二代测序简介课件

第二代测序技术简介第二代测序技术简介2019-1 第二代测序技术简介2019-1公司理念公司理念：毅新兴业以生命科学研究为本，致力于科学技术服务，为客户提供完美的科研平台。基因组基因组 SNPs（包括芯片、massarray）第二代大规模测序 病毒包装 miRNA表达谱蛋白组蛋白组 血清多肽谱 2DE LC-MS（Shotgun法）代谢组代谢组 NMR LC-MS自主仪器自主仪器 恒温金属浴 梯度PCR仪 恒温振荡仪Squenom质谱仪质谱仪SAI质谱仪质谱仪 MALDI TOF/TOF测序仪：测序仪：Polonator G.007 试剂试剂自主研发液体蛋白磁珠SBI试剂慢病毒RNA干扰库MicroRNA研究干细胞研究2019-2公司理念：毅新兴业以生命科学研究为本，致力于科学技术服务，为3内容提纲内容提纲从Sanger法到新一代测序技术第二代测序平台介绍第二代测序技术应用宏基因组学（Metagenomics）泛基因组学（Pangenomics）2019-33内容提纲从Sanger法到新一代测序技术2019-3Key Genomics Technologiesl1975-Southern DNA hybridization techniquel1977-Sangers chain-termination and Maxam、Gilberts chemical DNA sequencing methodsl1980-Automated in situ oligonucleotide synthesis instrumentl1985-Mulliss discovery of PCR at Cetusl1992-Affymatrix(Fodors group)first gene-chipl1995-ABIs first automated DNA sequencerl2006-2nd generation DNA sequencer on marketl2007 and beyond Single molecule sequencing techniques2019-4Key Genomics Technologies1975 Sangers MethodlLabeledprimer(1)lSequencereactions(4)lSequenceseparations(4)lSequenceread-out2019-5Sangers MethodLabeled primer 1st-Generation Automated DNA SequencerParallel runs on 96 capillaries on ABI 37002019-61st-Generation Automated DNA SLimitation of 1st Gen SequencerlThroughput lTime-consuming separation of chain-terminated fragmentslHard to produce massively parallel system based electrophoretic separation lSequencing CostlSample handling lDifficult to miniaturize2019-7Limitation of 1st Gen SequenceNeed for Faster and Cheaper Sequencing TechnologyPersonalGenomeProject2019-8Need for Faster and Cheaper SeTrends in Next-Generation SequencinglLarge-scale and high-throughputlAmplification on solid surface lCluster generation(bridge or polony amplification)lEmulsion PCR(fragment on beads)lIn situ sequencing by chain extensionlSequence by synthesis DNA polymerase lSequence by ligation DNA ligaselMassively parallel processinglArray of clusters,beadslMiniaturization through microfluidiclSingle molecule detection2019-9Trends in Next-Generation Sequ测序技术目标测序技术目标陈竺，日本血吸虫基因组人类全基因组测序的目人类全基因组测序的目标：标：1000美元美元/人人2008年预测年预测5年内实现年内实现2006年底，美国X大奖基金会设立了基因组Archon X大奖，奖金高达1000万美元。这项大奖将颁给第一个能在10天之内，用不到100万美元的费用，完成100个人类基因组测序的团队。附加条件是覆盖率不小于98%，误差不大于1/100000 bp。2019-10测序技术目标陈竺，日本血吸虫基因组人类全基因组测序的目标：1Next-Gen PlatformslGA Illumina/SolexalSBS with reversible fluorescent terminatorslGS FLX Roche/454 Life ScienceslSBS through pyrosequencing lSOLiD ABI/AgencourtlSBL with dual base encodinglPOLONATOR Danaher MotionlSBL with base encoding2019-11Next-Gen PlatformsGA IlluminNext-Gen Sequencing WorkflowFragment Library PreparationRandomPair-endImmobilizationofFragmentlSurface,BeadlCovalent or non-covalentSequentialSequenceExtensionReactionlPolymeraselLigaseImageAcquisitionandProcessinglFluorescencelChemiluminescenceSequenceReadandAssemblyClonalAmplificationlEmulsion PCRlColony/Cluster2019-12Next-Gen Sequencing WorkflowFr2nd Generation PerformanceGS 454SOLiDSOLEXAPOLONATOR技术原理聚合聚合酶酶/焦磷酸焦磷酸酶酶连接接酶酶聚合聚合酶酶连接接酶酶单运数据产量0.40.6Gb50Gb20Gb20G覆盖人基因组0.217617 