细胞凋亡与疾病4课件

细胞凋亡与疾病 Apoptosis and Disease细胞凋亡与疾病 Apoptosis1第一节 概 述第二节 细胞凋亡过程与调控第三节 细胞凋亡的发生机制第四节 细胞凋亡与疾病第五节 细胞凋亡在疾病防治中的意义第六节 细胞凋亡的检测第一节 概 述2 第一节 概 述 一、发展研究史 1972年病理学家Kerr等首先提出细胞凋亡(apoptosis)的概念，引起人们对这一生物学现象的兴趣。尤其是wyllie等1980年揭示了细胞凋亡独特的生物学特征，即180-200bP单体或寡聚核小体DNA片段，电泳谱为典型的“梯形带”(ladder pattern)，使其倍受世人关注。第一节 概 述 一、发展研究史3 近二十年来，特别是90年代初细胞凋亡已成为生物学和生物医学的研究热点，其研究论文在世界各种学术杂志上发表数量呈指数级增长。1994年美国著名科学杂志主编Cubtta和Koshland将细胞凋亡评为当年世界生命科学中仅次于DNA修复酶的第二个研究热点。经过无数研究证明细胞凋亡是一种具有特征形态和生化改变的过程，是一系列基因活动引起的级联反应的结果。有利它性，使周围的细胞生长得更好，或是发育过程或是免疫功能的需要。4 细胞凋亡学说的建立是20世纪生物医学科学发展史上的里程碑。目前已经能够从分子水平了解调控细胞凋亡的分子和其形态变化的一些分子基础。当细胞的聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)、Lamin1、核DNA和拓扑异构酶、-fodrin和-肌动蛋白等分子被降解，使不同类型细胞的凋亡产生相似的形态特征。如Lamin、拓扑异构酶的降解使染色质失去核内的附着，变为浓缩；核酸内切酶的被激活而切断DNA，使核小体之间发生断裂，在电泳下呈现阶梯状特点，-fodrin、-actin被降解，使细胞膜和细胞骨架受到影响；凋亡的细胞形成多个凋亡小体。说明细胞死亡也像细胞的生存一样是受分子调控的，在进化中也是保守的。细胞凋亡学说的建立是20世纪生物医学科学发展5 现在认为，细胞凋亡在有机体的正常发生、组织重建、老化和应答不可恢复的损害中具有重要意义；细胞凋亡的失控，可能成为肿瘤、神经退化性疾病及免疫缺陷等多种疾病的病因。细胞凋亡研究中的重要事件1.l972年 Kerr、Wyllie、Currie首次提出细胞凋亡这一划时代的生物学概念。2.1980年Wyllie发现核酸内切酶激活引起凋亡细胞 DNA特异性梯形带的形成，提醒世人细胞凋亡的重要性，并重新点燃和激起世界范围内对细胞凋亡研究的热潮。现在认为，细胞凋亡在有机体的正常发生、组织重建、老化63.1993年底发现ICE家族在细胞凋亡发生中的作用。4.caspases蛋白酶在细胞凋亡中的作用（1996）5.Bcl-2家族及其作用。6.Fas(Apo-l，CD95)死亡受体家族的发现。7.细胞凋亡信号传导系统的基本框架及组成。8.许多疾病与细胞凋亡的基本关系。（1995）近年来，逐渐认识到细胞凋亡有其特殊的生物学意义，引起了发育生物学、细胞生物学、免疫学、神经生物学、分子生物学、肿瘤学和研究工作者的广泛兴趣，形成了一个新的研究热点。1993年底发现ICE家族在细胞凋亡发生中的作用。7 二、与细胞凋亡有关的基本概念 细胞凋亡在临床疾病的发生与发展中的作用，愈来愈受到人们所关注。近代概念认为：由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程称为细胞凋亡(apoptosis)。生理条件下，细胞死亡是机体对衰老或畸变或其他任何一种不需要的细胞(如炎性细胞、过度增殖的细胞等)的清除方式；但在某些病理生理条件下发生的细胞凋亡，则可能引起器官或组织的损伤，即引起临床疾病。二、与细胞凋亡有关的基本概念8（一）细胞凋亡与程序性细胞死亡 细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序，自己结束生命的过程，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，被其他细胞吞噬.。现在很多情况下，细胞凋亡亦称为程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)。PCD这一概念已为科学家广泛接受。但不同的人对PCD概念的解释有所不同。一般而言，细胞凋亡是一个形态学的概念，是对细胞凋亡时所见到的固定形式的形态学描述，而PCD是功能上的概念。PCD是发生于生长发育过程中的生理性细胞死亡，而细胞凋亡则是PCD的最常见、研究最多的方式。