细胞相容性评价(医学相关)课件

材料的生物相容性评价材料的生物相容性评价材料科学与工程系材料科学与工程系1优质课件材料的生物相容性评价1优质课件第四节第四节 细胞相容性评价细胞相容性评价2优质课件第四节细胞相容性评价2优质课件2.1 2.1 简介简介细胞和生物材料的相互作用有两种主要的方式：细胞和生物材料的相互作用有两种主要的方式：特特异性和非特异性的相互作用异性和非特异性的相互作用。非特异性非特异性的作用通常的作用通常很难控制很难控制，因为这种相互作用，因为这种相互作用所基于的性质对于多数细胞类型来讲是共同拥有的，所基于的性质对于多数细胞类型来讲是共同拥有的，这些性质包括这些性质包括细胞的表面性质细胞的表面性质，如细胞膜表面的，如细胞膜表面的负负电荷性电荷性，细胞膜表面的亲，细胞膜表面的亲脂性膜蛋白脂性膜蛋白，和能够介导，和能够介导细胞在生物材料表面非特异性粘附的细胞在生物材料表面非特异性粘附的亲脂性细胞外亲脂性细胞外基质蛋白基质蛋白。相反，相反，特异性的特异性的相互作用更加容易控制，这是因为相互作用更加容易控制，这是因为它们的相互作用是基于特定的它们的相互作用是基于特定的化学和生物学结构化学和生物学结构，如能够和细胞表面受体结合的配体。如能够和细胞表面受体结合的配体。“生物仿生化生物仿生化”的和的和“生物活性生物活性”的材料能够控制这些精细的相的材料能够控制这些精细的相互作用。互作用。3优质课件2.1简介细胞和生物材料的相互作用有两种主要的方式：特异性2.2 2.2 细胞相容性的评价方法细胞相容性的评价方法 细胞生物相容性评价是生物材料生物相容性细胞生物相容性评价是生物材料生物相容性评价的一项重要内容，是指应用评价的一项重要内容，是指应用体外细胞培体外细胞培养养的方法，通过检测的方法，通过检测材料或者其浸提液材料或者其浸提液对细对细胞生长情况的影响来评价材料对细胞的毒性。胞生长情况的影响来评价材料对细胞的毒性。细胞毒性试验作为检测生物材料毒性的手段，细胞毒性试验作为检测生物材料毒性的手段，具有简便、敏感性高、节省动物、节约经费、具有简便、敏感性高、节省动物、节约经费、缩短生物材料研究周期等缩短生物材料研究周期等优点优点，目前几乎所，目前几乎所有的生物材料都必须通过相关实验来检测其有的生物材料都必须通过相关实验来检测其是否具有细胞毒性，已被广泛应用于生物相是否具有细胞毒性，已被广泛应用于生物相容性评价。容性评价。4优质课件2.2细胞相容性的评价方法细胞生物相容性评价是生物材料生在在ISO 10993-5 ISO 10993-5 标准中对试验的主要步骤、细胞标准中对试验的主要步骤、细胞株和细胞培养基、阴性和阳性对照都作了株和细胞培养基、阴性和阳性对照都作了原则要原则要求求，并推荐了，并推荐了琼脂覆盖法琼脂覆盖法和和分子扩散法分子扩散法（即滤过（即滤过法）。法）。近年来进一步发展细胞毒性试验，从形态学方法近年来进一步发展细胞毒性试验，从形态学方法检测细胞损伤、细胞损伤测定、细胞生长测定和检测细胞损伤、细胞损伤测定、细胞生长测定和细胞代谢特性测定等角度提出了不少试验方法，细胞代谢特性测定等角度提出了不少试验方法，并从定性评价逐渐向定量测定发展，一些常用的并从定性评价逐渐向定量测定发展，一些常用的细胞毒性实验方法如下：细胞毒性实验方法如下：5优质课件在ISO10993-5标准中对试验的主要步骤、细胞株和细（一）细胞形态学评价一）细胞形态学评价：细胞形态学评价一种发展：细胞形态学评价一种发展最早的定性细胞损伤检测方法，材料导致细胞损伤最早的定性细胞损伤检测方法，材料导致细胞损伤从而发生从而发生形态学形态学的改变，通过显微镜下观察到的改变，通过显微镜下观察到变圆变圆或裂解细胞或裂解细胞所占的百分比来估算细胞毒性级别。目所占的百分比来估算细胞毒性级别。目测该细胞毒性试验方测该细胞毒性试验方无法定量无法定量细胞毒性大小，由于细胞毒性大小，由于该方法可直观地观察到材料细胞毒性的大小，所以该方法可直观地观察到材料细胞毒性的大小，所以目前仍被广泛用于生物材料细胞毒性的评价。目前仍被广泛用于生物材料细胞毒性的评价。6优质课件（一）细胞形态学评价：细胞形态学评价一种发展最早的定性细胞损（二）细胞膜完整性测定（二）细胞膜完整性测定：生物材料对细胞的毒性：生物材料对细胞的毒性作用也反映在作用也反映在细胞膜细胞膜的变化中，细胞膜结构和功能的变化中，细胞膜结构和功能的完整对于将细胞与其周围环境分离起重要作用。的完整对于将细胞与其周围环境分离起重要作用。中性红摄取试验法。中性红摄取试验法。检测原理是检测原理是未受损的未受损的细胞可摄细胞可摄取中性红染料并将其蓄积在溶酶体内，活细胞摄入取中性红染料并将其蓄积在溶酶体内，活细胞摄入中性红的水平与活细胞的数量成正比。中性红的水平与活细胞的数量成正比。乳酸脱氢酶释放法。乳酸脱氢酶释放法。LDHLDH是一种存在于活细胞中稳定是一种存在于活细胞中稳定的胞质酶，其渗出增加提示细胞膜的稳定性遭到破的胞质酶，其渗出增加提示细胞膜的稳定性遭到破坏。通过测定进入介质的坏。通过测定进入介质的LDHLDH释放的渗透性能够检测释放的渗透性能够检测细胞膜的完整性，进而反映细胞活性。细胞膜的完整性，进而反映细胞活性。7优质课件（二）细胞膜完整性测定：生物材料对细胞的毒性作用也反映在细胞（三）（三）细胞代谢活性评价：细胞代谢活性评价：线粒体琥珀酸脱氢酶线粒体琥珀酸脱氢酶作为生物学终点的评价方法应作为生物学终点的评价方法应用最广泛。线粒体病变被认为是表示细胞受损伤最用最广泛。线粒体病变被认为是表示细胞受损伤最灵敏的指征之一，所以可以十分灵敏地反映出材料灵敏的指征之一，所以可以十分灵敏地反映出材料对细胞造成的毒性损害程度。对细胞造成的毒性损害程度。MTTMTT法是一种快速评定细胞毒性和细胞增殖的比色分法是一种快速评定细胞毒性和细胞增殖的比色分析法，常用于细胞代谢和功能的测定。在析法，常用于细胞代谢和功能的测定。在MTTMTT试验法试验法的基础上发展了的基础上发展了XTTXTT试验法。试验法。XTTXTT法实验时间短、步骤简便，目前已广泛用于生物法实验时间短、步骤简便，目前已广泛用于生物材料的相容性评价。由于该法较材料的相容性评价。由于该法较MTTMTT法具有明显的优法具有明显的优点，已被纳入国际标准点，已被纳入国际标准ISO 10993-5:2009 ISO 10993-5:2009 中，但实中，但实验成本较验成本较MTTMTT法高。