免疫标记技术及分析应用ppt课件

l第一节第一节 免疫标记技术免疫标记技术l第二节第二节 免疫荧光技术免疫荧光技术l第三节第三节 免疫酶技术免疫酶技术l第四节第四节 放射免疫技术放射免疫技术l第五节第五节 免疫胶体金标记技术免疫胶体金标记技术第七章第七章 免疫标记技术及分析应用免疫标记技术及分析应用第一节免疫标记技术第七章免疫标记技术及分析应用1 用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂、用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂、胶体金胶体金或电子致密物质等作为示踪剂，标记或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。抗体或抗原进行的抗原抗体反应。第一节第一节 免疫标记技术免疫标记技术用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂、胶体金或电2荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定。实验结果直接镜检观察或进行自动化测定。荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定3免疫标记技术分类：分类：免疫酶技术免疫酶技术(ng)、放射免疫技术、放射免疫技术(pg)、免疫、免疫荧光技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术、发光荧光技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术、发光免疫测定。免疫测定。特点：特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位免疫标记技术分类：免疫酶技术(ng)、放射免疫技术(pg)、4反应类型反应类型实验技术实验技术结果判断结果判断标记免疫反应标记免疫反应 荧光免疫技术荧光免疫技术检测荧光现象检测荧光现象放射免疫技术放射免疫技术检测放射性强度检测放射性强度酶免疫技术酶免疫技术检测酶底物显色检测酶底物显色发光免疫技术发光免疫技术检测发光强度检测发光强度金免疫技术金免疫技术检测金颗粒沉淀检测金颗粒沉淀免疫标记技术免疫标记技术反应类型实验技术结果判断标记免疫反应荧光免疫技术检测荧光现象5 用用标记物标记抗体或抗原标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性疫学诊断的敏感性荧光素荧光素荧光素荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄绿异硫氰酸荧光素（黄绿异硫氰酸荧光素（黄绿异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、色荧光）、藻红蛋白、色荧光）、藻红蛋白、色荧光）、藻红蛋白、罗丹明罗丹明罗丹明罗丹明（红色荧光）（红色荧光）（红色荧光）（红色荧光）放射性同位素：放射性同位素：放射性同位素：放射性同位素：125125I I、131131I I酶：酶：辣根过氧化物酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶碱性磷酸酶免疫荧光检测法（免疫荧光检测法（免疫荧光检测法（免疫荧光检测法（IFAIFA）放射免疫检测法（放射免疫检测法（放射免疫检测法（放射免疫检测法（RIARIA）酶免疫检测法（酶免疫检测法（酶免疫检测法（酶免疫检测法（EIAEIA）免疫标记技术免疫标记技术液相（液相（液相（液相（ELISAELISA）、固相（免疫组化技术）、固相（免疫组化技术）、固相（免疫组化技术）、固相（免疫组化技术）用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提6第二节第二节 免疫荧光技术第二节7将抗体或抗原标记以荧光素，然后与相应抗原或抗体结合，形成的免疫复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，借助荧光检测仪测定或定位被检抗原或抗体。当出现荧光时，表明标记抗体存在，当出现荧光时，表明标记抗体存在，相应的抗原也存在。相应的抗原也存在。将抗体或抗原标记以荧光素，然后与相应抗原或抗体8免疫标记技术及分析应用ppt课件9抗体的荧光素标记抗体的荧光素标记v标标记记原原理理：利利用用抗抗体体蛋蛋白白的的自自由由氨氨基基与与FITC的的异异硫硫氰氰基基在在碱碱性性溶溶液液中中形形成成硫硫碳碳酰酰胺胺键键，使使抗抗体体与与FITC结合成荧光抗体。结合成荧光抗体。v标记方法标记方法:搅拌法：搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。透析法：透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，标记比较匀，非特异染色较低。