（一）细胞凋亡与程序性细胞死亡9 (二)细胞凋亡与有丝分裂(mitosis)与有丝分裂的细胞增殖活动相比，细胞发生凋亡时，像秋天的树叶或花的自然凋落(falling off)一样，这种生物学现象，借用希腊词“apoptosis”来表示，意思是秋天的树叶或花的自然凋落，译为“细胞凋落”.有丝分裂:细胞的分裂与分化，其与机体的生长发育密切相关。细胞凋亡:由细胞内某些特定基因所决定，具有特殊的生物学意义，是一种细胞的主动死亡过程。二者虽互为对立，正常情况下，在机体内处于动态平衡，以维持机体细胞数量的平衡和自身的稳定(如蝌蚪青蛙尾巴消失现象)。(二)细胞凋亡与有丝分裂(mitosis)10 （三）细胞凋亡与细胞坏死(necrosis)是多细胞生物细胞死亡的两种不同形式，在形态学、生化代谢、分子机制、结局和意义等方面都有本质的区别：细胞凋亡与坏死的比较 坏死 凋亡 1.性质 病理性，非特异性 生理性或病理性，特异性 2.诱导因素 强烈刺激，随机发生 较弱刺激，非随机发生 3.生化特点 被动过程，无新蛋白 主动过程，有新蛋白合成，合成，不耗能 耗能 4.形态变化 细胞结构全面溶解、胞膜及细胞器相对完整 破坏 细胞肿胀 细胞皱缩，核固缩 5.DNA电泳 弥散性降解，电泳呈 DNA片段化(180200bp)，均一DNA片状 电泳呈“梯”状条带 6.炎症反应 溶酶体破裂，溶酶体相对完整，局部炎症反应 局部无炎症反应 7.凋亡小体 无 有 8.基因调控 无 有 （三）细胞凋亡与细胞坏死(necrosis)11细胞凋亡与疾病4课件12 三、细胞凋亡的生理和病理意义 凋亡作为生理过程，有以下三项作用：1.确保正常发育生长 机体的发育、生长过程并不仅仅与细胞的增殖与分化有关，凋亡在器官组织的形成、成熟过程中也发挥了重要作用。它可以清除多余的、失去功能价值的细胞。例如：人胚胎肢芽发育过程中指(趾)间组织，通过细胞凋亡机制而被逐渐消除，形成指(趾)间隙。2.维持内环境稳定 受损、突变或衰老的细胞如果存留体内就可能干扰机体功能，甚至演变为多种疾病(如肿瘤)。维持内环境的稳定，机体必须及时将这些细胞清除，清除的主要方式就是凋亡。三、细胞凋亡的生理和病理意义13 例如机体通过细胞凋亡：清除针对自身抗原的T淋巴细胞，维持免疫稳定。皮肤、粘膜上皮不断更新：新的C增殖和衰老C凋亡子宫内膜的周期性变化：增生激素凋亡、脱落；受损不能修复的细胞、癌前病变细胞的清除。通过细胞凋亡被机体清除的细胞数量是相当可观的，每秒钟可达数百万个。3.发挥积极的防御功能 参与了机体的防御反应，例如当机体受到病毒感染时，受感染的细胞发生凋亡，使DNA发生降解，整合于其中的病毒DNA也随之被破坏，因而阻止了病毒的复制。例如机体通过细胞凋亡：14第二节 细胞凋亡过程与调控 一、细胞凋亡的过程 从细胞受到凋亡诱导因素的作用到细胞凋亡大致可分成四个阶段：1.凋亡信号转导 细胞内外的凋亡诱导因素通过各种受体作用于细胞后，细胞产生一系列复杂的生化反应，形成与细胞凋亡有关的第二信使物质,如Ca2+,cAMP，神经酰胺等，然后通过胞内的信号转导途径激活后续凋亡程序。第二节 细胞凋亡过程与调控 一、细胞凋亡的过程15 2.凋亡基因激活 调控凋亡的基因接收由信号转导途径传来的死亡信号后按预定程序启动，并合成为执行凋亡所需的各种酶类及相关物质。3.细胞凋亡的执行 主要的执行者：核酸内切酶(endogenous nuclease，DNase)：彻底破坏细胞生命活动所必须的全部指令 凋亡蛋白酶（Caspases）：导致细胞结构的全面解体 2.凋亡基因激活16 4.凋亡细胞的清除 已经凋亡的细胞可被邻近的吞噬细胞或其他细胞所吞噬，分解。上述全过程需时约数分钟至数小时不等。从凋亡信号转导到凋亡执行的各个阶段都有负调控因子存在，以形成完整的反馈环路，使凋亡过程受到精确、严密的调控。凋亡诱导因素+受体 cAMPCa2+神经酰胺死亡信号凋亡相关基因激活DNase激活Caspases激活巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞细胞凋亡过程 4.凋亡细胞的清除凋亡诱导因素+受体 17 二、凋亡时细胞的主要变化 1.细胞凋亡的形态学改变 凋亡细胞表面的微绒毛消失，并逐步脱离与周围细胞的接触。可见到:空泡化(blebbing)：胞浆脱水，胞膜迅速发生空泡化。固缩(condensation)：细胞体积逐渐缩小引起。二、凋亡时细胞的主要变化18 出芽(buding)：内质网不断扩张并与胞膜融合，形成膜表面的芽状突起。染色质边集(margination)：晚期核质高度浓缩融合成团，染色质集中分布在核膜的边缘，呈新月形或马蹄形分布。线粒体和溶酶体的形态结构变化不大。