平均读长（bp）400501002302样品准备2天天7天天9小小时7天天运行时间10小小时8天天9.5天天1周周精确度9999.9498.599%单次运行价格7万元万元3.5万元万元2.5万元万元40%off2019-132nd Generation PerformanceGS 4Roche/454LifeSciencesGenomeSequencer2019-14Roche/454 Life Sciences GenomRoche/454 Workflow DNA Library PrepDNA FragmentEnd repairedAsymetric Adaptors ligated(one biotinylated)Immobilized on streptavidin coated magnetic beadsDenatured-ss template DNA libraryPurifiednEmulsionAmplificationnTemplate DNA immobilized on primer coated capture beads thru hybridization(1 fragment on each bead)nThermocyle to amplify(forward primer is biotinylated)nAmplified beads enriched with streptavidin coated magnetic beads2019-15Roche/454 Workflow DNA LibraryRoche/454 Workflow BeadDepositionOneamplifiedbeadpermicrowellFollowedbyenzymebeadsandpackingbeadsEnzymebeadsSulfurylaseLuciferasePackingbeadshelptokeepDNAbeadinmicrowellnPyrosequencingn4 nucleotides sequentially flow innIncorporation of a nucleotide releases a pyrophosphate(PPi)nSufurylase convert PPi into ATPnATP hydrolized by luciferase using luciferin to produce light2019-16Roche/454 Workflow Bead DeposiPyrosequencingConvert PPi to ATPUse ATP to generate lightRemove(d)NTPs and excess ATP 2019-17PyrosequencingConvert PPi to ARoche/454 Workflow Image AcquisitionByCCDcameracoupledtothepicotiterplateChemiluminescentintensityreflectsnumberofnucleotideincorporatedineachflow;usedtodeterminehomopolymerregionUpto100cyclesrepeatednPost-acq ProcessingnDe novo sequencingnResequencingnAmplicon variant analysisnImage ProcessingnChemiluminescent event maped to wellnFlowgram generated for each wellnBase called2019-18Roche/454 Workflow Image AcquiRoche/454LifeSciencesGenomeSequencer速度快，一个测序反应耗时10个小时，获得100余万个读长和4-6亿个碱基对。测序读长最长，单个序列的读长更长，平均可达到400-500个碱基左右 准确度高，读长超过400bp时，单一读长的准确性可以超过99%；一致性好，测序结果一致性超过99.99%；可以进行PairEnd测序研究；2019-19Roche/454 Life Sciences Genom功能强大的基因组分析工具功能强大的基因组分析工具PolonatorG.007 Polonator系统是由Dr.George Church和他的研究小组发明，该系统使用了美国最先进试剂处理和检测的部件，采用了最敏感的检测设备，现在已发展成为一个包含多个基因组学应用领域的研究平台，并且承担了美国“Personal Genome Project”的个人基因组测序任务。Polonator G.007最大的优势在于开机运行成本低和Linux 开放资源软件。2019-20功能强大的基因组分析工具 PolonatorG.007Workflow配对末端文库制备配对末端文库制备：配对末端文库是将基因组DNA打断后，与中间接头连接，再环化，然后用Mme1酶切，使中间接头两端各有30bp的碱基，再加上两端的接头，形成文库。乳液乳液PCR：在微反应器中加入测序模板、PCR反应元件、微珠和引物，进行乳液PCR（Emulsion PCR）。微球富集和固定微球富集和固定：PCR完成之后，变性模板，富集带有延伸模板的微珠，去除多余的微珠。将微珠沉积在一块玻片上，微珠上的模板经过3修饰，可以与玻片共价结合。连接反应测序连接反应测序：polonator连接反应的底物是9碱基单链荧光探针混合物。探针的5末端分别标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对，结合的探针就提供了一个荧光检测信号，最终被仪器识别。2019-21Polonator G.007 Workflow配对末端文库PolonatorG.007数据量 每次运行可以得到10Gb的高质量数据 运行时间 80小时 读长 30bp2，每次运行可以读取1.2 1.3109个磁珠 准确性 超过99%运行成本 仅为目前二代测序系统运行成本的60%样品数/运行 同时支持2 8道最多16个样品测序2019-22Polonator G.007数据量 每次运行可以得到1Illumina/Solexa-Genome Analyzer Illumina Genome Analyzer是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，它基于专有的可逆终止化学反应原理。2019-23Illumina/Solexa-Genome AnalyzIllumina/Solexa Workflow2019-24Illumina/Solexa Workflow2019-22019-252019-252019-262019-262019-272019-27Solexa Genome Analyzer 测序通量高：每次运行后可获得30 GB的高品质过滤数据；简单、快速、自动化：制备样品文库可以在几小时内完成，一个星期内就能得到高精确度的数据；DNA序列的读取长度不断增加，当前达到100 bp；单个或配对末端支持：Genome Analyzer系统支持单个片段或配对末端文库；每张芯片有8个通道，每个通道可单独测序一个样品，也可以把多个样品混合在一起测序。