非特异染色较低。FITC 异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素抗体的荧光素标记标记原理：利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的10常常用用的的荧荧光光素素返回常用的荧光素返回11免疫标记技术及分析应用ppt课件12v去除游离荧光素及其降解产物：去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过透析或凝胶过滤滤v去除荧光素未结合和结合过度的抗体：去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子阴离子交换层析法交换层析法v去除交叉反应或非期望抗体：去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或动物肝粉吸收或固相抗原吸收固相抗原吸收荧光抗体的纯化荧光抗体的纯化去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤荧光抗体的纯化13荧光检测仪荧光检测仪 （1）荧光显微镜（2）荧光分光光度计（3）流式细胞仪（4）荧光偏振光分析仪 荧光检测仪（1）荧光显微镜14荧光显微镜荧光显微镜 利用一定波长的激利用一定波长的激发光对样品进行激发，发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观行定性、定位、定量观察检测。察检测。荧光显微镜利用一定波长的激发光对样品进行激15荧光显微镜的种类透射式落射式荧光显微镜的种类透射式16荧光显微镜的构造荧光显微镜的构造吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜激发滤色镜分色镜分色镜分色镜分色镜汞灯汞灯汞灯汞灯荧光显微镜的构造吸收滤色镜激发滤色镜分色镜汞灯17流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪18荧光酶标仪荧光酶标仪荧光酶标仪19（1 1）直接荧光染色法）直接荧光染色法将将荧荧光光素素标标记记在在特特异异性性抗抗体体上上，直直接接检检测抗原。测抗原。l优点：简单、快速、特异性高。优点：简单、快速、特异性高。l缺点：敏感性差。缺点：敏感性差。（1）直接荧光染色法将荧光素标记在特异性抗体上，直接检测20直接法直接法 间接法间接法 直接法间接法21免疫标记技术及分析应用ppt课件22免疫标记技术及分析应用ppt课件23（2 2）间接荧光染色法）间接荧光染色法 将将荧荧光光素素标标记记在在第第二二抗抗体体（抗抗抗抗体体）上上或或标标记记在在SPA上上，检检测测与与抗抗原原结结合合的的特特异性抗体。异性抗体。（2）间接荧光染色法 将荧光素标记在第二抗体（抗抗体）上24直接法直接法 间接法间接法 直接法间接法25免疫标记技术及分析应用ppt课件26（3 3）补体荧光染色法）补体荧光染色法 将将荧荧光光素素标标记记在在补补体体的的抗抗体体上上（抗抗C3抗体），检测抗原抗体复合物。抗体），检测抗原抗体复合物。（3）补体荧光染色法 将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3抗27l优优点点：可可检检测测所所有有的的抗抗原原抗抗体体系系统统，具通用性；敏感性高。具通用性；敏感性高。l缺缺点点：操操作作流流程程长长、干干扰扰因因素素多多、非非特特异异性性荧荧光光多多，补补体体易易失失活活、需需新鲜制备不方便。新鲜制备不方便。优点：可检测所有的抗原抗体系统，具通用性；敏感性高。28免疫标记技术及分析应用ppt课件29免疫标记技术及分析应用ppt课件30Enzyme Immunoassay（EIA）第三节第三节免疫酶技术EnzymeImmunoassay（EIA）第三31就是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。就是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的32l抗原抗体反应酶催化反应抗原抗体反应酶催化反应l肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度计光度计l特异、敏感特异、敏感l可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在抗体的所在部位，或在g、甚至、甚至ng水平水平上对其进行定量。上对其进行定量。抗原抗体反应酶催化反应33 将将酶酶分分子子与与抗抗体体或或抗抗抗抗体体分分子子共共价价结结合合，酶酶标标记记抗抗体体可可与与存存在在于于组组织织细细胞胞或或吸吸附附于于固固相相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴滴加加底底物物溶溶液液后后，底底物物可可在在酶酶作作用用下下催催化化底底物物水水解解、氧氧化化或或还还原原等等反反应应，产产生生有有颜颜色色的的物质。