凋亡小体(apoptosis body)：胞膜皱缩内陷，分割包裹胞浆，形成泡状小体，这是凋亡细胞特征性的形态学改变。（电镜下见透亮空泡和浓密核碎片）出芽(buding)：内质网不断扩张并与胞19 2.细胞凋亡的生化改变 细胞凋亡过程中DNA的片段化断裂及蛋白质的降解尤为重要。1)DNA的片段化 典型的细胞凋亡以细胞核固缩、染色质DNA的特征性片段化为主要特征。细胞凋亡发生时DNA双链的断裂发生在核小体连接部，是内源性核酸内切酶被激活所致。20 DNA链上每隔200个核苷酸有1个核小体，当内切酶在核小体连接区切开DNA时，即可形成180200bp或其整倍数的片段。这些片段在琼脂糖凝胶电泳中呈特征性的“梯”状(ladder pattern)条带，是判断凋亡发生的客观指标之一。DNA片段化断裂是细胞凋亡的关键性结局。DNA链上每隔200个核苷酸有1个核小体，当21 2)内源性核酸内切酶激活及其作用 执行染色质DNA切割任务的是内源性核酸内切酶。尽管已有多种核酸内切酶存在于细胞核内，但细胞内外的凋亡诱导因素并不能直接激活该酶，它需要经过一系列胞内信号转导环节方能被激活。3).凋亡蛋白酶(caspases)的激活及其作用 caspases是一组对底物天冬氨酸部位有特异水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶(caspase是cysteinecontaining aspartatespecific protease的缩写)。目前已发现该蛋白酶家族至少有13个成员(caspase1-13)。2)内源性核酸内切酶激活及其作用 22 caspase在凋亡中所起的主要作用是：在凋亡中所起的主要作用是：灭活细胞凋亡的抑制物(如Bcl-2)；水解细胞的蛋白质结构，导致细胞解体，形成凋亡小体；在凋亡级联反应(cascade)中水解相关活性蛋白，使该蛋白获得或丧失某种生物学功能（如caspase-9可使caspase-3酶原水解形成具有分解蛋白质活性的caspase-3）。23细胞凋亡与疾病4课件24 三、细胞凋亡的调控 (一)细胞凋亡相关因素 诱导性因素和抑制性因素两大类：1诱导性因素 细胞凋亡是一个程序化的过程，这个程序虽已预设于活细胞之中，正常情况下它并不“随意”启动，只有当细胞受到来自细胞内外的凋亡诱导因素作用的时候，才启动，使细胞一步步走向死亡，因此凋亡诱导因素是凋亡程序的启动者。常见诱导因素有：三、细胞凋亡的调控25 (1)激素和生长因子失衡 例如强烈应激引起的淋巴细胞数量减少，主要由于大量GC分泌，诱导淋巴细胞凋亡所致。(2)理化因素 射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌药物等，均可导致细胞凋亡。例如：电离辐射可产生大量氧自由基，使细胞处于氧化应激状态，DNA受损，引起细胞凋亡。(3)免疫性因素 免疫细胞在生长、分化及执行防御、自稳、监视功能中其免疫分子参与了免疫细胞或靶细胞的凋亡过程，例如：细胞毒T淋巴细胞(CTL)可分泌粒酶 ，引起靶细胞发生凋亡。(1)激素和生长因子失衡26 (4)微生物学因素 细菌、病毒等致病微生物及其毒素可诱导细胞凋亡。如HIV感染时，可致大量CD+4、淋巴细胞凋亡，这时AIDS病人相关免疫功能低下，肿瘤及机会性感染增加(主要原因)。2抑制性因素 (1)一些细胞因子(IL-2，神经生长因子等)有抑制凋亡的作用。当从细胞培养基中去除后，依赖它们的细胞发生凋亡；反之，在培养体系中加入所需要的细胞因子后，由于促进了细胞内存活基因的表达，凋亡受抑制。(4)微生物学因素27 (2)某些激素(ACTH、睾丸酮、雌激素等)对于防止靶细胞凋亡，维持其正常存活是必需的。例如：当腺垂体被摘除或功能低下时，肾上腺皮质细胞失去ACTH刺激，发生细胞凋亡，引起肾上腺皮质萎缩。此时，只要给予生理维持量的ACTH即可抑制肾上腺皮质细胞的凋亡，防止肾上腺皮质的萎缩。(3)其它:某些二价金属阳离子如Zn2+，药物如：苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂，病毒如：EB病毒，牛痘病毒CrmA等及中性氨基酸也具有抑制细胞凋亡的作用。(2)某些激素(ACTH、睾丸酮、雌激素等)28 (二)细胞凋亡信号的转导(transduction)多数情况下来自于细胞外的细胞凋亡诱导因素作用于细胞后可转化为细胞凋亡信号，并通过胞内不同的信号转导途径，激活细胞死亡程序，导致细胞凋亡。因此，凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片段化断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节。