酶的分子修饰课件

Chapter 5 Modification of Enzyme Molecule第五章第五章 酶的分子修饰酶的分子修饰1酶的分子修饰Contents of chapter 5酶分子修饰种类 为什么要进行酶分子修饰酶分子修饰部位及专一性分类酶修饰后的性质变化GoGoGoGo酶的定向进化Go2酶的分子修饰什么是酶分子修饰？什么是酶分子修饰？o通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。3酶的分子修饰第一节 为什么要进行酶修饰o限制酶大规模应用的原因：限制酶大规模应用的原因：1)细胞外稳定性差；细胞外稳定性差；2)酶活性不够高；酶活性不够高；3)具有抗原性。具有抗原性。4酶的分子修饰酶化学修饰的意义酶化学修饰的意义(1).(1).研究酶的结构与功能的关系。（研究酶的结构与功能的关系。（5050年代末）年代末）(2).(2).人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围。（范围。（7070年代末之后）年代末之后）1 1）提高酶的生物活性（酶活力）。）提高酶的生物活性（酶活力）。2 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。3 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。4 4）产生新的催化能力。）产生新的催化能力。5酶的分子修饰1）提高酶的生物活性（酶活力）提高酶的生物活性（酶活力）o蛋白一级结构通过内部氨基酸侧链基团的相蛋白一级结构通过内部氨基酸侧链基团的相互作用互作用,按热力学最稳定方式形成了特有的按热力学最稳定方式形成了特有的高级结构高级结构.(即一级结构的氨基酸顺序决定了即一级结构的氨基酸顺序决定了高级结构高级结构),而高级结构决定了功能而高级结构决定了功能.o一级结构修饰后发生改变很多情况下会引起一级结构修饰后发生改变很多情况下会引起高级结构发生改变高级结构发生改变,从而改变蛋白功能从而改变蛋白功能(包括包括酶活力酶活力)6酶的分子修饰o热稳定性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶内部基团形成多修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶内部基团形成多点交联。使酶的天然构象产生点交联。使酶的天然构象产生“刚性刚性”结构。结构。o对抑制剂稳定性 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，阻挡抑制剂，“遮盖遮盖”了酶的活性部位。了酶的活性部位。o对水解酶的稳定性A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。酶分子上敏感键免遭破坏。B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。水解酶破坏的可能性。2）增强酶的稳定性）增强酶的稳定性7酶的分子修饰酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。价键。破坏了抗原决定簇破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至消除抗原性降低乃至消除 “遮盖遮盖”了抗原决定簇了抗原决定簇阻碍抗原、抗体结合阻碍抗原、抗体结合3)消除抗原性消除抗原性8酶的分子修饰4)其它其它o大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成分子表面形成“缓冲外壳缓冲外壳”，抵御外界环，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定对稳定9酶的分子修饰酶蛋白化学修饰的局限性酶蛋白化学修饰的局限性1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。2.酶的化学修饰酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。构与功能关系中的作用。3.酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所明该残基是酶活性所“必需必需”的，为什么是必需的，还得的，为什么是必需的，还得用用X射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结构射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚与功能关系尚缺乏准确性和系统性。缺乏准确性和系统性。10酶的分子修饰第二节 酶分子修饰部位及专一性分类o酶蛋白结构部位分类o修饰专一性分类11酶的分子修饰酶酶分分子子非必需基团非必需基团必需基团必需基团活性中心活性中心必需基团必需基团活性中心外活性中心外必需基团必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团非活性中心非活性中心活活性性中中心心一 酶蛋白结构部位分类12酶的分子修饰13酶的分子修饰活性中心的共性活性中心的共性(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。）。(2)活性部位是一个三维实体。活性部位是一个三维实体。(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。(4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。(5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合作用等次级键结合。14酶的分子修饰活性中心的重要化学基团活性中心的重要化学基团 7 7种氨基酸出现的频率最高种氨基酸出现的频率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr SerLys Asp Glu Cys His Tyr Ser （兰天果拌猪肉丝）（兰天果拌猪肉丝）某些功能基团某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基如（氨基、羧基、巯基、羟基 和咪唑基）是酶的必需基团。和咪唑基）是酶的必需基团。赖氨酸的氨基赖氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巯基半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基组氨酸的咪唑基 酪氨酸和丝氨酸的羟基酪氨酸和丝氨酸的羟基15酶的分子修饰1)非专一性化学修饰非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。若某基团被修饰后：若某基团被修饰后：酶活性不变酶活性不变该基团可能不是酶的必需基团该基团可能不是酶的必需基团酶活性降低或丧失酶活性降低或丧失该基团可能是酶的必需基该基团可能是酶的必需基团团二 修饰专一性分类16酶的分子修饰2)专一性化学修饰（基团专一性修饰）专一性化学修饰（基团专一性修饰）用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。残基的侧链基团。3)亲和标记（位点专一性修饰）亲和标记（位点专一性修饰）采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。有活泼反应基团的底物类似物。利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。17酶的分子修饰化学修饰的专一性化学修饰的专一性18酶的分子修饰第三节第三节 酶分子的修饰方法酶分子的修饰方法 o金属离子置换修饰金属离子置换修饰o大分子结合修饰大分子结合修饰(共价共价/非共价非共价;多结合水不溶分子多结合水不溶分子)o侧链基团修饰侧链基团修饰(多结合水溶解性小分子多结合水溶解性小分子)o肽链有限水解修饰肽链有限水解修饰o氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰o酶分子的物理修饰酶分子的物理修饰 19酶的分子修饰(1)(1)酶的金属离子置换修饰酶的金属离子置换修饰o把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。