酶降解底物的量与呈现的颜色成正比。物质。酶降解底物的量与呈现的颜色成正比。将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，酶标记抗体34优点：优点：灵敏度高，特异性强；灵敏度高，特异性强；可可定定性性、定定量量检检测测可可溶溶性性抗抗原原和和抗抗体体，适适用用于于普查；普查；试试剂剂来来源源广广，稳稳定定，保保存存时时间间长长，且且无无同同位位素素污染；污染；结结果果可可肉肉眼眼半半定定量量，也也可可用用仪仪器器定定量量检检测测，且且仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展；仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展；操作简便，易于掌握和使用，且重复性好；操作简便，易于掌握和使用，且重复性好；可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。优点：35缺点：缺点：标标记记反反应应较较难难掌掌握握，在在操操作作过过程程中中容容易易引引起起酶酶、抗抗原原或或抗抗体体的失活。的失活。缺点：36一、常用的酶及其底物一、常用的酶及其底物l酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标记酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标记后后不影响酶活性及抗原、抗体反应性不影响酶活性及抗原、抗体反应性；产物易判；产物易判定或测定；酶活性不受样品中其他成分的影响定或测定；酶活性不受样品中其他成分的影响（用于均相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性（用于均相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性出现抑制或激活）；无害；稳定，价廉、易得。出现抑制或激活）；无害；稳定，价廉、易得。常用酶常用酶 底物底物 显色显色辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 邻苯二胺、邻苯二胺、H2O2 橙黄色橙黄色 四甲基联苯胺、四甲基联苯胺、H2O2 蓝色蓝色碱性磷酸酶碱性磷酸酶 对硝基苯磷酸酯对硝基苯磷酸酯 黄色黄色一、常用的酶及其底物酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标37免疫标记技术及分析应用ppt课件38二、二、标记方法标记方法l酶结合物l技术简单、产率高；不影响酶和抗体（抗原）的生物活性；所得酶标记物稳定；较少形成酶与酶、抗体与抗体、抗原与抗原的聚合物。二、标记方法酶结合物39l戊二醛交联法：戊二醛交联法：抗原抗原-戊二醛戊二醛-酶酶l 改良过碘酸钠标记法：改良过碘酸钠标记法：过碘酸钠氧化酶的羟过碘酸钠氧化酶的羟基为醛基，再与抗体蛋白的氨基结合。基为醛基，再与抗体蛋白的氨基结合。HRP-CH2-NH-IgG 戊二醛交联法：抗原-戊二醛-酶40三、酶标记物的纯化及鉴定三、酶标记物的纯化及鉴定1、纯化、纯化游离酶：增加非特异染色游离酶：增加非特异染色游离抗原（抗体）：竞争降低特异性染色游离抗原（抗体）：竞争降低特异性染色葡聚糖凝胶层析法葡聚糖凝胶层析法50%饱和硫酸铵沉淀提纯法饱和硫酸铵沉淀提纯法三、酶标记物的纯化及鉴定1、纯化412、鉴定、鉴定l免疫活性鉴定：免疫电泳免疫活性鉴定：免疫电泳/双扩双扩/ELISAl酶标记率测定：分光光度法酶标记率测定：分光光度法2、鉴定42四、酶标仪（四、酶标仪（酶联免疫检测仪）l比色l测定波长、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量的软件，自动洗板、温育、加样l450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、405nm四、酶标仪（酶联免疫检测仪）比色43返回返回44免疫标记技术及分析应用ppt课件45免疫标记技术及分析应用ppt课件46免疫标记技术及分析应用ppt课件47免疫标记技术放射物标记技术酶标技术免疫荧光技术其他标记技术酶联免疫吸附技术酶联免疫吸附技术酶免疫组化技术双抗体夹心法双抗体夹心法竞争法双抗原夹心法间 接 法双位一点法ELISA免疫标记技术放射物标记技术酶标技术免疫荧光技术其他标记技术酶48ELISAEnzyme-Linked Immunosorbent