法高。MTT法、法、XTT法、法、CCK-8法法8优质课件（三）细胞代谢活性评价：8优质课件（四）细胞增殖率评价：观察材料或材料浸（四）细胞增殖率评价：观察材料或材料浸提液与细胞接触后细胞生长速度和增殖率的提液与细胞接触后细胞生长速度和增殖率的改变，主要有克隆形成试验。改变，主要有克隆形成试验。（五）细胞增殖相关蛋白检测（五）细胞增殖相关蛋白检测（六）细胞周期的检测（六）细胞周期的检测9优质课件（四）细胞增殖率评价：观察材料或材料浸提液与细胞接触后细胞生综上所述，评价生物材料的体外细胞生物相容性试验方法较综上所述，评价生物材料的体外细胞生物相容性试验方法较多，亦各有其特点。各试验方法之间虽然存在一定的相关性，多，亦各有其特点。各试验方法之间虽然存在一定的相关性，但是很难达到完全一致性。因此在选择试验方法时，必须根但是很难达到完全一致性。因此在选择试验方法时，必须根据据“最接近应用状况最接近应用状况”的原则，合理地选择样品与细胞的接的原则，合理地选择样品与细胞的接触方式和检测生物学触方式和检测生物学终点终点的评价指标或评价方法。的评价指标或评价方法。综合运用分子水平评价方法，阐明材料对细胞的作用机制，综合运用分子水平评价方法，阐明材料对细胞的作用机制，全面地评价生物材料对细胞的毒性作用，将是生物材料细胞全面地评价生物材料对细胞的毒性作用，将是生物材料细胞生物相容性评价的发展方向。生物相容性评价的发展方向。10优质课件综上所述，评价生物材料的体外细胞生物相容性试验方法较多，亦各2.3 2.3 细胞培养技术细胞培养技术司徒镇强司徒镇强细胞培养细胞培养11优质课件2.3细胞培养技术司徒镇强细胞培养11优质课件1.1.研究的对象是活细胞研究的对象是活细胞能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动等命活动等2.3.1 2.3.1 细胞培养的优点细胞培养的优点2.2.研究条件可以人为控制研究条件可以人为控制选择对象：均一性、重复性（类型选择对象：均一性、重复性（类型/性质性质/阶段）阶段）调节条件：化学、物理、生物等因素条件调节条件：化学、物理、生物等因素条件研究方法：各种研究技术、记录方法研究方法：各种研究技术、记录方法12优质课件1.研究的对象是活细胞2.3.1细胞培养的优点2.研究条3.3.研究的范围比较广泛研究的范围比较广泛学科多：学科多：细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、分子生物学等分子生物学等对象广：对象广：各种动物：低等动物各种动物：低等动物-高等动物高等动物-人类人类一种动物：不同年龄一种动物：不同年龄-不同组织：正常或异不同组织：正常或异 常（肿常（肿瘤瘤4.4.研究的费用相对较经济研究的费用相对较经济可提供大量、同一时期、重复性好的、生物学性状可提供大量、同一时期、重复性好的、生物学性状相似的实验对象相似的实验对象13优质课件3.研究的范围比较广泛4.研究的费用相对较经济可提供大量、人工所模拟的条件与体内实际情况人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全仍不完全相同。当细胞被置相同。当细胞被置于体外培养后，生活在于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境缺乏动态平衡的环境中久了，必然发生中久了，必然发生变化。变化。1.1.与体内主要不同与体内主要不同相对孤立、单一，缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节相对孤立、单一，缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响和细胞相互间的影响 2.2.主要表现主要表现失去原有组织结构和细胞形态失去原有组织结构和细胞形态分化减弱或不明显分化减弱或不明显,细胞趋向单一化细胞趋向单一化2.3.2 2.3.2 细胞培养的缺点细胞培养的缺点14优质课件人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同。当细胞被置于体外提提 示示对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种既能既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能又又具有具有某些改变的特定的细胞群体，而不能将之与某些改变的特定的细胞群体，而不能将之与体内的细胞完全等同。体内的细胞完全等同。15优质课件提示对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种既能保持动物体初代培养初代培养/原代培养（原代培养（primary cultureprimary culture）从从直接取自直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。初代培养物生物体细胞、组织或器官开始的培养。初代培养物一旦进行传代培养后，就成为细胞系。一旦进行传代培养后，就成为细胞系。通常通常1010代以内的培养物用作原代培养。代以内的培养物用作原代培养。传代培养（传代培养（sub-culturesub-culture）不论是否稀释，在体外培养条件下，将细胞从一个培养器不论是否稀释，在体外培养条件下，将细胞从一个培养器皿转移至另一培养器皿。皿转移至另一培养器皿。2.3.3 2.3.3 常用术语常用术语16优质课件初代培养/原代培养（primaryculture）传代培养贴壁培养（贴壁培养（anchorage-dependent cultureanchorage-dependent culture）细胞或培养物细胞或培养物只有贴附于只有贴附于不起化学作用的物体（玻璃或塑料不起化学作用的物体（玻璃或塑料等无活性物体）的表面时才能生长、生存或维持功能。等无活性物体）的表面时才能生长、生存或维持功能。不能表明细胞属于正常或恶性转化不能表明细胞属于正常或恶性转化悬浮培养（悬浮培养（suspension culturesuspension culture）细胞或细胞或细胞聚集体细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖的一种培养方式。