乙肝六项操作及检验结果的解释课件

乙肝六项的操作、注意事项乙肝六项的操作、注意事项及检验结果的解释及检验结果的解释 乙肝六项的操作、注意事项及检验结果的解释1乙肝六项操作乙肝六项操作 (双抗体夹心法）双抗体夹心法）原理原理在微孔条上预包被，被纯化的乙肝表面抗在微孔条上预包被，被纯化的乙肝表面抗体，配以酶标记抗体（）及等其它试剂，体，配以酶标记抗体（）及等其它试剂，采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗原（）。乙肝表面抗原（）。乙肝六项操作 (双抗体夹心法）原理2乙肝六项操作乙肝六项操作 (双抗体夹心法）双抗体夹心法）操作步骤一.准备1.1平衡：将试剂盒各组分别取出，平衡至室温（18-25），1.2配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按25倍稀释后使用。1.3编号：将微孔条固定于支架，按序编号。乙肝六项操作 (双抗体夹心法）操作步骤3乙肝六项操作乙肝六项操作 (双抗体夹心法双抗体夹心法)二操作2.1加样：分别用加样器在对照孔中加入阴、阳性对照血清各75l于相应孔中。2.2温育：置37温育60分钟。2.3 加酶：不用洗涤，分别在每孔中加入酶标记抗体50l，轻轻混匀。2.4 温育：置37温育30分钟，室温平衡5分钟。2.5 洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。2.6显色：每孔加入底物A、B各50l，轻拍混匀，置37暗处30分钟。2.7终止：每孔加终止液50l，混匀。三测定用酶标仪单波长450或双波长450/630测定各孔值（用单波长测定时需设空白对照一孔，30分钟内完成测定，并记录结果）。乙肝六项操作 (双抗体夹心法)4乙肝六项操作乙肝六项操作 (双抗体夹心法双抗体夹心法)结果判断与分析结果判断与分析 临界值（临界值（.）的计算：临界值）的计算：临界值=阴性对照孔阴性对照孔值值N2.1，阴性对照均值大于，阴性对照均值大于0.05时按实际时按实际值计算，小于值计算，小于0.05时以时以0.05计算。计算。结果判定：样品值结果判定：样品值=1者为阳性者为阳性样品值样品值1者为阴性者为阴性乙肝六项操作 (双抗体夹心法)结果判断与分析5乙肝六项操作乙肝六项操作检测（检测（)竞争法竞争法 一一.试剂准备同上试剂准备同上 二操作二操作 加样：分别用加样器在对照孔中加入阴、阳性对照血清各加样：分别用加样器在对照孔中加入阴、阳性对照血清各50l于相应孔中。于相应孔中。加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50l，轻轻混匀。，轻轻混匀。温育：置温育：置37温育温育30分钟，室温平衡分钟，室温平衡5分钟。分钟。洗涤：用洗涤液充分洗涤洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。秒的浸泡时间）。显色：每孔加入底物显色：每孔加入底物A、B各各50l，轻拍混匀，置，轻拍混匀，置37暗处暗处15分钟。分钟。终止：每孔加终止液终止：每孔加终止液50l，混匀。，混匀。三测定三测定用酶标仪单波长用酶标仪单波长450或双波长或双波长450/630测定各孔值测定各孔值（用单波长测定时需设空白对照一孔，（用单波长测定时需设空白对照一孔，30分钟内完成测定，并记录结果）。分钟内完成测定，并记录结果）。乙肝六项操作检测（)竞争法 6乙肝六项操作乙肝六项操作检测（检测（)竞争法竞争法 四四.结果判断与分析结果判断与分析临界值（临界值（.）的计算：）的计算：临界值（阴性对照孔值阳性对照孔值临界值（阴性对照孔值阳性对照孔值P）0.5，结果判定：样品值结果判定：样品值1者为阴性者为阴性注意：加底物显色，显色的强弱与待测标本中的注意：加底物显色，显色的强弱与待测标本中的含量成反比。含量成反比。乙肝六项操作检测（)竞争法 四 7乙肝六项操作乙肝六项操作测定（竞争法）测定（竞争法）原理原理在微孔条上预包被，被纯化乙肝核心抗原在微孔条上预包被，被纯化乙肝核心抗原（），配以酶标记抗体（）及等其它试剂，（），配以酶标记抗体（）及等其它试剂，采用竞争抑制法原理检测人血清（或血浆）采用竞争抑制法原理检测人血清（或血浆）中乙肝核心抗体（）。