Assay酶联免疫吸附试验ELISAEnzyme-LinkedIm49ELISA基本实验过程基本实验过程l包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体固相载体表面，使抗原或抗体固相化表面，使抗原或抗体固相化l抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定应而被结合固定l酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色物，使发生酶促反应而显色ELISA基本实验过程包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固50ELISA原理图原理图 固相的抗原或抗体（固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（酶标记的抗原或抗体（标记物）标记物）酶作用的底物（酶作用的底物（显色剂）显色剂）酶标记的抗原或抗体（酶标记的抗原或抗体（标记物）标记物）ELISA原理图YY酶标记的抗原或抗51固相抗原或抗体固相抗原或抗体1.固相载体的性状：固相载体的性状：聚苯乙烯等固相载体2.试剂的配制：所有试剂的配制都用双蒸水试剂的配制：所有试剂的配制都用双蒸水3.包被：包被：(1)包被缓冲液：包被缓冲液：pH 9.6 碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液(2)包被的浓度包被的浓度:10g/ml(3)包被的时间：包被的时间：4过夜或过夜或371-3h(4)包被的量：包被的量：100l固相抗原或抗体1.固相载体的性状：聚苯乙烯等固相载体52酶酶 底底 物物显色反显色反应应 测定波长测定波长 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,2-连胺基连胺基-2(3-乙基乙基-并噻唑啉磺酸并噻唑啉磺酸-6)铵盐铵盐 橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492460449425642碱性磷酸酶碱性磷酸酶 4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+重氮盐重氮盐 黄色黄色红色红色 400500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪甲硫酚嗪+噻唑兰噻唑兰 黄色黄色深蓝色深蓝色 405420-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光荧光黄色黄色 360,450420 酶及其底物酶及其底物酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺四甲53DNM-9602GDNM-9602G酶标分析仪酶标分析仪DNM-9602 DNM-9602 标配酶标分析仪标配酶标分析仪DNM-9602ADNM-9602A酶标分析仪酶标分析仪酶标分析仪测定酶标分析仪测定OD值值DNM-9602G酶标分析仪DNM-9602标配酶标分析仪54l1.直接法直接法l2.间接法间接法l3.夹心法夹心法l4.竞争法竞争法l5.捕获法捕获法ELISA种类种类1.直接法ELISA种类551.1.直接直接 法法1.直接法56direct ELISAfor Agdirect ELISAfor AgdirectELISAforAg57direct ELISAfor Abdirect ELISAfor Ab返回directELISAforAb返回582.间接法间接法+间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。称为间接法。2.间接法+间接法是检测抗体最常用的方法，其原理59免疫标记技术及分析应用ppt课件60免疫标记技术及分析应用ppt课件61包被固相载体包被固相载体:用已知抗原包被用已知抗原包被固相载体固相载体 加待检标本加待检标本:使相应抗体与固相抗原结合使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质洗涤，除去无关的物质 加酶标抗抗体加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体未结合的酶标抗抗体 加底物加底物显色显色 根据颜色反应的程度进行根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定该抗原的定性或定量测定间接法间接法ELISA过程过程包被固相载体:加待检标本:加酶标抗抗体:加底物根据颜色反623.夹心法：夹心法：+双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法3.