悬浮于液体培养基中增殖的一种培养方式。淋巴细胞、血液肿瘤细胞等淋巴细胞、血液肿瘤细胞等。17优质课件贴壁培养（anchorage-dependentcultu细胞株（细胞株（cell straincell strain）通过通过筛选或克隆化筛选或克隆化从原代培养物或细胞系中获得的从原代培养物或细胞系中获得的具有特具有特殊性质或标志的殊性质或标志的细胞。这些特性（有一定的标记染色体、细胞。这些特性（有一定的标记染色体、特殊的抗原性等）在以后的培养中必须特殊的抗原性等）在以后的培养中必须持续存在持续存在。亚株（亚株（substrainsubstrain）由原细胞株进一步分离培养出与原株性状由原细胞株进一步分离培养出与原株性状有一定不同有一定不同的细的细胞群胞群。18优质课件细胞株（cellstrain）18优质课件细胞凋亡（细胞凋亡（apoptosisapoptosis）细胞内细胞内死亡程序的开启死亡程序的开启而导致细胞自杀的过程。而导致细胞自杀的过程。与机体正常发育、形态形成、消除多余细胞等生理过程密切与机体正常发育、形态形成、消除多余细胞等生理过程密切相关。相关。主要主要形态特征形态特征为细胞皱缩、染色质聚集与周边化，以及凋亡为细胞皱缩、染色质聚集与周边化，以及凋亡小体的形成。小体的形成。ATCCATCC（American type culture collectionAmerican type culture collection）美国模式培养物收集中心美国模式培养物收集中心/美国菌种保藏中心。美国菌种保藏中心。除收集细菌、病毒外，还保藏有大量的细胞株（系）。除收集细菌、病毒外，还保藏有大量的细胞株（系）。19优质课件细胞凋亡（apoptosis）ATCC（Americant体外转化（体外转化（in vitro transformationin vitro transformation）细胞在体外培养过程中发生与原代细胞形态、抗原、增殖细胞在体外培养过程中发生与原代细胞形态、抗原、增殖或其它特性的或其它特性的可遗传的变化可遗传的变化，但不具有致瘤性。，但不具有致瘤性。汇合（汇合（confluenceconfluence）在瓶中培养的细胞彼此汇合形成单层。在瓶中培养的细胞彼此汇合形成单层。细胞融合（细胞融合（cell fusioncell fusion）在体外培养条件下，经化学试剂（在体外培养条件下，经化学试剂（PEGPEG）、病毒（灭活仙台）、病毒（灭活仙台病毒）或物理方法（电脉冲）诱发，使不同种的体细胞融病毒）或物理方法（电脉冲）诱发，使不同种的体细胞融合产生合产生杂交细胞杂交细胞。20优质课件体外转化（invitrotransformation）汇细胞周期（细胞周期（cell cyclecell cycle）细胞从前细胞从前一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历的时相的时相过程。过程。DNADNA合成期（合成期（S S期）、有丝分裂期（期）、有丝分裂期（M M期）、有丝分裂完期）、有丝分裂完成至成至DNADNA合成开始的间隙期（合成开始的间隙期（G1G1期）、期）、DNADNA复制结束至有丝分复制结束至有丝分裂开始的间隙期（裂开始的间隙期（G2G2期）。期）。群体倍增时间（群体倍增时间（population doubling timepopulation doubling time）在对数生长期进行计算的在对数生长期进行计算的细胞增加一倍所需细胞增加一倍所需的时间。的时间。细胞代时（细胞代时（cell generation timecell generation time）单个细胞单个细胞两次连续分裂两次连续分裂的时间间隔。的时间间隔。21优质课件细胞周期（cellcycle）群体倍增时间（populat群体密度（群体密度（population densitypopulation density）培养器皿内，每培养器皿内，每单位面积或体积单位面积或体积中的细胞数，多用细胞数中的细胞数，多用细胞数/cm/cm2 2表示。表示。接触抑制（接触抑制（contact inhibitioncontact inhibition）当一个贴壁生长的体外正常细胞生长至与另一个细胞表面相互当一个贴壁生长的体外正常细胞生长至与另一个细胞表面相互接触时，便停止了分裂增殖，虽然相互紧密接触，但不形成交叉接触时，便停止了分裂增殖，虽然相互紧密接触，但不形成交叉重叠生长，也不再进入重叠生长，也不再进入S S期。期。饱和密度（饱和密度（saturation densitysaturation density）在特定条件下，培养皿内能达到的最高细胞数，当细胞达到饱在特定条件下，培养皿内能达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞群体停止繁殖，贴壁培养：细胞数和密度后细胞群体停止繁殖，贴壁培养：细胞数/cm/cm2 2；悬浮培养：；悬浮培养：细胞数细胞数/cm/cm3 3。22优质课件群体密度（populationdensity）接触抑制（c2.3.4 2.3.4 常用设备和培养基常用设备和培养基1.1.实验用品实验用品超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸COCO2 2培养箱培养箱倒置显微镜倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器酶标仪、微孔板震荡器液氮罐液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管冻存管23优质课件2.3.4常用设备和培养基1.实验用品23优质课件u压力蒸汽消毒器：压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广湿热消毒，用途广u电热干燥箱：电热干燥箱：干热消毒（干热消毒（160 160 ，2 2小时）。主要用干玻璃器小时）。主要用干玻璃器皿消毒皿消毒 u滤器：滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌酶液等均采用滤过法除菌 u超净工作台：超净工作台：为细胞操作提供无菌环境为细胞操作提供无菌环境u紫外灯紫外灯 ：紫外线消毒。