o-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)o若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。20酶的分子修饰金属离子置换修饰的过程金属离子置换修饰的过程 p a.酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。p b.除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。p c.加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。p金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。p 用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。21酶的分子修饰(2)(2)酶的大分子修饰酶的大分子修饰o使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。o一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。o另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。非共价修饰非共价修饰22酶的分子修饰o用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。o例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。o每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；o每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍 共价修饰共价修饰23酶的分子修饰大分子修饰大分子修饰(共价共价)的过程的过程o修饰剂的选择修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。(均相反应,无毒害)o修饰剂的活化修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。o修饰修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。o分离分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。24酶的分子修饰o聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。它被广泛用于酶的修饰。酶 半衰期相对稳定性 天然SOD 6 min 1 右旋糖酐-SOD 7 h 70 Ficoll(低分子量)SOD 14 h 140 Ficoll(高分子量)SOD 24 h 240 聚乙二醇聚乙二醇-SOD 35 h 35025酶的分子修饰(3)(3)酶分子的侧链基团修饰酶分子的侧链基团修饰o采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。o可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响。在研究酶的活性中心中的必需基团时经常采用。o酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨氨氨氨基、羧基、巯基、胍基、酚基基、羧基、巯基、胍基、酚基基、羧基、巯基、胍基、酚基基、羧基、巯基、胍基、酚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。(一级结构是基础)26酶的分子修饰催化活性催化活性/非催化活性基团的修饰非催化活性基团的修饰o对对非催化基团非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。殊底物的束缚能力。(改变对底物亲和能力改变对底物亲和能力)o对对催化活性基团催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代。基酸的取代。(改变催化性质改变催化性质)o经常被修饰的残基是：经常被修饰的残基是：n亲核的亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、Hisn亲电的亲电的Tyr、Trp27酶的分子修饰氨基酸氨基酸侧链基团侧链基团修饰剂修饰剂Lys氨基氨基三硝基苯磺酸，三硝基苯磺酸，2，4二硝基氟苯、碘乙酸、二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸Asp、Glu羧基羧基水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺Arg胍基胍基苯乙二醛，苯乙二醛，1,2环己二酮、丁二酮环己二酮、丁二酮Cys巯基巯基碘乙酸、碘乙酰胺、碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺乙基马来酰亚胺二硫键二硫键巯基乙醇、巯基乙醇、DTTHis咪唑基咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羟基酚羟基碘、四硝基甲烷碘、四硝基甲烷Trp吲哚基吲哚基N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺 各种氨基酸侧链的修饰剂各种氨基酸侧链的修饰剂28酶的分子修饰常见基团的化学修饰反应：羧基常见基团的化学修饰反应：羧基常见基团的化学修饰反应：羧基常见基团的化学修饰反应：羧基29酶的分子修饰常见基团的化学修饰反应：氨基常见基团的化学修饰反应：氨基常见基团的化学修饰反应：氨基常见基团的化学修饰反应：氨基30酶的分子修饰常见基团的化学修饰反应：巯基常见基团的化学修饰反应：巯基常见基团的化学修饰反应：巯基常见基团的化学修饰反应：巯基31酶的分子修饰常见基团的化学修饰反应：咪唑基常见基团的化学修饰反应：咪唑基常见基团的化学修饰反应：咪唑基常见基团的化学修饰反应：咪唑基32酶的分子修饰常见基团的化学修饰反应：酚羟基常见基团的化学修饰反应：酚羟基常见基团的化学修饰反应：酚羟基常见基团的化学修饰反应：酚羟基33酶的分子修饰常见基团的化学修饰反应：胍基常见基团的化学修饰反应：胍基常见基团的化学修饰反应：胍基常见基团的化学修饰反应：胍基34酶的分子修饰常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基35酶的分子修饰(4)酶蛋白主链修饰酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰肽链有限水解修饰)o利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。o酶蛋白主链修饰主要是靠酶切酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。酶原激活法。a、胃蛋白酶原的激活、胃蛋白酶原的激活 36酶的分子修饰37酶的分子修饰b、胰蛋白酶原（、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活）的激活 38酶的分子修饰39酶的分子修饰c、胰凝乳蛋白酶原（、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活）的激活 40酶的分子修饰o有限水解意味着水解酶量和时间相对少o同时由于水解部位氨基酸”埋”在蛋白位置差异,氨基酸周围肽段引起的氨基酸pK值和电性变化,使同样氨基酸部位水解程度也可能不同41酶的分子修饰 酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：中的一种：1 1 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2 2 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3 3 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。