夹心法：+双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用63免疫标记技术及分析应用ppt课件64获得待分析物的未标定抗体获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的洗涤除去未结合的抗体及杂质抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成加受检标本（抗原）形成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物 洗涤除去其他洗涤除去其他未结合的物质未结合的物质 加酶标抗体生成加酶标抗体生成抗体抗体待测抗原待测抗原酶标记抗体酶标记抗体的复合物的复合物 彻底洗涤彻底洗涤未结合的未结合的 酶标抗体酶标抗体 加底物进行加底物进行酶催化反应酶催化反应 根据颜色反应的根据颜色反应的程度进行该抗原程度进行该抗原的定性或定量测定的定性或定量测定双抗体夹心法双抗体夹心法获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相洗涤除去未结合的加65双抗原夹心法原理双抗原夹心法原理包被体包被体包被体包被体待测抗体待测抗体待测抗体待测抗体包被抗原包被抗原包被抗原包被抗原标记抗原标记抗原标记抗原标记抗原双抗原夹心法原理包被体待测抗体包被抗原标记抗原66双双夹夹心心法法返回双夹心法返回674.竞争法竞争法4.竞争法68免疫标记技术及分析应用ppt课件69竞争法的原理竞争法的原理固相支持物表面固相支持物表面固相支持物表面固相支持物表面待测物待测物待测物待测物包被抗体包被抗体包被抗体包被抗体标记抗原标记抗原标记抗原标记抗原 此法可此法可用于抗原和用于抗原和半抗原的定半抗原的定量测定，也量测定，也可用于测定可用于测定抗体抗体。竞争法的原理固相支持物表面待测物包被抗体标记抗原70用已知特异性用已知特异性抗体包被抗体包被固相载体固相载体 测定管加待测抗原和测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合固相抗体竞争结合 对照管只加一定量酶标抗原对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合与固相抗体直接结合 分别洗涤分别洗涤除去未结合除去未结合的成分的成分 加底物显色加底物显色分别测定两管的吸光度值，分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比，根据对照管与测定管吸光度值之比，计算标本中待测抗原含量计算标本中待测抗原含量用已知特异性测定管加待测抗原和对照管只加一定量酶标抗原分别洗71俘获抗体俘获抗体俘获抗体俘获抗体（二抗）（二抗）（二抗）（二抗）待测抗体待测抗体待测抗体待测抗体标记抗原标记抗原标记抗原标记抗原包被体包被体包被体包被体5.捕获法捕获法血清中针对某些抗原的特异性血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性常和特异性IgG同时存在，同时存在，后者会干扰后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法抗本多用捕获法 俘获抗体待测抗体标记抗原包被体5.捕获法血清中针对某些抗原72包被体包被体包被体包被体待测抗原待测抗原待测抗原待测抗原包被连接物包被连接物包被连接物包被连接物标记抗体标记抗体标记抗体标记抗体俘获抗体俘获抗体俘获抗体俘获抗体特点：所有试剂盒均采用同一包被物和包被工艺特点：所有试剂盒均采用同一包被物和包被工艺特点：所有试剂盒均采用同一包被物和包被工艺特点：所有试剂盒均采用同一包被物和包被工艺包被体待测抗原包被连接物标记抗体俘获抗体特点：所有试剂盒均采73（1）将抗人）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。洗涤。（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。分。（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。结合。洗涤。洗涤。（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。原反应结合。洗涤。（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性性IgM抗体存在，是为阳性反应。抗体存在，是为阳性反应。捕获法操作过程捕获法操作过程（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。