这个系统的特点是：多样性：不同种类细胞有不同的信号转导系统。偶联性：即死亡信号的转导系统与细胞增殖、分化过程中的信号转导系统在某些环节上有交叉、偶联；因此同一个信号，在不同条件下既可引起凋亡，也可刺激增殖。(二)细胞凋亡信号的转导(transductio29 同一性：不同的凋亡诱因可以通过同一信号转导系统触发细胞凋亡。例如：TNF-、电离辐射及Fas抗原等多种凋亡诱导因素均可通过神经酰胺信号途径触发细胞凋亡。切断某一信号转导系统、可能影响多种凋亡诱导因素引起的细胞凋亡。多途性：同一凋亡诱导因素可经过多条信号转导途径触发凋亡。例如：糖皮质激素引起淋巴细胞凋亡可通过神经酰胺系统、胞内Ca2+信号系统及cAMP蛋白激酶A(PKA)信号系统转导凋亡信号。这就意味着要完全阻抑某一凋亡诱导因素的作用，就必须同时切断多条相关的信号转导途径。同一性：不同的凋亡诱因可以通过同一信号转30 (三)凋亡相关基因 目前，细胞凋亡相关基因多达数十种，根据功能的不同可将其分为三类：抑制凋亡基因：EIB、IAP、Bcl2等，其中 对Bcl2的研究最为详细而系统促凋亡基因：如：Fas、Bax、ICE、P53等。双向调控基因：例如 c-myc、Bcl-x。(三)凋亡相关基因31 1Bcl-2（抑制凋亡基因）Bcl-2是B细胞淋巴瘤白血病-2(B cell lymphomaleukemia-2，Bcl-2)基因的缩写形式，是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因。人的Bcl-2蛋白由229个氨基酸组成，小鼠为236。目前认为：Bcl-2抗凋亡的主要机制是：直接抗氧化；抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质，如：细 胞色素C，凋亡诱导因子(AIF)；抑制促凋亡调节蛋白Bax、Bak细胞毒作用 抑制caspases的激活；维持细胞钙稳态。1Bcl-2（抑制凋亡基因）32 2Fas（促进凋亡基因）Fas是一种细胞表面受体，是一种跨膜蛋白。伸向胞浆的部分有一段与TNF受体相似，与TNF受体和NGF(神经生长因子)受体高度同源，在多种组织细胞中存在。目前的研究表明，天然表达或转染表达的Fas基因对细胞凋亡有促进作用。启动细胞凋亡的死亡信号途径是通过两种死亡因子，即FasL和TNF与细胞膜表面的相应受体Fas和TNFR结合后所发生的凋亡反应。2Fas（促进凋亡基因）33TNF天然配基GF（生长因子）FasFasL（配体）信号转导ACPKACa2+PKCApoptosisApoptosis细胞膜FasL、TNF 介导的细胞凋亡信号途径腺苷酸环化酶TNF天然GFFasFasL信号ACPKACa2+PKCA34 3P53 （促进凋亡基因）野野生生型型P53基基因因具具有有诱诱导导细细胞胞凋凋亡亡的的功功能能，发发生生突变后反而可抑制细胞凋亡。突变后反而可抑制细胞凋亡。野生型P53基因编码的P53蛋白是一种DNA结合蛋白，该蛋白在细胞周期的G1期发挥检查点(check point)的功能，检查染色体 DNA是否有损伤，一旦发现有缺陷的DNA，它就刺 激 CIP(CdKinteracting protein-1，cdk是cyclin dependent kinase的缩写)的表达，阻止细胞进入细胞周期，启动DNA修复机制。35 如修复失败，P53启动细胞凋亡机制。哪些遗传信息出错，有可能演变为恶性肿瘤的细胞，常常通过这种机制被消灭在萌芽之中。因此，P53有“分子警察”(molecular policeman)的美誉。4c-myc，Bcl-x（双向调控基因）c-myc是一种癌基因，能诱导细胞增殖，也能诱导细胞凋亡，有双向调节作用。c-myc蛋白作为重要的转录调节因子:激活介导细胞增殖的基因.激活介导细胞凋亡的基因.细胞何去何从，取决于细胞接受何种信号以及细胞所处的生长环境。如修复失败，P53启动细胞凋亡机制。哪些遗传36 例如：在c-myc基因表达后，如果没有足够的生长因子持续作用细胞就发生凋亡；反之，细胞处于增殖状态。Bcl-x基因可翻译出两种蛋白:Bcl-XL:抑制细胞凋亡 BclXs:促进细胞凋亡 Bcl-x激活后是否产生细胞凋亡则与这两种蛋白合成以谁为主有关。例如：在c-myc基因表达后，如果没有足够的生37第三节 细胞凋亡的发生机制 机制尚未充分阐明，有以下可能:：一、氧化损伤在细胞凋亡中的作用 氧自由基造成生物大分子(核酸、蛋白质、脂 质)的 氧 化 损 伤(氧 化 应 激,oxidative stress)状态，后果之一是诱导细胞凋亡。