：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒培养皿和培养板等表面消毒24优质课件压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广24优质课件超净台超净台超净工作台的工作原理是超净工作台的工作原理是利用利用鼓风机驱动空气遁过高鼓风机驱动空气遁过高效滤器效滤器除去空气中的尘埃颗除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。工作台内构成无菌环境。25优质课件超净台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除灭菌器灭菌器压力（磅）压力（磅）温度（度）温度（度）5 5108.4108.41010115.2115.21515121.0121.02020126.0126.02525130.4130.43030134.5134.526优质课件灭菌器压力（磅）温度（度）5108.410115.21512滤器滤器27优质课件滤器27优质课件COCO2 2培养箱培养箱COCO2 2培养箱设定的条件为培养箱设定的条件为37 37 ，5 5COCO2 2 。使用使用COCO2 2培养箱培养细胞时应注意的问题：培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒保持培养箱内空气干净。定期消毒(90 (90 ，14 h)14 h)。箱内火菌蒸馏水箱内火菌蒸馏水30003000毫升蒸馏水槽中以保毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。持箱内湿度，避兔培养液蒸发。28优质课件CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37，5CO2显微镜显微镜29优质课件显微镜29优质课件自动双重纯水蒸馏器自动双重纯水蒸馏器纯水仪纯水仪30优质课件自动双重纯水蒸馏器纯水仪30优质课件微孔板震荡器微孔板震荡器酶标仪酶标仪31优质课件微孔板震荡器酶标仪31优质课件培培 养养 板板32优质课件培养板32优质课件培养瓶，培养皿培养瓶，培养皿33优质课件培养瓶，培养皿33优质课件移液管，移液枪移液管，移液枪34优质课件移液管，移液枪34优质课件常用玻璃器皿清洗常用玻璃器皿清洗浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干35优质课件常用玻璃器皿清洗35优质课件塑料制品的清洗塑料制品的清洗塑料自制品现多是采用塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理无毒并已经特殊处理的成品，的成品，打开包装即可用，多为一次性物品。必要时用：打开包装即可用，多为一次性物品。必要时用：2%NaOH2%NaOH浸泡过夜浸泡过夜 自来水充分冲洗自来水充分冲洗 ，洗洁精洗刷，洗洁精洗刷 5%5%盐酸溶液浸泡盐酸溶液浸泡3030分钟分钟 自来水和蒸馏水冲洗（自来水和蒸馏水冲洗（15152020遍）遍）晾干备用晾干备用 ,紫外线直接照射或辐照灭菌紫外线直接照射或辐照灭菌36优质课件塑料制品的清洗塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的成品，橡胶制品的清洗橡胶制品的清洗每次用后立即置入水中浸泡每次用后立即置入水中浸泡 冲洗冲洗2%NaOH2%NaOH或洗衣粉煮沸或洗衣粉煮沸10-2010-20分钟以除掉培养中的分钟以除掉培养中的蛋白质蛋白质自来水冲洗自来水冲洗1%1%稀盐酸浸泡稀盐酸浸泡3030分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-2010-20分钟分钟晾干备用晾干备用注意：橡胶器材需用铝铂包装，放在铝盒内高压蒸汽灭菌注意：橡胶器材需用铝铂包装，放在铝盒内高压蒸汽灭菌37优质课件橡胶制品的清洗每次用后立即置入水中浸泡冲洗2%NaOH或金属制品的清洗金属制品的清洗 洗涤剂刷洗洗涤剂刷洗 流水冲洗流水冲洗 去离子水浸泡去离子水浸泡2424小时小时 三蒸水浸泡三蒸水浸泡2424小时小时 干燥备用干燥备用38优质课件金属制品的清洗洗涤剂刷洗38清洁液的配制清洁液的配制39优质课件清洁液的配制39优质课件2 2 细胞培养用液的配制细胞培养用液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液平衡盐溶液：无：无CaCa2+2+、MgMg2+2+的缓冲液的缓冲液 PBSPBS：NaCl 8.0 gNaCl 8.0 g KCl 0.2 g KCl 0.2 g Na Na2 2HPOHPO4 4.H.H2 2O 1.56 gO 1.56 g KH KH2 2POPO4 4 0.20 g 0.20 g 加水至加水至1000 ml1000 ml40优质课件2细胞培养用液的配制40优质课件消化液：消化液：胰胰蛋蛋白白酶酶作作用用于于与与赖赖氨氨酸酸或或精精氨氨酸酸相相连连接接的的肽肽键键，除除去去细细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰胰蛋蛋白白酶酶液液浓浓度度越越高高，作作用用越越强强，但但超超过过一一定定限限度度会会损损伤伤细胞。细胞。胰胰蛋蛋白白酶酶是是一一种种黄黄白白色色粉粉末末，用用无无Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+的的PBSPBS缓缓冲冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.250.25。用。用滤器滤器过滤除菌。过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：胰蛋白酶液消化时间：2-102-10分钟。分钟。用用含血清含血清培养液终止其对细胞的消化作用培养液终止其对细胞的消化作用41优质课件消化液：41优质课件培养基培养基培养基（培养液）是培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然，分天然培养基和合成培养基。