74食品中盐酸克伦特罗的测定食品中盐酸克伦特罗的测定 食品中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，食品中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，赭曲霉毒素赭曲霉毒素 ）食品中有害微生物的快速筛检食品中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏（如沙门氏菌菌 ）甲胺磷残留分析甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析呋喃丹残留分析 ELISA在食品安全检测中的应用在食品安全检测中的应用ELISA用于农药残留的检测用于农药残留的检测食品中盐酸克伦特罗的测定甲胺磷残留分析ELISA在食品安75河豚毒素河豚毒素植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素 苯并芘苯并芘主要有除草剂与杀虫剂两大类主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如杀暝松（例如杀暝松（FN FN）、）、甲氟磷酸异已酶（甲氟磷酸异已酶（SOMAN SOMAN）、）、草不绿（草不绿（Alachor Alachor）、）、西维因（西维因（Carbaryl Carbaryl）、）、多菌灵及克菌丹（多菌灵及克菌丹（Captan Captan）等。）等。农药的检测农药的检测：河豚毒素植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素苯并芘主要有除76 ELISA ELISA检测检测 “非典型肺炎非典型肺炎”冠状病毒冠状病毒 ELISA ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白检测抗异质性胞核核糖蛋白A2A2（hnRNPA2hnRNPA2）/类风湿性关节炎类风湿性关节炎（PtAPtA）3333抗体抗体ELISAELISA在疾病诊断中的作用在疾病诊断中的作用 ELISA ELISA法检测幽门螺杆菌抗体法检测幽门螺杆菌抗体ELISA检测“非典型肺炎”冠状病毒ELISA在结缔77ELISA试剂盒试剂盒ELISA试剂盒78（radio immunoassay，RIA）第四节放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）第79利用放射性同位素标记技术检测抗原的技术利用放射性同位素标记技术检测抗原的技术灵敏度高，用于检测激素等血清中微量物质灵敏度高，用于检测激素等血清中微量物质利用放射性同位素标记技术检测抗原的技术80Rosalyn Yalow（美国）（1977年获诺贝尔生理和医学奖）“for the development of radioimmunoassays of peptide hormones”Veterans Administration Hospital Bronx,NY,USA b.19211959年，Yalow和Berson首次应用放射免疫分析法测定胰岛素RosalynYalow（美国）（1977年获诺贝尔生理81l 与此同时，Ekins利用竞争性蛋白结合分析技术测定甲状腺素获得成功 开创了生物活性物质微量测定技术的新时代，是微量分析方法学上的一个突破。与此同时，Ekins利用竞争性蛋白结合分析技术测定甲82放射免疫技术l优点：优点：特异性强，即抗原抗体的特异性反应；灵敏度高，结果精确，检测范围10-910-12g；操作流程简单易行，加样程序简单，测量和 数据处理自动化；样品用量少、一般无需复杂的提纯步骤；应用范围广泛，尤其是测量小分子半抗原。l缺点：缺点：需要昂贵的检测仪器；同位素污染。放射免疫技术优点：83结合相游离相结合相游离相84第五节第五节第五节85胶体金标记技术胶体金标记技术 以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。体反应的一种新型免疫标记技术。胶体金颗粒表面带有较多电荷，用胶体金胶体金颗粒表面带有较多电荷，用胶体金颗粒标记抗体，检测组织或细胞标本中的抗颗粒标记抗体，检测组织或细胞标本中的抗原。原。胶体金标记技术以胶体金作为示踪标记物，应用于抗86 胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸等作用下，聚合成特定血酸、枸橼酸钠和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。的胶体状态，故称为胶体金。利用它在碱性环境中带负电荷的性质，与利用它在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电吸引而形成牢蛋白质分子的正电荷基团藉静电吸引而形成牢固结合，除抗体蛋白外，胶体金还可与其他多固结合，除抗体蛋白外，胶体金还可与其他多种生物大分子结合。种生物大分子结合。胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣87吸附在胶体金表面的抗原或抗体能定向将胶体金颗吸附在胶体金表面的抗原或抗体能定向将胶体金颗粒运载到组织或细胞内、固相载体上的相应抗体、粒运载到组织或细胞内、固相载体上的相应抗体、抗原的位置。由于金颗粒具有高电子密度的特性，抗原的位置。由于金颗粒具有高电子密度的特性，这些标记物在抗原抗体反应处聚集达到一定密度时这些标记物在抗原抗体反应处聚集达到一定密度时（即金颗粒（即金颗粒107个个/mm2），出现肉眼可见的粉红色斑），出现肉眼可见的粉红色斑点。点。