第三节 细胞凋亡的发生机制 机制尚未充分阐明38 缺血缺血-再灌注再灌注 细胞内活性氧细胞内活性氧 O2、H2O2、OH、NO 内、外源抗氧化剂内、外源抗氧化剂(-)bcl2基因等基因等 脂质过氧化脂质过氧化 转录因子转录因子 Ca2+DNA内切酶内切酶 死亡基因死亡基因凋凋 亡亡 39 氧化应激引起细胞凋亡的可能机制是:1.氧自由基引起的DNA损伤可激活P53基因 2.氧自由基引起的DNA损伤可活化聚ADP核 糖转移酶，引起NAD快速耗竭，ATP大量 消耗。3.氧自由基攻击细胞膜上不饱和脂肪酸，引 起脂质过氧化直接造成细胞膜的损伤可诱 导细胞凋亡；此外细胞膜上不饱和脂肪酸 (如花生四烯酸)的氧化产物过氧羟基24碳 四烯酸有很强的诱发细胞凋亡的作用。氧化应激引起细胞凋亡的可能机制是:40 4.激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，产生膜 的发泡现象。5.引起细胞膜结构的破坏，可改变细胞膜的通 透性,使Ca2+内流增加，诱导细胞凋亡。自由基对线粒体膜的损害导致其通透性 和膜电位的变化也可诱导细胞凋亡。6.氧化应激可活化核转录因子NF-B和AP-1(活化蛋 白-1)，加速细胞凋亡相关的一些基因的表达，诱 发细胞凋亡。但也有实验证明，在活性氧显著减少的低氧环境下某些类型的细胞凋亡仍可发生，这表明氧化应激不是细胞凋亡的唯一机制。4.激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，产生膜41 二、钙稳态失衡在细胞凋亡中的作用 例如：各种凋亡刺激，如TNF抗CD+3抗体TCDD引起细胞凋亡是钙依赖过程。凋亡发生时胞浆Ca2+浓度显著上升，并在随后发生的一系列改变中起关键性作用。诸多的凋亡变化如：Ca2+Mg2+依赖的核酸内切酶的激活、需钙蛋白酶、磷脂酶、等激活，凋亡细胞膜的空泡化等均与钙稳态失衡有关。二、钙稳态失衡在细胞凋亡中的作用42 钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制：1.激活Ca2+Mg2+依赖的核酸内切酶，降解 DNA链；2.激活谷氨酰胺转移酶，催化细胞内肽链间的 酰基转移，在肽链间形成共价键，使细胞骨 架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小 体形成；3.激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的 转录；4.Ca2+在ATP的配合下使DNA链舒展，暴露出 核小体之间的连接区内的酶切位点，有利 DNA内切酶切割DNA。钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制：43 三、线粒体损伤在细胞凋亡中的作用 细胞凋亡期间线粒体超微结构基本正常，但功能发生显著改变:膜通透性增大，跨膜电位(m)下降，能量合成显著等。目前证据显示：线粒体功能改变在细胞凋亡的发生中起关键性作用。因为：抑制线粒体的TAC或呼吸链功能可引起细胞凋亡 在细胞核出现凋亡改变前，常先有线粒体膜电位 阻止线粒体的通透性改变可防止细胞凋亡，如Bcl-2可阻止细胞凋亡(升高线粒体的跨膜电位和阻止线粒体通透性改变)。三、线粒体损伤在细胞凋亡中的作用44 Ca2+NO缺血缺氧活性氧线粒体m PTP开放Apaf+Cyt.CBcl-2_Caspase-9 酶原Caspase-9+Caspase-3 酶原Caspase-3+A I F+蛋白水解酶细胞凋亡DNA断裂核酸内切酶激活无活性核酸内切酶激活+Caspase抑制剂线粒体线粒体m 与细胞凋亡与细胞凋亡 45细胞凋亡与疾病4课件46 细胞凋亡是机体维持细胞群体数量稳态的重要手段，细胞凋亡失调(凋亡不足或和凋亡过度)可成为某些疾病的重要发病机制。一、细胞凋亡不足 这类疾病无论细胞增殖的状态如何，其共同点是细胞凋亡相对不足，细胞生死相抵后是生大于死，导致细胞群体的稳态被破坏，病变细胞异常增多或病变组织体积增大，器官功能异常。第四节 细胞凋亡与疾病 细胞凋亡是机体维持细胞群体数47 1肿瘤 多年来，人们一直以为细胞增殖和分化的异常是肿瘤发病的主要症结所在，然而随着细胞凋亡的概念的引入，使人们有机会从另一个角度细胞死亡来审视肿瘤的发生。目前认为细胞增殖过度是肿瘤发病的一个途径，凋亡受抑、细胞死亡不足是肿瘤发病的另一途径，结果导致病变组织内肿瘤细胞存活延长，使细胞群体内存活与死亡的平衡被破坏，存活大于死亡，肿瘤细胞数目的净增长增多。研究发现多种肿瘤组织(如前列腺癌、结肠癌等)Bcl-2基因的表达显著高于周围正常组织，提示这些肿瘤与细胞凋亡减弱有关。