中乙肝核心抗体（）。乙肝六项操作测定（竞争法）原理8乙肝六项操作乙肝六项操作测定（竞争法）测定（竞争法）试剂准备同上试剂准备同上加样：每测定孔加入加样：每测定孔加入50l样品。对照孔中加入阴、阳性对照血清各样品。对照孔中加入阴、阳性对照血清各50l。作。作为临床诊断依据，必须将原倍血清样品按为临床诊断依据，必须将原倍血清样品按1：30稀释后再检验，稀释液应采用稀释后再检验，稀释液应采用生理盐水；（作为流行病学调查依据，使用原倍血清检验）。生理盐水；（作为流行病学调查依据，使用原倍血清检验）。加酶：每孔加入酶标记抗体加酶：每孔加入酶标记抗体50l，轻拍混匀。，轻拍混匀。育温：置育温：置37温育温育30分钟，室温平衡分钟，室温平衡5分钟。分钟。洗涤：用洗涤液充分洗涤洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。秒的浸泡时间）。显色：每孔加入底物显色：每孔加入底物A、B各各50l，轻拍混匀，置，轻拍混匀，置37暗处暗处30分钟。分钟。终止：每孔加终止液终止：每孔加终止液50l，混匀。，混匀。测定：用酶标仪单波长测定：用酶标仪单波长450或双波长或双波长450/630测定各孔值（用单波长测定时需测定各孔值（用单波长测定时需设空白对照一孔，设空白对照一孔，30分钟内完成测定，并记录结果）。分钟内完成测定，并记录结果）。结果判断与分析结果判断与分析临界值（临界值（.）的计算：）的计算：临界值阴性对照孔值临界值阴性对照孔值N0.5（未稀释临界值阴性对照孔值（未稀释临界值阴性对照孔值N0.3）结果判定：样品值结果判定：样品值1者为阴性者为阴性 注意：加底物显色，显色的强弱与待测标本中的含量成反比。注意：加底物显色，显色的强弱与待测标本中的含量成反比。乙肝六项操作测定（竞争法）试剂准备同上9乙肝六项操作乙肝六项操作(捕获法）捕获法）测定原理测定原理采用兔抗人采用兔抗人 包被固相载体反应板，加入待测包被固相载体反应板，加入待测标本，同时加入，当标本中存在时，该与包标本，同时加入，当标本中存在时，该与包被结合并与酶结合形成复合物，加入底物产被结合并与酶结合形成复合物，加入底物产生显色反应，反之则无显色反应。生显色反应，反之则无显色反应。乙肝六项操作(捕获法）测定原理10乙肝六项操作乙肝六项操作(捕获法）捕获法）操作步骤 1.待测样品用生理盐水作1:1000稀释，每孔加人稀释样品100微升，设阴、阳性对照各2孔，每孔加人阴性对照(或阳性对照)各100微升(或2滴)，并设空白对照1孔，封板，置37 孵育20分钟。2.手工洗板:弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复3次后拍干。洗板机洗板：选择洗涤3次程序洗板后拍干。3.每孔加入30微升(或1滴)，酶结合物50微升(或1滴)(空白对照孔除外)，充分混匀，封板，置37孵育20分钟4.手工洗板:弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干。洗板机洗板:选择洗涤5次程序洗板后拍干。5.每孔加显色剂A液，显色剂B液各50微升(或l滴)充分混匀，封板，置37 孵育10分钟。6.每孔加人终止液50微升(或1滴)，混匀。7.用酶标仪读数，取波长450(建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长630)，先用空白孔校零，然后读取各孔值。记录结果）。乙肝六项操作(捕获法）操作步骤11乙肝六项操作乙肝六项操作(捕获法）捕获法）8.结果判断与分析结果判断与分析8.1 临界值（临界值（.）的计算：临界值阴性对照）的计算：临界值阴性对照孔值孔值N4，阴性对照均值小于，阴性对照均值小于0.05时以时以0.05计算，大于计算，大于0.05时应实际值计算。时应实际值计算。8.2 结果判定：样品值结果判定：样品值=1者为阳性者为阳性 样品值样品值1者为阴性者为阴性9.质量控制：每次均应有阴阳对照，其值质量控制：每次均应有阴阳对照，其值应在要求范围内。