蛋白质浓度测定(考马斯亮蓝法)ppt课件

蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定（考马斯亮蓝结合法）（考马斯亮蓝结合法）蛋白质浓度测定（考马斯亮蓝结合法）1一、实验目的：一、实验目的：蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝蓝G G250250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝通过本实验学习考马斯亮蓝G G250250法测定蛋白质含量的原理，法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。一、实验目的：蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一2蛋白质浓度测定方法1.凯氏定氮法2.双缩脲法3.Folin-酚法4.紫外光吸收法5.考马斯亮蓝结合法6.BCA法蛋白质浓度测定方法凯氏定氮法3二、实验原理：二、实验原理：考马斯亮蓝考马斯亮蓝G G250250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为蛋白质结合后变为青青色。蛋白质含量色。蛋白质含量在在5 5100g100g范围内，蛋白质一范围内，蛋白质一色素结合物在色素结合物在 595nm595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。法测定。考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为51 00gmL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。二、实验原理：考马斯亮蓝G250是一种染料，在游离状态4（1 1）分析天平、台式天平）分析天平、台式天平（2 2）具塞刻度试管）具塞刻度试管 （3 3）吸管）吸管（4 4）研钵）研钵（5 5）漏斗）漏斗（6 6）离心机、离心管）离心机、离心管（7 7）容量瓶）容量瓶 （8 8）微量取样器）微量取样器（9 9）分光光度计）分光光度计三、主要仪器：三、主要仪器：（1）分析天平、台式天平三、主要仪器：5四、试剂：四、试剂：（1 1）标准蛋白质溶液）标准蛋白质溶液 称取称取10mg10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至定容至100ml100ml，制成，制成 100 g100 gmlml的原液。的原液。（2 2）考马斯亮蓝）考马斯亮蓝G G250250蛋白试剂蛋白试剂 称取称取100mg100mg考马斯亮蓝考马斯亮蓝G G250250，溶于，溶于50ml 9050ml 90乙醇中，加入乙醇中，加入 8585（m mv v）的磷酸）的磷酸 100ml100ml，最，最后用蒸馏水定容到后用蒸馏水定容到 1000ml1000ml。此溶液在常温下可放置一个月。此溶液在常温下可放置一个月。（3 3）样品液）样品液 取牛血清白蛋白（取牛血清白蛋白（100 ug100 ugmlml）溶液稀释质一定）溶液稀释质一定浓度。浓度。或用新鲜绿豆芽制备或用新鲜绿豆芽制备四、试剂：（1）标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白，溶6五、操作：五、操作：1 1标准曲线的制作：标准曲线的制作：取取6 6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。盖上塞子，摇匀。放置盖上塞子，摇匀。放置2min2min后在后在595 nm595 nm波长下比色测定（比色应在波长下比色测定（比色应在 l hl h内完成）。内完成）。以牛血清白蛋白含量（以牛血清白蛋白含量（gg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。操作项目管号1234567标准蛋白质溶液(ml)00.10.20.30.40.60.8蒸馏水(ml)1.00.90.80.70.60.40.2G-250试剂(ml)各4蛋白质含量（g）0102030406080五、操作：1标准曲线的制作：取6支具塞试管，编号后，按下表72 2样品中蛋白质含量的测定样品中蛋白质含量的测定：（1 1）准确称取约）准确称取约200mg200mg新鲜绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入新鲜绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml5ml蒸馏蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心（水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r4000rminmin，10min10min），将上清液倒入），将上清液倒入10ml10ml容量瓶，再向残渣中加入容量瓶，再向残渣中加入2ml2ml蒸馏水，悬浮后再离心蒸馏水，悬浮后再离心10min10min，合并上，合并上清液，定容至刻度。清液，定容至刻度。