1肿瘤 48 野生型P53基因是目前最受关注的抑癌基因，它主要通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抑癌作用。当P53基因突变或缺失时，细胞凋亡减弱，机体肿瘤的发生率明显增加。例如：研究发现在非小细胞肺癌P53基因的突变率为50以上，在小细胞肺癌甚至高达80。正如前述，机体通过细胞凋亡清除那些对机体内环境可能构成威胁的细胞.发病学角度来看，细胞凋亡实际上是机体天然的抗癌机制之一。49 2自身免疫病 自身免疫病主要的特征是自身抗原受到自身抗体或致敏T淋巴细胞的攻击，造成器官组织损伤。正常情况，免疫系统在发育过程中已将针对自身抗原的免疫细胞有效清除(其主要方式就是细胞凋亡)。T细胞的发育、分化在胸腺内进行，胸腺具有选择性保留或去除T细胞中不同克隆的功能，即正选择（positive selection）和 负 选 择(negative selection)。通过正选择具有与非己抗原-MHC抗原结合的TcR的单阳性细胞可以存活下来，并进入外周T细胞库。确保通过正选择的T细胞不会针对自身抗原而仅对非己抗原产生免疫反应。2自身免疫病 50 具有与自身抗原-MHC抗原有高度亲和力的TcR的双阳性细胞将接受负选择，即在自身抗原与胸腺上皮细胞膜的MHC分子共同作用下，通过细胞凋亡而被清除，即针对自身抗原的T细胞在胸腺的发育过程中即被清除。如胸腺功能异常，负选择机制失调，针对自身抗原的T细胞，就可存活，并增殖，进而攻击自身组织，产生自身免疫病，如多发性硬化症、胰岛素依赖型糖尿病、慢性甲状腺炎等。从细胞凋亡角度看自身免疫病的发病是由于细胞凋亡不足，未能有效清除自身免疫性T细胞所致。到目前为止，糖皮质激素仍是治疗自身免疫性疾病的有效药物之一，其主要机制就是诱导那些异常存活的自身免疫性T细胞凋亡。具有与自身抗原-MHC抗原有高度亲和力的Tc51 二、细胞凋亡过度 1心血管疾病 近年来，对细胞凋亡在心血管疾病发病中作用的研究已更新了人们对许多心血管疾病的认识。(1)心肌缺血与缺血-再灌注损伤：认为心肌缺血或缺血-再灌注损伤造成的心肌细胞死亡形式是坏死。目前研究表明，该种心肌细胞损伤不但有坏死，也有凋亡。坏死，目前人们尚无办法干预，但凋亡是受一系列程序控制的过程，可能通过干预死亡程序加以挽救。研究细胞凋亡，给心肌缺血或缺血-再灌注损伤的防治开辟了一条新的途径。二、细胞凋亡过度52 心肌缺血与缺血-再灌注损伤 的细胞凋亡有如下特点：缺血早期以细胞凋亡为主，晚期以坏死为主；在梗死灶的中央通常以细胞坏死为主，周边部分以细胞凋亡为主；轻度缺血以细胞凋亡为主，重度通常发生坏死；在一定时间范围内，缺血-再灌注损伤时发生的细胞凋亡比同时间的单纯缺血更严重；急性、严重的心肌缺血(如心肌梗死)以心肌坏死为主，而慢性、轻度的心肌缺血则发生细胞凋亡。心肌缺血与缺血-再灌注损伤53 心肌缺血或缺血-再灌注损伤引起细胞凋亡的机制目前尚不清楚，可能与下列因素有关:体内实验证明，应用SOD可显著减少缺血-再灌注引起的心肌细胞凋亡，提示与氧化应激有关。缺血或缺氧可引起心肌细胞死亡受体Fas显著上调，使心肌细胞有可能通过与FasL(Fas配体)反应而导致细胞凋亡；实验证明，缺氧可增加P53基因的转录，因此心肌缺血所引起的细胞凋亡可能与P53基因的激活有关。心肌缺血或缺血-再灌注损伤引起细胞凋亡的机制目54 (2)心力衰竭：既往人们对其发病机制的研究投放到心肌细胞功能异常上，而对心肌细胞数量的变化及其对心衰的影响则关注不多。近年来有关细胞凋亡与心力衰竭关系的研究已表明，心肌细胞凋亡造成心肌细胞数量减少可能是心力衰竭发生、发展的原因之一。在心力衰竭发生、发展过程中出现的许多病理因素如：氧化应激、压力或容量负荷过重、神经-内分泌失调(细胞凋亡水平升高)、细胞因子(如TNF)、缺血、缺氧等都可诱导心肌细胞凋亡。(2)心力衰竭：55 例如:压力负荷过重引起的心衰动物观察到左心肥大的同时，心肌细胞数量减少(细胞凋亡造成的)。从 心 衰 病 人 心 肌 标 本 证 实，心 肌 凋 亡 指 数(apoptotic index，发生凋亡的细胞核数100个细胞核)高达35.5，而对照水平仅0.2-0.4。这一现象给心衰发病机制赋予了新的内容，即心力衰竭发生时不但有心肌细胞功能的异常，而且还有心肌细胞数量的减少。心力衰竭心脏存在心肌细胞凋亡这一事实，提示阻断诱导心肌细胞凋亡的信号和(或)阻断将这些信号与死亡程序连接起来的通道将有助于阻遏凋亡，防止心肌细胞数量的减少，维持或改善心功能状态。这将是今后一段时间内心力衰竭防治的新途径。