应在要求范围内。乙肝六项操作(捕获法）8.结果判断与分析12乙肝六项操作乙肝六项操作(捕获法）捕获法）10.参考值范围：参考值范围：参考值参考值()=阴性对照平均值阴性对照平均值x 4阴性对照值低于阴性对照值低于0.050作作0.050计算，高于计算，高于0.050按实际值按实际值计算。计算。示例示例1：阴性对照孔阴性对照孔1 :0.016.阴性对照孔阴性对照孔2 :0.010.0.05040.200示例示例2：阴性对照孔阴性对照孔 :0.056 阴性对照孔阴性对照孔 :0.060（0.056+0.060）/240.232乙肝六项操作(捕获法）10.参考值范围：13法检测乙肝六项的注意事法检测乙肝六项的注意事项项 及结果分析及结果分析 酶联免疫吸附试验(简称 法)检测乙型肝炎免疫学标志物问世以来，由于测定灵敏高、特异好和操作简便等诸多优点，具有实用性和可操作性，并广泛应用于各类医院实验室，作为检测乙肝血清标志物的首选，但通过对临床乙肝六项检测的观察、存在不同血清物质变化及各种影响因素，直接或间接的影响检验结果的正确表达。综合资料和实践，作如下探讨：法检测乙肝六项的注意事项 及结果分析 酶联免疫吸附141 样本的采集与处理影响样本的采集与处理影响1.1 样本离心处理不全，使得标本严重溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净，残留在孔内的血红蛋白，具有过氧化物酶样的活性，催化底物显色造成假阳性，溶血标本禁用。1 样本的采集与处理影响1.1 151.2 正常血液采集后半个小时至两小时开始凝固，有时工作中为了快速检测，常会在血液未开始凝固时，即强行离心分离血清。特别是在冬天 使得血清中残留部分纤维蛋白原，在 测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白凝块附着在酶标反应孔壁内使得不易洗掉 易造成假阳(阴)性、影响结果。因此血液标本采集后要使其充分凝固后再分离血清，标本离心时，可加大离心转速，延长离心时间 或者要节约时间就用带分离胶的采血管采集标本。1.2 161.3 血清标本应避免细菌污染，细菌的一些内源性酶本身会对相应酶作标记测定方法产生干扰。1.4 标本储存时间不宜过长，应新鲜 4 保存不宜超过7天，以免因标本中的 聚合导致本底加深 甚至假阳性，影响判断结果。1.31.4 172 试剂的影响试剂的影响2.1 试剂盒在运输中时间太长，温度过高会使显色偏淡，灵敏度偏低，要求试剂盒应存放于 2-8 冰箱中，从冷藏环境中取出的试剂盒、全部瓶装试剂以及待测标本所需的微孔反应板，都应预先在室温下平衡后，再开启使用。余者应及时封存于冰箱。不同批号试剂盒中的组份、不能进行交叉使用，包括试剂瓶盖，相互交叉使用，有可能出现显色浅或本底高，花板情况。所以不同试剂瓶盖不能混淆，试剂盒不要使用超过有效期。2 试剂的影响2.1182.2 不同厂家出产的试剂特异性和敏感性不相同。有的厂家酶标板空间 A 值差 15%，标记酶活性及显色液的稳定性较差，使用劣质试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。选择高质量的试剂是保证检验结果准确的关键之一2.2 193 操作技术的影响操作技术的影响3.1 加样吸嘴的洁净和吸液量的准确性直接影响结果，移液器吸量不足，移液抽吸排放太快，吸头内壁挂液太多或内壁不清洁，所以要定期校正移液器，吸头要配套，每次装吸头要吻合紧密，移液不宜过快，排放应完全，尽可能使用同一移液器和装紧吸头移液时用力及抽吸速度均匀一致 加样后要充分混匀，在 100 和 50 的移液不精密度应 在1%范围以内，分别在99-101 和 49.5-50.5 之间。3 操作技术的影响3.1 203.2 温浴影响 96 孔酶标板结构特别，易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温度要求严格，标本要贴好密封膜，防止水蒸气和污物浸入，放置 37 水浴箱时，应让反应孔底部 2/3 浸入水中，才能减少受热不均 避免边缘效应，干浴与水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并控制好水浴时间。