培养基和合成培养基。天然培养基天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染易发生支原体污染 42优质课件培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然合成培养基合成培养基合成培养基是根据细胞生存合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量所需物质的种类和数量，用人工方法模拟，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199TC199、MEMMEM、RPMI-1640RPMI-1640、DMEMDMEM等。等。合成培养基主要成分是合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它和其它一些辅助物质。一些辅助物质。优点优点：标准化生产，组分和含量相对固定。本低：标准化生产，组分和含量相对固定。本低 缺点缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（充一定量的天然培养基（如血清如血清）。）。43优质课件合成培养基合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人血清中含有血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种金属离子；多种金属离子；激素；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。各种生长因子各种生长因子转移蛋白转移蛋白不明成分不明成分44优质课件血清中含有：44优质课件一般说来含一般说来含5 5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加细胞不死但支持细胞生长一般需加 1010血清血清对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的中的复杂成分复杂成分至今尚未完全清楚至今尚未完全清楚血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制细胞生长抑制因子或毒性因子因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用需要用无血清培养基无血清培养基培养细胞培养细胞45优质课件一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死u无血清培养基的无血清培养基的主要研制策略主要研制策略：在：在基础培养基中基础培养基中补充各种补充各种必需因子，如激素、生长因子必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白、结合蛋白 、贴壁和扩展、贴壁和扩展因子等。因子等。u无血清培养基由无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分基础培养基和替代血清的补充成分组成。组成。u19751975年年，SatoSato首首次次成成功功地地用用无无血血清清培培养养基基培培养养了了垂垂体体细细胞胞株株，近近2020多多年年来来已已报报道道了了几几十十种种细细胞胞系系在在无无血血清清培培养养基基中中成功地生长和增殖。成功地生长和增殖。u无无血血清清细细胞胞培培养养基基的的使使用用保保证证了了实实验验结结果果的的准准确确性性、可可重重复复性性和和稳稳定定性性，减减少少了了细细胞胞污污染染，简简化化了了提提纯纯和和鉴鉴定定各各种种细胞产物的程序。细胞产物的程序。46优质课件无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，向向无无清清培培养养液液中中能能促促进进细细胞胞系系生生长长的的补补加加物物都都是是独独特特的的。适适用用于于某某种种细细胞胞株株的的培培养养液液，很很可可能能不不适适合合另另一一种种细细胞胞株株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清。47优质课件向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种u血清质量血清质量好坏是实验成败的关键。好坏是实验成败的关键。u常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以马血清等，其中以胎牛血清胎牛血清质量最好。质量最好。u优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。原体、病毒污染。u血清的灭活（消除补体活性）：血清的灭活（消除补体活性）：56 56，30 30 分钟分钟u血清的消毒：过滤除菌血清的消毒：过滤除菌48优质课件血清质量好坏是实验成败的关键。48优质课件抗生素的使用抗生素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗生素，以抑制可能存在在培养液配制后，培养液内常加适量抗生素，以抑制可能存在的细菌的生长。的细菌的生长。通常是通常是青霉素和链霉素青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升终使用浓度为每毫升100100单位。单位。庆大霉素：每毫升庆大霉素：每毫升100100单位单位方便、广谱、稳定方便、广谱、稳定49优质课件抗生素的使用：49优质课件2.3.5 2.3.5 无菌操作无菌操作1.1.培养室和超净台的消毒培养室和超净台的消毒消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。消毒效果。些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。2 2.洗手和着装洗手和着装进入无菌培养室原则上需彻底洗手并按外科手术要求着装；进入无菌培养室原则上需彻底洗手并按外科手术要求着装；无菌服、帽子和口罩每次实验后，均需清洗、消毒；无菌服、帽子和口罩每次实验后，均需清洗、消毒；操作前要用操作前要用7575酒精或酒精或0.20.2新洁尔灭消毒手和前臂。