吸附在胶体金表面的抗原或抗体能定向将胶体金颗粒运载到组织或细88 胶体金标记技术胶体金标记技术89胶体金纸条的不同种类胶体金纸条的不同种类胶体金纸条的不同种类90层析法技术优势：简单层析法技术优势：简单现场现场快速快速层析法技术优势：简单现场快速91试纸条组成结构试纸条组成结构 控制线（控制线（C线）线）试纸条组成结构控制线（C线）92与常规诊断方法相比：优优 点点缺缺 点点快速：全部检测过程仅需快速：全部检测过程仅需 5-30分钟。分钟。简便：不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，无需专简便：不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，无需专业人员，携带方便，可随时随地进行。业人员，携带方便，可随时随地进行。廉价：单个测试条成本极低廉价：单个测试条成本极低可单份检测：对标本既能成批检测，又可单份检测，可立可单份检测：对标本既能成批检测，又可单份检测，可立刻拿到结果，不必等待。刻拿到结果，不必等待。稳定性好：金标试剂稳定，可长期保存。稳定性好：金标试剂稳定，可长期保存。检测标本种类多：在临床检测中，样品可能有尿、血液、检测标本种类多：在临床检测中，样品可能有尿、血液、血清、唾液或其他体液。在非临床检测中，样本可能是由血清、唾液或其他体液。在非临床检测中，样本可能是由土壤、粉尘、植物或者食品制备的微量溶液。土壤、粉尘、植物或者食品制备的微量溶液。定量问题定量问题灵敏度问题灵敏度问题与常规诊断方法相比：优点缺点快速93应用领域类别类别应用领域应用领域检测的物质检测的物质人人 类类医学医学各各级级医医院院，血血站站，CDC，防防疫疫站站，诊诊断断中中心心；家家庭庭自自检检；商商检检系系统统；边边检检口岸；公安系统口岸；公安系统传染病（乙肝五项传染病（乙肝五项，HIV,SARS等）等）标志物（标志物（AFP、肌钙蛋白、粪便血红蛋白等）、肌钙蛋白、粪便血红蛋白等）女性妊娠（女性妊娠（hCG(早孕早孕)，LH，FSH)毒品（吗啡毒品（吗啡、K粉、摇头丸、冰毒）粉、摇头丸、冰毒）农农 牧牧业业畜畜牧牧兽兽医医站站,商商检检系系统统,边边检检口口岸岸，农农牧牧类类院院系系和和研究所研究所传染病（禽流感传染病（禽流感，兽瘟疫等），兽瘟疫等）病毒（烟草花叶病毒、犬细小病毒等）病毒（烟草花叶病毒、犬细小病毒等）环境环境环保监测部门环保监测部门,研究机构研究机构有害物质超标有害物质超标食食 品品安全安全食食品品安安全全检检测测中中心心，各各监监管部门管部门农农兽兽药药残残留留（磺磺胺胺类类、瘦瘦肉肉精精等等），大大肠肠杆杆菌菌,黄黄曲曲霉素霉素应用领域类别应用领域检测的物质人类医学各级医院，血站，CDC94常用方法：常用方法：胶体金斑点渗滤试验胶体金斑点渗滤试验 胶体金斑点免疫层析试验胶体金斑点免疫层析试验常用方法：胶体金斑点渗滤试验95免疫标记技术及分析应用ppt课件96BDCTABDCTA97免疫层析法检测原理分类介绍免疫层析法检测原理分类介绍（双抗体夹心）（双抗体夹心）（以HCG检测为例）免疫层析法检测原理分类介绍（双抗体夹心）（以HCG检测为例98免疫层析法检测原理分类介绍免疫层析法检测原理分类介绍（竞争反应）（竞争反应）（以吗啡检测为例）Y2 为固相化的吗啡偶联物为固相化的吗啡偶联物免疫层析法检测原理分类介绍（竞争反应）（以吗啡检测为例）Y99相关仪器设备BIODOTXYZ3050点膜喷金机仪器参数仪器参数仪器尺寸为：430mmx410mmX360mm平台大小:450mmX70mm 平台移动速度:0-330mm/sec X、Y、Z轴移动误差:50um 定位精度:10um in 1 axis;25um in 2 axis 喷点方式 BJQ3000:非接触喷点AJQ3000:非接触喷点 划线宽度 BJQ3000:0.50mm/line（喷点0.20mm/drop）AJQ3000:0.5-5mm 最小喷量 BJQ3000:10nl/dropAJQ3000:1ul/cm 划线精密度BJQ3000:1%AJQ3000:2%相关仪器设备BIODOTXYZ3050点膜喷金机仪器参100切条机仪器参数仪器参数:进料宽度：100 mm进料长度：不限,可连续进料切割切割宽度：1 mm,宽度连续可调切割宽度设定位数：0.01 mm切割精度：0.1 mm切割速度：230次/分钟,速度连续可调切条计数：单次工作和总工作分别计数刀片:日本进口,耐磨高碳钢材料抗静电装置：建议选配电源：220VAC重量：20KG尺寸：430(L)330(W)260(H)mm切条机仪器参数:101胶体金结果判读方法：胶体金结果判读方法：1.色卡法色卡法 将反应好的试纸条T线颜色与制作的色卡比较，看颜色属于那一个档次，则在数据记录时候填写该档次标识。最后做灵敏度比较。2.图形扫描法图形扫描法 将反应好的试纸条放在扫描仪器内，选择灰度扫描，获得灰度线条图象。然后打开分析软件，将该灰度图象导入，自动分析出灵敏度，本底情况。3.读条仪法读条仪法 很多厂家都开发了对应的读条仪，大部分都是采用简单的30万象素数码摄像头做一个拍摄，然后用软件分析。胶体金结果判读方法：1.色卡法102