2019-28Solexa Genome Analyzer 测序通量高ABI SOLiD Library PrepnShearedfragmentsaretaggedwithadapters(A1andA2)toeachend2019-29ABI SOLiD Library PrepSheareABI SOLiD Emulsion PCRnEmulsionPCRperformedusingDNAfragmentsfromlibraryonbeads(m)coatdwithoneoftheprimers2019-30ABI SOLiD Emulsion PCREmulsiABI SOLiD Bead DepositionnAmplifiedbeadenrichedonpolystyrenebeadscoatedwithA2adaptor;anybeadcontainingtheextendedproductswillbindpolystyrenebeadthroughitsP2end.ThisincreasethethroughputofbeadswithtargetedDNAfrom30%to80%n3endofenrichedproductmodifiedtoallowcovalentattachementtoglassslidesurfacerandomly2019-31ABI SOLiD Bead DepositionAmpFluorescent Probes2019-32Fluorescent Probes2019-32ABI SOLiD Sequence by LigationnUsedualbaseencodingthrough8-merprobeswithaligationsiteatthe3end,afluorescentdyeatthe5end,andacleavagesitebetweenthefifthandsixthnucleotidenEachcolorrepresentstwonucleotidesinwhichthesecondbaseofeachdinucleotideunitconstitutesthefirstbaseofthefollowingdinucleotide,knowingjustonebaseinthesequencewillleadustointerpretthewholesequence2019-33ABI SOLiD Sequence by LigatiNext-Gen Research Applicationsde novo 测序测序全基因组重测序全基因组重测序/基因组结构变异基因组结构变异转录组测序转录组测序/外显子测序外显子测序小分子小分子RNA测序分析测序分析宏基因组学（宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（泛基因组学（Pangenome）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP测序测序 2019-34Next-Gen Research Applications35Genome sequencing projects statisticsOrganismCompleteDraftassemblyInprogresstotalProkaryotes979106710183064Archaea671338118Bacteria91210549802946Eukaryotes22189169380Animals47559138Mammals2281848Birds213Fishes369Insects121729Flatworms224Roundworms191121Amphibians11Reptiles11Otheranimals121426Plants2124458Landplants293849GreenAlgae369Fungi107638124Ascomycetes8602694Basidiomycetes110819Otherfungi16411Protists6242454Apicomplexans111719Kinetoplasts1258Otherprotists4101226total:10011256118734442019-3535Genome sequencing projects sNext-Gen Research Applicationsde novo 测序测序全基因组重测序全基因组重测序/基因组结构变异基因组结构变异转录组测序转录组测序/外显子测序外显子测序小分子小分子RNA测序分析测序分析宏基因组学（宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（泛基因组学（Pangenome）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP测序测序 2019-36Next-Gen Research Applications人类基因组计划人类基因组计划Human Genome Project 1000 Genomes Project Personal Genome Project Cancer Genome Project 2019-37人类基因组计划Human Genome Project 10Next-Gen Research Applicationsde novo 测序测序全基因组重测序全基因组重测序/基因组结构变异基因组结构变异转录组测序转录组测序/外显子测序外显子测序小分子小分子RNA测序分析测序分析宏基因组学（宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（泛基因组学（Pangenome）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP测序测序 2019-38Next-Gen Research Applications转录组测序转录组测序/外显子测序外显子测序转录本结构研究转录本结构研究：UTR鉴定、鉴定、Intron边边界鉴定、可变剪切研究等。界鉴定、可变剪切研究等。非编码区域功能研究：非编码区域功能研究：non-codingRNA研究、研究、microRNA前体研究等。前体研究等。