新洁尔灭消毒手和前臂。50优质课件2.3.5无菌操作1.培养室和超净台的消毒50优质课件 3.无菌培养操作无菌培养操作火焰消毒火焰消毒 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都在火灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都在火焰近处并经过烧灼进行。焰近处并经过烧灼进行。操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。灼消毒或取备品更换。51优质课件3.无菌培养操作51优质课件无菌培养操作无菌培养操作工作台面上的用品要放置有序、布局合理，一工作台面上的用品要放置有序、布局合理，一般酒精灯位于中间，右手使用的在右侧，左手使般酒精灯位于中间，右手使用的在右侧，左手使用的在左侧。用的在左侧。移液管、尖吸管不应交叉使用，防止交叉污染。移液管、尖吸管不应交叉使用，防止交叉污染。52优质课件无菌培养操作52优质课件2.3.6 2.3.6 培养细胞的污染培养细胞的污染不仅指微生物，而且包括所有混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物。包括微生物、细胞和化学物质。53优质课件2.3.6培养细胞的污染不仅指微生物，而且包括所有混入培养微生物污染的检测微生物污染的检测微生物污染的种类可微生物污染的种类可分成细菌、真菌、病毒和支原体分成细菌、真菌、病毒和支原体。无菌操作技术不当、无菌操作技术不当、操作室环境不佳操作室环境不佳 、污染之血清、污染之血清和污染之细胞等是主要的污染源和污染之细胞等是主要的污染源 。严格之无菌操作技术严格之无菌操作技术 、清洁的环境、清洁的环境 、与品质良好之、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。54优质课件微生物污染的检测微生物污染的种类可分成细菌、真菌、病毒和支原细菌和真菌的污染和检测细菌和真菌的污染和检测肉眼直接观察法肉眼直接观察法培养检查法培养检查法显微镜观察法显微镜观察法55优质课件细菌和真菌的污染和检测55优质课件真菌污染真菌污染培养液中形成白色或浅黄色培养液中形成白色或浅黄色漂浮物漂浮物肉眼可见，短期内培养液不混浊肉眼可见，短期内培养液不混浊镜下可见在细胞之间有综合交错穿行的镜下可见在细胞之间有综合交错穿行的丝状、管状及树枝丝状、管状及树枝状菌丝状菌丝，并悬浮漂荡在培养液中，也可通过染色加以判断。，并悬浮漂荡在培养液中，也可通过染色加以判断。细胞被霉菌污染的镜检图细胞被白色念球菌污染的镜检图56优质课件真菌污染培养液中形成白色或浅黄色漂浮物细胞被霉菌污染的镜检图57优质课件57优质课件细胞被真菌污染的镜检图细胞污染的电镜照片58优质课件细胞被真菌污染的镜检图细胞污染的电镜照片58优质课件细菌污染细菌污染多为多为大肠杆菌、白色葡萄球菌、假单胞菌大肠杆菌、白色葡萄球菌、假单胞菌等污染等污染污染后，培养基颜色短期变黄，出现污染后，培养基颜色短期变黄，出现浑浊浑浊镜下可见大量圆球状颗粒漂浮物，细胞生长停止并有中镜下可见大量圆球状颗粒漂浮物，细胞生长停止并有中毒表现毒表现可通过革兰染色和肉汤接种加以鉴定可通过革兰染色和肉汤接种加以鉴定多发生在接种的多发生在接种的48h48h以内以内59优质课件细菌污染多为大肠杆菌、白色葡萄球菌、假单胞菌等污染59优质课支原体的污染和检测支原体的污染和检测支原体高污染率的原因：支原体高污染率的原因：支原体最小直径支原体最小直径0.20.2 m m，无细胞壁，约有，无细胞壁，约有1%1%可透过滤菌器可透过滤菌器(0.22-(0.22-0.45 0.45 m)m)；支原体污染时，支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化征变化 ；过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式，研究人员忽略污染问题。过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式，研究人员忽略污染问题。支原体的检测支原体的检测荧光染色法荧光染色法电镜检查电镜检查DNADNA分子杂交检查或支原体培养分子杂交检查或支原体培养60优质课件支原体的污染和检测支原体高污染率的原因：60优质课件2.3.7 2.3.7 细胞培养技术细胞培养技术1.1.细胞的原代培养细胞的原代培养是将机体内的是将机体内的某组织某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长繁殖的方法。借助这种方法可以培养使其生存并不断生长繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、细胞的衰老、死观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、细胞的衰老、死亡等生命现象。亡等生命现象。幼稚状态的幼稚状态的组织和细胞，如动物的胚胎、幼仔的脏器等更组织和细胞，如动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养容易进行原代培养61优质课件2.3.7细胞培养技术1.细胞的原代培养是将机体内的某组意义意义原代培养的原代培养的最大优点最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有很大变化，具有二倍体二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出的遗传性，而且大多数细胞表现出原来组织的原来组织的特性。特性。利用原代培养做各种实验（药物测试、细胞分化及病毒学利用原代培养做各种实验（药物测试、细胞分化及病毒学方面）效果很好。方面）效果很好。原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过的阶段。原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过的阶段。