3.2213.3 洗涤是 法操作的重要环节，洗涤液的配制要严格按照说明书进行操作，不能用自来水代替蒸馏水配制 因为自来水中的次氯酸钠会影响结果，手洗易交叉污染 尽量使用洗板机洗涤，血清中残留的纤维蛋白或洗涤瓶，未经常清洗而留有的污垢，结晶易使洗板机针孔全堵塞或半堵塞，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致花板而造成假阳性或假阴性，所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅情况，及时纠正调整，洗板机要做好维护保养，不用时应用去离子水清洗几遍。3.3 223.4 显色剂应避光保存 滴加显色剂 A、B 时，顺序不能颠倒，注意不要漏加，显色时间要严格控制，可用计时器来计时，保证准确，肉眼判断结果时，显色浅不易观察，影响结果准确性，必须使用酶标仪检测结果，以保证结果一致性，滴加终止液后随着时间的增加，吸光度值逐渐下降，而且浓度越高其吸光度随时间下降越快，可能会产生假阳性或假阴性结果，建议在终止反应后立即比色。3.4 234 钩状效应钩状效应()影响影响随着 一步法的应用，在日常工作中会发现 阴性而 阳性的现象，其原因就是当标本中的抗原浓度过高时产生的钩状效应()现象，从而出现假阴性造成真阳性的漏检，即随着被测物浓度增高反而显色减弱甚至不显色，往往造成假阴性结果，采用同步稀释测定或用线性范围高的乙肝六项定量法可以减少 效应的发生。4 钩状效应()影响随着 一步法的应用，在日常工作中会发24有学者认为大约 40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果，常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、溶菌酶、总蛋白浓度等，某些自身抗体都会影响结果造成假阳性。5.干扰物质的影响有学者认为大约 40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，256 药物的影响药物的影响 高效价的乙肝免疫球蛋白会与表面抗原形成复合物,影响 的检出,所以一些 阳性患者注射乙肝免疫球蛋白后 检测会呈阴性反应,导致乙肝两对半少见模式的出现。为预防乙肝，部分 阴性人群在接种乙肝疫苗后的 1 2 周内，血清中可检出 成分，形成一过性 阳性，这可能是乙肝疫苗主要成分是，建议接种乙肝疫苗后 1 个月内不应作 检测。总之,没有严格的室内质控,没有规范的操作规程,结果判定用肉眼而不用仪器,操作随意(如试剂自冰箱取出后不复温,温育时不封板,洗板后无扣板过程),试剂、仪器、器材(如微量移液器)质量差等。而对一些操作细节(如温育时间的控制)的忽视都可能导致结果的不同。乙肝六项检测必须排除各种影响因素的干扰，才能为临床提供正确可靠的检测依据。6 药物的影响 高效价的乙肝免疫球蛋白会与表面抗原形成26乙肝表面抗原前S1前S1：1.主要存在于完整乙肝病毒表面 ,2.肝细胞膜上存在有前S1蛋白受体,3.诱导乙肝病毒吸附在肝细胞表面,4.促使病毒进入肝细胞内.乙肝表面抗原前S1前S1：27乙肝核心抗体临床意义乙型肝炎核心抗体是人体感染乙型肝炎病毒后第一个出现乙型肝炎核心抗体是人体感染乙型肝炎病毒后第一个出现的抗体的抗体,是人体感染乙型肝炎病毒血清学标志物之一是人体感染乙型肝炎病毒血清学标志物之一.乙型肝炎核心抗体又可分为乙型肝炎核心抗体（抗）和乙乙型肝炎核心抗体又可分为乙型肝炎核心抗体（抗）和乙型肝炎核心抗体型肝炎核心抗体(抗抗)两种两种,前者随升高而不断增长前者随升高而不断增长.大约在乙大约在乙型肝炎病毒感染后型肝炎病毒感染后1-2个月时个月时,随者升高而不断增长随者升高而不断增长.大约在乙型肝炎病毒感染后大约在乙型肝炎病毒感染后1-2个月时个月时,随之产生的便是乙随之产生的便是乙型肝炎核心抗体型肝炎核心抗体.目前认为目前认为,抗是乙型肝炎病毒新近感染或持续复制的标志抗是乙型肝炎病毒新近感染或持续复制的标志,这种抗体持续阳性提示疾病迁延这种抗体持续阳性提示疾病迁延,而抗的持续存在只能说明以往有过乙型肝炎病毒感染而抗的持续存在只能说明以往有过乙型肝炎病毒感染.