基因转录水平研究基因转录水平研究全新转录区域研究全新转录区域研究千种植物转录组研究计划千种植物转录组研究计划2019-39转录组测序/外显子测序转录本结构研究：UTR鉴定、IntroNext-Gen Research Applicationsde novo 测序测序全基因组重测序全基因组重测序/基因组结构变异基因组结构变异转录组测序转录组测序/外显子测序外显子测序小分子小分子RNA测序分析测序分析宏基因组学（宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（泛基因组学（Pangenome）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP测序测序 2019-40Next-Gen Research Applications小分子小分子RNA测序分析测序分析新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的预测和鉴定样品间差异表达分析miRNAs聚类和表达谱分析等 Small RNA（micro RNAs、siRNAs和 pi RNAs）是生命活动重要的调控因子，在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。2019-41小分子RNA测序分析新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的预Next-Gen Research Applicationsde novo 测序测序全基因组重测序全基因组重测序/基因组结构变异基因组结构变异转录组测序转录组测序/外显子测序外显子测序小分子小分子RNA测序分析测序分析宏基因组学（宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（泛基因组学（Pangenome）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP测序测序 2019-42Next-Gen Research ApplicationsMetagenomics宏基因组学（也称元基因组学、环境基因组学、生态基因组学）是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以测序分析和功能基因筛选为研究手段，研究微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间关系的新方法。对特定环境微生物种群全基因组DNA研究，可以从整体上对样品群落进行分析，不受微生物是否能培养的限制，而且研究对象从单一基因组到一个基因组集合，也摆脱了对于传统基因组研究的物种限制，开辟了微生物群体基因组学研究的新路径。2019-43Metagenomics宏基因组学（也称元基因组学、环境基Next-Gen Research Applicationsde novo 测序测序全基因组重测序全基因组重测序/基因组结构变异基因组结构变异转录组测序转录组测序/外显子测序外显子测序小分子小分子RNA测序分析测序分析宏基因组学（宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（泛基因组学（Pangenome）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP测序测序 2019-44Next-Gen Research ApplicationsPangenomePangenome(whole,supra-genome)is the total gene repertoire in a given species,including:coregenome,which is shared by all individuals,dispensablegenome,which is shared by some individuals,uniquegenome,which is unique to an individual.2019-45PangenomePangenome(whole,supNext-Gen Research Applicationsde novo 测序测序全基因组重测序全基因组重测序/基因组结构变异基因组结构变异转录组测序转录组测序/外显子测序外显子测序小分子小分子RNA测序分析测序分析宏基因组学（宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（泛基因组学（Pangenome）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP测序测序 2019-46Next-Gen Research ApplicationsDNA甲基化分析甲基化分析在哺乳动物中，甲基化位点一般发生在CpG的C位点上，导致C碱基的5号碳原子上被加上一个甲基。DNA甲基化也是目前研究得最为深入的表观遗传学标记。重亚硫酸氢盐-基因组测序法（bisulfite sequencing）是研究DNA甲基化的有力工具。用重亚硫酸氢盐（bisulfite）处理DNA后，C碱基被转换成U碱基，而发生甲基化的C碱基则维持不变。在随后进行的PCR扩增过程中，U碱基被替换成T碱基。因此，重亚硫酸氢盐的处理会反映出单个C碱基的甲基化状态。重亚硫酸氢盐法与高通量的测序方法结合后，能够无偏向的提供全基因组范围内的甲基化位点信息。2019-47DNA甲基化分析在哺乳动物中，甲基化位点一般发生在CpG的CNext-Gen Research Applicationsde novo 测序测序全基因组重测序全基因组重测序/基因组结构变异基因组结构变异转录组测序转录组测序/外显子测序外显子测序小分子小分子RNA测序分析测序分析宏基因组学（宏基因组学（Meta-Genomics）泛基因组学（泛基因组学（Pangenome）DNA甲基化分析甲基化分析ChIP测序测序 2019-48Next-Gen Research ApplicationsChIP-seqChIP-Seq是继ChIP-Chip之后蛋白/核酸相互作用研究领域的又一技术突破。通过对染色质免疫共沉淀（ChIP）获得的DNA片段进行大规模测序，可获得数百万条序列标签，并能把所研究蛋白的DNA结合位点精确定位到基因组上。2019-49ChIP-seqChIP-Seq是继ChIP-Chip之后蛋后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料仅供参考，实际情况实际分析后面内容直接删除就行The user can demonstrate on a projector or computer,or print the presentation and make it into a film to be used in a wider field感谢您的观看和下载The user can demonstr第二代测序平台解决方案：第二代测序平台解决方案：de novoresequencing transcriptometranscriptomeSNP/Indel SNP/Indel methylation Meta-Genomics Small RNAChIP-Seq 2019-52第二代测序平台解决方案：de novoresequencin