酶活力提高。42酶的分子修饰o氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。(保护位点多,可修饰位点多;蛋白容易失去活力)o现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术定点突变技术。定点突变（site directed mutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。(5)(5)氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰43酶的分子修饰酶分子的定点突变酶分子的定点突变1、基因序列分析、基因序列分析2、蛋白质结构分析、蛋白质结构分析3、酶活性中心分析、酶活性中心分析4、引物设计进行基因定点突变、引物设计进行基因定点突变5、酶基因克隆表达、酶基因克隆表达6、变异特性分析、变异特性分析44酶的分子修饰(6)(6)酶分子的物理修饰酶分子的物理修饰 o通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。o特点在于不改变酶的组成单位及其基团，(与前五种方法区别)酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。45酶的分子修饰第四节第四节 酶修饰后的性质变化酶修饰后的性质变化o热稳定性热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。：一般来说，热稳定性有较大的提高。半衰期半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。在体内的半衰期。o抗原性抗原性：比较公认的是：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。性上效果比较明显。o各类失活因子的抵抗力各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。o最适最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。近于生理环境，在临床应用上有较大意义。oKm的变化的变化：大多数酶经修饰后，：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些没有明显变化，但有些酶经修饰后，酶经修饰后，Km值变大。值变大。46酶的分子修饰第五节第五节 酶的定向进化酶的定向进化o酶分子的酶分子的合理设计合理设计(rational design)定点突变技术属于合理设计定点突变技术属于合理设计,这个技术需要对酶这个技术需要对酶蛋白结构和功能间对应关系要有了解蛋白结构和功能间对应关系要有了解.通过设计通过设计酶结构而得到一些功能酶结构而得到一些功能.o酶分子的酶分子的定向进化定向进化(directed evolution)包括易错包括易错PCR技术技术,无须对蛋白结构和功能间对无须对蛋白结构和功能间对应关系有了解应关系有了解,先突变大量酶先突变大量酶,再根据具体功能再根据具体功能需要选择合适的酶需要选择合适的酶,再了解酶结构再了解酶结构.两种方法在酶结构和关系间建立联系两种方法在酶结构和关系间建立联系,不段推动对不段推动对酶蛋白结构和功能了解酶蛋白结构和功能了解.两者联合设计新酶可取两者联合设计新酶可取得不错效果得不错效果47酶的分子修饰酶的合理设计酶的合理设计48酶的分子修饰定向进化的原理定向进化的原理o定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变获取你所筛选的突变获取你所筛选的突变获取你所筛选的突变体体体体”。oo定向进化定向进化定向进化定向进化=随机突变随机突变随机突变随机突变+选择选择选择选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的49酶的分子修饰定向进化产生突变库手段-易错PCRo在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合酶不具有3-5校对功能的性质，(或则不含镁离子含锰离子的聚合酶)配合适当条件，向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。o相对于自然条件下聚合酶十万分之一到百万分之一的复制出错几率,可以大量产生突变体。50酶的分子修饰DNADNA改组（改组（改组（改组（DNA shufflingDNA shuffling）又称有性PCR(sexual PCR)，原理。该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。通过DNA改组,不仅可加速积累有益突变，而且可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体。外显子改组（外显子改组（外显子改组（外显子改组（exon shufflingexon shuffling）类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物。在自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外显子的结合，是产生新蛋白质的有效途径之一。与DNA改组不同，外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。定向进化产生突变库手段-DNADNA改组和改组和外显子改组外显子改组51酶的分子修饰DNADNADNADNA改组原理改组原理改组原理改组原理52酶的分子修饰定向进化的选择策略定向进化的选择策略定向进化的选择策略定向进化的选择策略1)、定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方向的选择特定方向的选择特定方向的选择特定方向的突变限定了进化趋势突变限定了进化趋势突变限定了进化趋势突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。2)、通常,筛选方法必须灵敏筛选方法必须灵敏筛选方法必须灵敏筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关至少与目的性质相关至少与目的性质相关至少与目的性质相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。高通量的筛选体系(检测量低,并行化,自动化)-96孔板53酶的分子修饰体外定向进化的意义体外定向进化的意义体外定向进化的意义体外定向进化的意义o理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。o所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。定向选择出所需性质的突变酶。o酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。54酶的分子修饰酶性质突变方法枯草杆菌蛋白酶E有机相活性/稳定性易错PCR-内酰胺酶总活力/底物专一性DNA改组枯草杆菌蛋白酶BPN稳定性 盒式诱变对硝基苯酯酶底物专一性/有机相活性易错PCR/DNA改组 胸腺嘧啶核苷激酶底物专一性盒式诱变-半乳糖苷酶底物专一性DNA改组绿色荧光蛋白荧光DNA改组核酶底物专一性易错PCR/DNA改组天冬氨酸酶活性与稳定性随机/定位诱变药物和疫苗活性/专一性/最佳表达DNA改组酶的体外定向进化应用实例酶的体外定向进化应用实例酶的体外定向进化应用实例酶的体外定向进化应用实例55酶的分子修饰