例如:压力负荷过重引起的心衰动物观察到左心肥56 2神经元退行性疾病 在神经系统疾病中有一类以特定神经元进行性丧失为其病理特征的疾病，如阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)，帕金森病(Parkinson disease)，多发性硬化症等。其中对AD的研究最为广泛，积累了较多资料。现有研究表明：AD造成神经元丧失的主要机制是细胞凋亡。2神经元退行性疾病 57 近年研究提示，有多种因素可引起神经元凋亡，包括淀粉样蛋白、钙超载、氧化应激及神经生长因子分泌不足等。可能机制是：有关致病因素(如氧自由基)作用于神经元，引起Ca2+内流增加，然后激活与-淀粉样蛋白合成有关的基因，神经元内-淀粉样蛋白含量增加，从而导致神经元凋亡。因此，若能阻抑胞内游离Ca+2的上升或清除氧自由基，有可能阻断细胞凋亡。近年研究提示，有多种因素可引起神经元凋亡，包58 3病毒感染 由人免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的AIDS具有传播速度快，无特效疗法和死亡率高(5年内100)等特点，其关键的发病机制是CD4+淋巴细胞被选择性破坏，细胞数显著减少，相关免疫功能缺陷。研究表明，细胞凋亡在AIDS CD4+淋巴细胞减少中扮演了非常重要的角色。根据目前研究，HIV感染导致CD4+淋巴细胞发生凋亡与下列因素有关：3病毒感染 59(1)糖蛋白120(gP120)：感染HIV的宿主细胞膜上可表达一种名为gp120的糖蛋白，CD4+淋巴细胞的表面存有这种蛋白的受体，当gP120与CD4+受体分子结合后即可触发CD4+淋巴细胞发生凋亡。(2)合胞体形成：受HIV感染的大部分CD4+，淋巴细胞(约80-90)逐步融合形成合胞体或多核巨细胞，合胞体在形成过程中或形成后即可发生凋亡而解体。(3)Fas基因表达上调：HIV感染使CD4+淋巴细胞的Fas基因表达上调，使CD4+淋巴细胞对Fas介导的凋亡敏感性提高。糖蛋白120(gP120)：60(4)T细胞激活：HIV感染可引起CD4+淋巴细胞处于被激活状态。正常情况下被激活的细胞会迅速发生增殖反应，但在HIV感染时被激活的CD4+淋巴细胞不但不发生增殖，反而发生凋亡。这种发生在细胞激活以后的T淋 巴 细 胞 死 亡 又 称 为 激 活 诱 导 的 细 胞 死 亡(activation-induced cell death，AICD)。(5)细胞因子：受HIV感染的巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF)增多，TNF可通过与TNF受体-1(死亡受体)结合而启动死亡程序，也可刺激CD4+淋巴细胞大量产生氧自由基，通过氧化应激而触发细胞凋亡。(4)T细胞激活：61(6)tat蛋白：受HIV感染的细胞可产生tat蛋白，这种蛋白可自由透过细胞膜。tat蛋白进入CD4+淋巴细胞后，可诱导细胞产生氧自由基，增强Fas抗原表达而提高对细胞凋亡的易感性。(7)在HIV慢性感染阶段，受感染的CD4+淋巴细胞可作为效应细胞(effect cell)，未受HIV感染的CD4+淋巴细胞作为其靶细胞而被诱导产生凋亡。这是慢性HIV感染时CD4+淋巴细胞数量减少的主要原因。(6)tat蛋白：62 从上述可知，HIV感染可通过多因素、多途径诱导CD4+T淋巴细胞发生细胞凋亡，导致CD4+T淋巴细胞大量减少。此外，HIV也可诱导其他免疫细胞如B细胞、CD8+淋巴细胞、巨噬细胞发生凋亡。在AIDS发病过程中，细胞凋亡具有一定的保护意义。可使宿主细胞的DNA发生降解，整合于其中的病毒DNA也随之被破坏，因此可终止病毒的复制和表达，从而阻止其进一步向周围扩散。但是细胞凋亡在HIV感染中的有限的保护作用不足以补偿它对整个免疫系统的致命性打击。因此，在积极抗病毒治疗的同时，如何阻止免疫细胞的凋亡是AIDS病人免疫重建的关键所在。从上述可知，HIV感染可通过多因素、多途径诱63 三、细胞凋亡不足与过度并存 人类组织器官通常由不同种类的C构成，例如心脏主要是心肌C和心肌间质C，血管则以内皮C和平滑肌C为主。由于C类型的差异，各种C在致病因素的作用下，有些C可表现为凋亡不足，而另一些C则可表现为凋亡过度，因此在同一疾病或病理过程中两种情况也可同时并存。动脉粥样硬化即属于这种情况，对内皮细胞而言是凋亡过度，对平滑肌C来说则是凋亡不足。64 正常情况下血管平滑肌C也有低水平(约0.06)凋亡存在，在AS过程中血管平滑肌C的凋亡大幅度升高。有人定量地测定冠状动脉粥样硬化病灶内凋亡的平滑肌C可达29。一个有趣的问题是既然血管平滑肌C凋亡在AS过程中比正常有大幅度上升，但为何AS的血管壁仍然会变厚、变硬。