因此因此,乙型肝炎核心抗体和平行检测乙型肝炎核心抗体和平行检测,有助于对急性乙型肝有助于对急性乙型肝炎与隐匿型乙型肝炎和乙型肝炎病毒携带者急性发作之间炎与隐匿型乙型肝炎和乙型肝炎病毒携带者急性发作之间的鉴别的鉴别.约有约有20%急性乙型肝炎病人的血清中查不到乙型肝炎表面急性乙型肝炎病人的血清中查不到乙型肝炎表面抗原抗原,而乙型肝炎核心抗体可阳性而乙型肝炎核心抗体可阳性,而且与病情变化相一致而且与病情变化相一致,病情恢复病情恢复,乙型肝炎核心抗体阴转乙型肝炎核心抗体阴转.当病情重新活动时重新当病情重新活动时重新出现异常时出现异常时,乙型肝炎核心抗体亦重新出现阳性乙型肝炎核心抗体亦重新出现阳性,滴度上升滴度上升.所以说所以说,乙型肝炎核心抗体是用来评价乙型肝炎病情的较好指标乙型肝炎核心抗体是用来评价乙型肝炎病情的较好指标乙肝核心抗体临床意义乙型肝炎核心抗体是人体感染乙型肝炎病毒后28常见乙肝六项检验结果的解释常见乙肝六项检验结果的解释29 简要意要意义乙型肝炎表乙型肝炎表面抗面抗原原乙型肝炎表乙型肝炎表面抗面抗体体乙型肝炎乙型肝炎e抗抗原原乙型肝炎乙型肝炎e抗抗体体乙型肝炎核乙型肝炎核心抗心抗体体乙型肝炎核心乙型肝炎核心抗体抗体是乙肝病毒是乙肝病毒标志物，阳性提示乙肝携志物，阳性提示乙肝携带；、；、阳性提示乙肝病毒阳性提示乙肝病毒复制活复制活跃,传染性染性强强,是治是治疗疗效效评价的重要指价的重要指标；、阳性；、阳性提示机体提示机体产生免疫力抵抗病毒，生免疫力抵抗病毒，趋于恢复。于恢复。-没有乙肝病毒感染，不具没有乙肝病毒感染，不具备免疫力免疫力-+-接种疫苗，乙肝恢复，具接种疫苗，乙肝恢复，具备免疫力免疫力+-表面抗原携表面抗原携带；急性乙肝病毒感染潜伏期后期；急性乙肝病毒感染潜伏期后期+-+-+急性乙肝早期，病毒复制，有急性乙肝早期，病毒复制，有传染性染性强强+-+-+急慢性乙肝，病毒复制，有急慢性乙肝，病毒复制，有传染性染性强强+-+-急慢性乙肝，没有急慢性乙肝，没有传染性或染性或传染性弱染性弱+-+-急慢性乙肝，没有急慢性乙肝，没有传染性或染性或传染性弱染性弱+-+急慢性乙肝，病毒复制有急慢性乙肝，病毒复制有传染性，乙型肝炎染性，乙型肝炎E抗原抗原变异异-+-乙肝核心抗乙肝核心抗隐性携性携带，有乙肝既往有感染史，有乙肝既往有感染史-+-急性乙肝恢复期或既往有感染史急性乙肝恢复期或既往有感染史-+-+-乙肝恢复期或既往有乙肝恢复期或既往有轻度乙肝病毒感染史度乙肝病毒感染史+-+-慢乙肝病毒感染携慢乙肝病毒感染携带，没有，没有传染性或染性或传染性弱染性弱+-+急性乙肝急性乙肝趋于恢复，表面抗原携于恢复，表面抗原携带，病毒复制，有，病毒复制，有传染性染性强强-+提示乙肝病毒早期感染，有提示乙肝病毒早期感染，有传染性染性 简要意义乙型肝炎表面抗原乙型肝炎表面抗体乙型肝炎e抗原乙型30乙肝五项常见模式1-过去和现在未感染过。过去和现在未感染过。2-+(1)既往感染未能测出抗；既往感染未能测出抗；(2)恢复期已消，恢复期已消，抗尚未出现；抗尚未出现；(3)无症状携带着。无症状携带着。3-+(1)既往感染过；既往感染过；(2)急性感染恢复期；急性感染恢复期；3)少数标本仍有传染性。少数标本仍有传染性。感染已过；感染已过；抗出现前的窗口期抗出现前的窗口期乙肝五项常见模式1-过去和现在未感31 4-+-(1)注射过乙肝苗有免疫；注射过乙肝苗有免疫；（2)既往感染；既往感染；假阳性。假阳性。5-+-+急性感后康复。急性感后康复。6+-+(1)急性感染；急性感染；(2)慢性携带者；慢性携带者；(3)传染性弱。传染性弱。7-+-+既往感染，仍有免疫力。既往感染，仍有免疫力。感染，恢复期。感染，恢复期。乙肝五项常见模式 4-+-32乙肝五项常见模式8+-+(1)急性感染趋向恢复；急性感染趋向恢复；(2)慢性慢性携带者；携带者；(3)传染性弱。即俗称的传染性弱。即俗称的“小三阳小三阳”。9+-+-+急性或慢性乙型肝炎感染。提示急性或慢性乙型肝炎感染。提示复制，传染强。复制，传染强。即俗称的即俗称的“大三阳大三阳”。乙肝五项常见模式8+-+(1)急性感染趋向恢33谢 谢！34