（2 2）另）另取取2 2支具支具塞试管，准确加入塞试管，准确加入0.5 ml0.5 ml样品提取液，再加入样品提取液，再加入0.5 ml0.5 ml蒸蒸馏水，馏水，4ml4ml考马斯亮蓝考马斯亮蓝G G250250试剂，充分混合，放置试剂，充分混合，放置2min2min后，以标准曲后，以标准曲线线1 1号试管做参比，在号试管做参比，在595 nm595 nm波长下比色，记录吸光度。波长下比色，记录吸光度。2样品中蛋白质含量的测定：（1）准确称取约200mg新鲜绿8根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（含量（gg），按下式计算：），按下式计算：样品蛋白质含量（样品蛋白质含量（ggg g鲜重）鲜重）（查得的蛋白质含量（查得的蛋白质含量（gg）提取液总体积（提取液总体积（mlml）（样品鲜重（样品鲜重（g g）测定时取用提取液的体积（测定时取用提取液的体积（mlml）3 3结果处理结果处理：根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量9六、注意事项：六、注意事项：比色出现蓝色应在比色出现蓝色应在2 min2 minl hl h内完成。内完成。（蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合的反应十分迅速，在2min 左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h 内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。）1 1考马斯亮蓝考马斯亮蓝G G250250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？质定量法？（微量凯氏（Kjeldahl）定氮法、双缩脲法（Biuret法、紫外吸收法、Folin酚试剂法（Lowry法）2 2制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合？合？（将各试管中溶液纵向倒转混合目的是使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测定时，结果会有较大偏差，使标准曲线的制作不标准，后续的测定结果就不可靠。）3 3如何正确使用分光光度计？如何正确使用分光光度计？七、思考题：七、思考题：八、实验报告：八、实验报告：按常规。按常规。六、注意事项：比色出现蓝色应在2 minl h内完成。（蛋10分光光度计的使用与注意事项分光光度计的使用与注意事项1.1.接好电源线。接好电源线。2.2.启动电源开关，启动电源开关，仪器显示“F7230”，预热预热2020分钟分钟（要打开比（要打开比 色皿盒盖）。色皿盒盖）。3.3.（1 1）设置年、月、日、时、分：设置年、月、日、时、分：按按“CLEAR”CLEAR”键，键，仪器显示“YEA”进入年份设置，按数字键，输入对应进入年份设置，按数字键，输入对应的年份（限输两位数，下同），再按的年份（限输两位数，下同），再按“MODE”MODE”输入成功（下同）；输入成功（下同）；显示“MON”表示进入月份设置；显示“DA”表示进入日期设置；显示“HOU”表示进入小时设置；显示“MIN”表示进入分钟设置。最。最终仪器显示当时的时间。终仪器显示当时的时间。3.3.（2 2）不设置年、月、日、时、分：不设置年、月、日、时、分：按按“CLEAR”CLEAR”键，键，仪器显示“YEA”，直接按直接按“0%t”0%t”键，仪器显示键，仪器显示“00-00-00”00”，表示仪器进入计时状态，时间从，表示仪器进入计时状态，时间从8888年年1 1月月1 1日日0 0时时0 0分开始。分开始。4.4.按按“MODE”MODE”键键，仪器显示，仪器显示“T”T”，即可进入测定。，即可进入测定。分光光度计的使用与注意事项1.接好电源线。115.5.调节波长调节波长旋纽使波长移到所需之处。旋纽使波长移到所需之处。6.6.四个比色皿，其中一个放入参比试样四个比色皿，其中一个放入参比试样（装量要合适），（装量要合适），其余三个放入其余三个放入待测试样。将比色皿放入样品池内的比色皿架中，夹子夹紧盖上样品池盖。待测试样。将比色皿放入样品池内的比色皿架中，夹子夹紧盖上样品池盖。7.7.将参比式样推入光路（将参比式样推入光路（注意听注意听咔嚓咔嚓声声），按），按“100%t”100%t”键，至显示键，至显示“T100.0”T100.0”（调（调100100）。8.8.打开样品池盖，按打开样品池盖，按“0%t”0%t”键，仪器显示键，仪器显示“T0.0”T0.0”（调零）。（调零）。9.9.盖上样品池盖，按盖上样品池盖，按“100%t”100%t”键，至显示键，至显示“T100.0”T100.0”（调（调100100）。10.10.然后将待测试样推入光路，显示试样的然后将待测试样推入光路，显示试样的“T”T”值值（测定）（测定）。11.11.如需测定如需测定“A”A”或或“C”C”，则，则“MODE”MODE”键转换即可。键转换即可。12.12.如果要想将待测试样的如果要想将待测试样的数据记录数据记录下来，只要按下来，只要按“PRINT”PRINT”键即可（打键即可（打印）。印）。5.调节波长旋纽使波长移到所需之处。12