研究表明，当血管平滑肌增殖活性升高时，伴随的C凋亡活动也增强，试图维持平滑肌C数的动态平衡。显然，平滑肌C的凋亡是为了抗衡平滑肌增殖活动的增强，是一种防止血管壁增厚的保护性反应。正常情况下血管平滑肌C也有低水平(约0.65 然而，从总体上看AS发病过程中，平滑肌细胞的增殖始终占主导地位。有学者在实验性 PTCA 后再狭窄模型中发现，在内皮损伤后第9天，平滑肌细胞增殖与凋亡均达到峰值，但细胞凋亡数仅为增殖数的75。因此，增殖与凋亡相抵后平滑肌C数的净增值仍然增加；这可以解释上述AS血管为何逐渐增厚的现象。最近有学者提出促进平滑肌细胞凋亡防防止止其其过过度度增殖是抗AS的新思路。然而，从总体上看AS发病过程中，平滑肌细胞的66 第五节 细胞凋亡在疾病防治中的意义 一、合理利用凋亡相关因素 凋亡诱导因素是凋亡的始动环节，人们正尝试将这类因素直接用于治疗一些因细胞凋亡不足而引起的疾病。例如，放射线照射、TNF具有诱导凋亡的作用，可使用外源性TNF来诱导肿瘤细胞凋亡。第五节 细胞凋亡在疾病防治中的意义 一、合理利67 高热或高温是细胞凋亡的诱导因素，在肿瘤局部加热至43C 30分钟，引起大量肿瘤发生凋亡。某些生长因子或激素是细胞生长所必需的，一旦撤除，细胞即可发生凋亡。研究发现神经生长因子是神经元存活的必要条件，一旦缺乏即会引起神经细胞的凋亡，因此已将神经生长因子试用于老年性痴呆，以防止神经细胞的凋亡。前列腺癌细胞的生长需要雄激素，研究证明，撤除雄激素可引起癌细胞凋亡，这个效应在临床上用去势(切除睾丸)治疗前列腺癌已得到证实。因此，用雄激素受体阻断剂或雄激素的拮抗剂可能 会产生更好的治疗前景。高热或高温是细胞凋亡的诱导因素，在肿瘤局部加68 二、干预凋亡信号转导 FasFasL信号系统是重要的凋亡信号转导系统之一，因此可利用阿霉素刺激肿瘤细胞在其细胞膜上表达FasFasL，导致肿瘤细胞间相互作用、交联，引起凋亡。SPP是神经酰胺信号系统的代谢产物，具有转导增殖信号拮抗凋亡的作用。因此，有可能用来治疗AIDS，防止CD4+淋巴细胞的凋亡，也有可能用于治疗老年性痴呆，防止神经元的凋亡。69 三、调节凋亡相关基因 如果能运用分子生物学手段人为地控制凋亡相关基因的表达便有可能控制凋亡过程，无疑将会使许多疾病的防治大为改观.研究发现，当野生型P53基因发生突变后其诱导肿瘤细胞凋亡的效应减弱，有利于肿瘤细胞的增殖。目前，人们正在探讨用各种载体(如：腺病毒，逆转录病毒或脂质体)将野生型P53基因导入P53基因发生突变的肿瘤细胞内，重新恢复“分子警察”的职责，诱导肿瘤细胞凋亡。三、调节凋亡相关基因70 四、控制凋亡相关的酶学机制 在凋亡执行阶段核酸内切酶和caspases在摧毁细胞结构方面起着关键性作用：因此若能抑制它们的活性，细胞凋亡过程必然受阻；反之，则加速。如前所述，核酸内切酶的激活需Ca2+和Mg2+，降低细胞内、外的Ca2+浓度，细胞凋亡过程即受到阻遏或延迟；相反，利用Ca2+载体(A23187)提升细胞内Ca2+水平则加速细胞凋亡的发生。因此，在防治缺血-再灌注损伤中使用钙阻滞剂可在一定程度上减轻细胞凋亡的发生。四、控制凋亡相关的酶学机制 71 五、防止线粒体跨膜电位的下降 维持线粒体跨膜电位m防止细胞凋亡已日益受到关注。目前已发现环胞霉素A(cyclosporin A，免疫抑制剂)具有阻抑m下降的作用。环胞霉素的衍生物(N-methyl-Val-Cyclosporin)有较强的稳定线粒体m的作用，而呈现明显细胞保护作用，但其免疫抑制作用已基本不存在，因此，有良好抗凋亡的应用前景。五、防止线粒体跨膜电位的下降72第六节 细胞凋亡的检测 随着研究技术的提高和对细胞凋亡的认识不断深入，检测方法已从细胞、染色质到分子水平日趋完善和成熟。目前，检测方法很多，按方法学的学科分类可将细胞凋亡的检测方法分为形态学、生物化学、免疫化学和分子生物学测定法。也可分为以下七类检测方法：第六节 细胞凋亡的检测 随着研究技术的提73 细胞凋亡的形态学检测 流式细胞分析 DNA降解分析 凋亡细胞膜改变分析 细胞凋亡相关蛋白分析 细胞凋亡酶学分析 其他细胞凋亡检测法 细胞凋亡的形态学检测74 可根据下列参数指标对细胞凋亡早期进行测定:细胞群体或单个细胞DNA片段化，凋亡细胞DNA可裂解为不同长度的片段；细胞膜不对称性的改变，PS(磷脂酰丝氨酸）从细胞膜内侧转移到细胞膜外侧；凋亡细胞caspases的激活，caspase家族的激活可起动一系列瀑布反应事件从而使细胞凋亡发生；凋亡细胞的线粒体释放细胞色素C和细胞凋亡起始因子(AIF)。从实际需要出发，可将细胞凋亡检测分为分析细胞群体中的凋亡和单个凋亡细胞二大类。(见图)可根据下列参数指标对细胞凋亡早期进行测定:75细胞凋亡与疾病4课件76