62优质课件意义原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变实验材料实验材料实验动物实验动物：孕鼠或新生小鼠：孕鼠或新生小鼠 液体：液体：细胞生长液（内含细胞生长液（内含20%20%小牛血清）小牛血清）0.25%0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶 平衡盐溶液平衡盐溶液 70%70%乙醇乙醇器材：器材：灭菌镊子、剪刀、灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、灭菌镊子、剪刀、灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯、吸管、酒精灯烧杯、吸管、酒精灯63优质课件实验材料实验动物：孕鼠或新生小鼠63优质课件原代细胞培养方法原代细胞培养方法胰酶消化法胰酶消化法组织块直接培养法组织块直接培养法冷消化冷消化温消化温消化一次性消化一次性消化分次消化分次消化 消化法：消化法：采用无菌操作的方法，把组织（或器官）采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经从动物体内取出，经酶消化酶消化处理，使分散成单个细胞，处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。64优质课件原代细胞培养方法胰酶消化法冷消化温消化一次性消化分次消化贴块法贴块法消化法消化法原代培养方法分类原代培养方法分类65优质课件贴块法消化法原代培养方法分类65优质课件分次消化分次消化 消化法的分类消化法的分类66优质课件分次消化消化法的分类66优质课件组织块培养步骤图解组织块培养步骤图解67优质课件组织块培养步骤图解67优质课件操作步骤操作步骤1 1-取材取材用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有把整个孕鼠浸入盛有7575乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。携入超净台。用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。后腿。用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。养皿上。剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。含有平衡盐溶液的培养皿中。漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。为止。68优质课件操作步骤1-取材用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。68优质操作步骤操作步骤 2-2-切割切割将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用用平衡盐溶液平衡盐溶液漂洗漂洗。然然后后用用眼眼科科手手术术剪剪刀刀小小心心地地绞绞碎碎胚胚胎胎，直直到到成成1 1 mmmm3 3左左右的小块，再用右的小块，再用平衡盐溶液平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。清洗，洗到组织块发白为止。静置，使组织块自然沉淀到管底，弃上清。静置，使组织块自然沉淀到管底，弃上清。69优质课件操作步骤2-切割将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡70优质课件70优质课件胰酶消化法操作步骤胰酶消化法操作步骤 -消化、接种培养消化、接种培养视组织块量加入视组织块量加入5-65-6倍倍的的0.25%0.25%胰酶液胰酶液，3737中消化中消化20-40 min20-40 min，每隔每隔5 min5 min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。加入加入3-5 ml3-5 ml细胞生长液细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。静置静置5-10 min5-10 min，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。1000 rpm1000 rpm，离心，离心5-10 min5-10 min，弃上清液。，弃上清液。加入加入平衡盐溶液平衡盐溶液5 ml5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。加入加入细胞生长液细胞生长液l-2 mll-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。（视细胞量），血球计数板计数。将细胞调整到将细胞调整到5105105 5/ml/ml左右，转移至左右，转移至25 ml25 ml细胞培养瓶中，细胞培养瓶中，37 37 下培养。下培养。71优质课件胰酶消化法操作步骤-消化、接种培养视组织块量加入5-胰酶消化法操作步骤胰酶消化法操作步骤 -消化、接种培养消化、接种培养也可将此步骤简化为：也可将此步骤简化为：视组织块量加入视组织块量加入5-65-6倍的倍的0.25%0.25%胰酶液胰酶液，3737中消化中消化20-40 20-40 minmin，每隔，每隔5 min5 min振荡一次。振荡一次。静置，吸去上清，用静置，吸去上清，用细胞生长液细胞生长液漂洗消化后的组织块，用漂洗消化后的组织块，用吸管反复吹打组织块，使细胞分离，静置，使未分散的组吸管反复吹打组织块，使细胞分离，静置，使未分散的组织块下沉。织块下沉。取细胞悬液接种至加了取细胞悬液接种至加了细胞生长液细胞生长液的培养瓶中（调整细胞的培养瓶中（调整细胞浓度到浓度到5105105 5/ml/ml左右），左右），37 37 下培养。下培养。（注意：省略了离心、计数等步骤）（注意：省略了离心、计数等步骤）72优质课件胰酶消化法操作步骤-消化、接种培养也可将此步骤简化为组织块直接培养法操作步骤组织块直接培养法操作步骤 组织块接种：组织块接种：将组织块转移到培养瓶，贴附于瓶底面。将组织块转移到培养瓶，贴附于瓶底面。