠夺中国铁路权益B西方国家学习中国文化西方国家学习中国文化C西方列强掀起瓜分中国狂潮西方列强掀起瓜分中国狂潮D西方八国组成联军侵略中国西方八国组成联军侵略中国2.右图是1909年民呼日报上登载的解析：解析：从图片中可以了解到各国举的灯笼是火车形状，从图片中可以了解到各国举的灯笼是火车形状，20世纪初的这一幅漫画正反映了帝国主义掠夺中国铁路世纪初的这一幅漫画正反映了帝国主义掠夺中国铁路权益。权益。B项说法错误，项说法错误，C项不能反映漫画的主题，项不能反映漫画的主题，D项时项时间上不一致。间上不一致。答案：答案：A解析：从图片中可以了解到各国举的灯笼是火车形状，20世纪初的植物生物工程实验二（植物DNA的提取）课件典题例析典题例析例例2(2010福建高考福建高考)上海是近代中国茶叶的一个外销上海是近代中国茶叶的一个外销中心。中心。1884年，福建茶叶市场出现了茶叶收购价格与上海出年，福建茶叶市场出现了茶叶收购价格与上海出口价格同步变动的现象。与这一现象直接相关的近代事业是口价格同步变动的现象。与这一现象直接相关的近代事业是()A电报业电报业B大众报业大众报业C铁路交通业铁路交通业D轮船航运业轮船航运业解析解析材料主要反映了信息交流的快捷，故选材料主要反映了信息交流的快捷，故选A。答案答案A典题例析例2(2010福建高考)上海是近题组冲关题组冲关3假如某爱国实业家在假如某爱国实业家在20世纪初需要了解全国各地商业信世纪初需要了解全国各地商业信息，可采用的最快捷的方式是息，可采用的最快捷的方式是()A乘坐飞机赴各地了解乘坐飞机赴各地了解B通过无线电报输送讯息通过无线电报输送讯息C通过互联网通过互联网D乘坐火车赴各地了解乘坐火车赴各地了解解析：解析：本题考查中国近代物质生活的变迁。注意题干信本题考查中国近代物质生活的变迁。注意题干信息息“20世纪初世纪初”“最快捷的方式最快捷的方式”，因此应选，因此应选B，火车速度，火车速度远不及电报快。远不及电报快。20世纪世纪30年代民航飞机才在中国出现，年代民航飞机才在中国出现，互联网出现在互联网出现在20世纪世纪90年代。年代。答案：答案：B题组冲关3假如某爱国实业家在20世纪初需要了解全国各地4下列不属于通讯工具变迁和电讯事业发展影响的是下列不属于通讯工具变迁和电讯事业发展影响的是()A信息传递快捷简便信息传递快捷简便B改变着人们的思想观念改变着人们的思想观念C阻碍了人们的感情交流阻碍了人们的感情交流D影响着人们的社会生活影响着人们的社会生活解析：解析：新式通讯工具方便快捷，便于人们感情的沟通和交流。新式通讯工具方便快捷，便于人们感情的沟通和交流。答案：答案：C4下列不属于通讯工具变迁和电讯事业发展影响的是()植物生物工程实验二（植物DNA的提取）课件关关键词交通和通交通和通讯不断不断进步、辛亥革命和国民大革命步、辛亥革命和国民大革命顺应时代潮流代潮流图说历史史主旨句主旨句归纳(1)近代交通由近代交通由传统传统的人力工具逐的人力工具逐渐渐演演变为变为机械机械动动力力牵牵引的新式交通工具，火引的新式交通工具，火车车、汽汽车车、电车电车、轮轮船、船、飞飞机先后出机先后出现现。(2)通通讯讯工具由工具由传统传统的的邮邮政通信政通信发发展展为为先先进进的的电讯电讯工具，有工具，有线电报线电报、电话电话、无、无线电线电报报先后先后发发明。明。(3)近代以来，交通、通近代以来，交通、通讯讯工具的工具的进进步，推步，推动动了了经济经济与社会的与社会的发发展。展。关键词交通和通讯不断进步、辛亥革命和国民大革命顺应图说历关关键词交交通通和和通通讯不不断断进步步、辛辛亥亥革革命命和和国国民民大大革革命命顺应时代潮流代潮流图说历史史主旨句主旨句归纳(1)1911年，革命党人年，革命党人发动发动武昌起武昌起义义，辛亥革，辛亥革命命爆爆发发，随后建立了中，随后建立了中华华民国，民国，颁颁布了布了中中华华民国民国临时约临时约法法；辛亥革命是中国近代化；辛亥革命是中国近代化进进程的里程碑。程的里程碑。(2)1924年国民党年国民党“一大一大”召开，召开，标标志着第志着第一一次次国共国共合作正式合作正式实现实现，国民大革命，国民大革命兴兴起。起。(3)1926年国民革命年国民革命军军出出师师北伐，北伐，连连克武昌、克武昌、九九江，直江，直捣捣南京、上海，取得巨大成功。南京、上海，取得巨大成功。关键词交通和通讯不断进步、辛亥革命和国民大革命顺应时图说关关键词交通和通交通和通讯不断不断进步、辛亥革命和国民大革命步、辛亥革命和国民大革命顺应时代潮流代潮流图说历史史主旨句主旨句归纳(1)20世世纪纪初，初，孙孙中山提出中山提出“民族、民民族、民权权、民生民生”三民主三民主义义，成，成为为以后辛亥革命以后辛亥革命的的指指导导思想。思想。(2)三民主三民主义义没有明确提出反帝要求，也没有明确提出反帝要求，也没没有提出有提出废废除封建土地制度，是一个不除封建土地制度，是一个不彻彻底的底的资产阶级资产阶级革命革命纲领纲领。(3)1924年，年，孙孙中山将三民主中山将三民主义发义发展展为为新新三三民主民主义义，明确提出了反帝要求，它成，明确提出了反帝要求，它成为为第一次国共合作的政治基第一次国共合作的政治基础础和国民大和国民大革革命的旗命的旗帜帜。关键词交通和通讯不断进步、辛亥革命和国民大革命顺应时图说