翻翻转转瓶瓶底底朝朝上上，将将细细胞胞生生长长液液加加至至瓶瓶中中，培培养养液液勿接触组织块。勿接触组织块。3737静静置置3-5 3-5 h h，轻轻轻轻翻翻转转培培养养瓶瓶，使使组组织织浸浸入入细胞生长液细胞生长液中（勿使组织漂起），中（勿使组织漂起），37 37 继续培养。继续培养。73优质课件组织块直接培养法操作步骤组织块接种：73优质课件原代细胞培养结果原代细胞培养结果细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长如接种的细胞密度适宜，如接种的细胞密度适宜，5-7 d5-7 d即可形成单层即可形成单层74优质课件原代细胞培养结果细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长72 2 传代细胞培养传代细胞培养细胞细胞“一代一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3-63-6次次培养的细胞形成培养的细胞形成单层汇合单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:21:2或或1:31:3以上的比率转移到新的容器中进行培养，即为以上的比率转移到新的容器中进行培养，即为传代培养传代培养。也是一种也是一种将细胞种保存下去的方法将细胞种保存下去的方法。同时也是。同时也是利用培养细胞进利用培养细胞进行各种实验的必经过程行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。75优质课件2传代细胞培养细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期细胞传代方法细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有根据细胞生长的恃点，传代方法有3 3种。种。1.1.悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（离心法传代：离心（10001000转转/分分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞慢慢沉淀在瓶壁后，将上清培养液去除直接传代法：悬浮细胞慢慢沉淀在瓶壁后，将上清培养液去除1/2-2/31/2-2/3，然，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2.2.半悬浮生长细胞传代（半悬浮生长细胞传代（HeLaHeLa细胞）细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。瓶壁脱落下来，进行传代。3.3.贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用消化液是采用酶消化法传代。常用消化液是0.250.25胰蛋白酶液。胰蛋白酶液。76优质课件细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。76优质课件消化法传代培养步骤消化法传代培养步骤77优质课件消化法传代培养步骤77优质课件选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯 旁，倒去瓶中的旁，倒去瓶中的旧培养液，加入旧培养液，加入2 2-3 3 mlml的的D-HanksD-Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片去悬浮在细胞表面的碎片.加入适量加入适量0 0.1-.1-0.250.25胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液用用HanksHanks液洗涤液洗涤1 1次，加入适量培养液，反复吹打细胞，使其成细次，加入适量培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。胞悬液。以以1:21:2或或1:31:3进行分装，并在培养瓶上做好标进行分装，并在培养瓶上做好标 记，注明代号、日记，注明代号、日期，轻轻摇匀，期，轻轻摇匀，37 CO 37 CO2 2培养箱培养。培养箱培养。观察：细胞培养观察：细胞培养24h24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。况。贴壁生长细胞传代方法贴壁生长细胞传代方法78优质课件选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯旁，倒去瓶中的旧培3 3 培养细胞生长测定培养细胞生长测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。方法：细胞计数法细胞计数法 台盼蓝染色法台盼蓝染色法 生长曲线法生长曲线法 四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法）比色法79优质课件3培养细胞生长测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。细胞计数细胞计数用细胞计数法测定细胞生长动力学是目前采用的最普遍的方用细胞计数法测定细胞生长动力学是目前采用的最普遍的方法。法。血细胞计数板人工计数血细胞计数板人工计数 细胞计数器细胞计数器 血细胞计数板：常用的是改良的纽巴氏血细胞计数板：常用的是改良的纽巴氏(Neubauer)(Neubauer)血细胞计血细胞计数板。数板。80优质课件细胞计数用细胞计数法测定细胞生长动力学是目前采用的最普遍的方实验原理实验原理：血球计数盘一般有二个血球计数盘一般有二个chamberschambers，每个，每个chamber chamber 中细刻中细刻9 9 个个1 m1 mm m2 2 大正方形，其中大正方形，其中4 4 个角落之正方形再细刻个角落之正方形再细刻16 16 个小格，个小格，深度均为深度均为0.1 mm0.1 mm。当。当chamber chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正上方盖上盖