二维电泳的蛋白质提取和样品制备培训课件

二维电泳的蛋白质提取和样品制备样品制备原则样品制备原则n尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失丢失n细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和低温和蛋白酶抑制蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解剂可以防止蛋白的降解n样品裂解液应该制备，并且分装冻存样品裂解液应该制备，并且分装冻存-80-80，勿，勿反复冻融已制备好的样品反复冻融已制备好的样品n通过超速离心清除所有的杂质通过超速离心清除所有的杂质n加入加入尿素尿素之后加温不要超过之后加温不要超过3737，防止氨甲酰化，防止氨甲酰化而修饰蛋白而修饰蛋白2二维电泳的蛋白质提取和样品制备第一节细胞裂解方法第一节细胞裂解方法n温和裂解方法温和裂解方法n剧烈裂解方法剧烈裂解方法n用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解n蛋白沉淀步骤蛋白沉淀步骤n清除影响二维电泳图谱杂质清除影响二维电泳图谱杂质n裂解液组分裂解液组分3二维电泳的蛋白质提取和样品制备一、温和裂解法一、温和裂解法组成较简单样品组成较简单样品n渗透裂解渗透裂解血细胞、组织培养细胞血细胞、组织培养细胞低渗溶液悬浮细胞低渗溶液悬浮细胞n冻融裂解冻融裂解细菌、组织培养细胞细菌、组织培养细胞液氮迅速冷冻细胞，随后在液氮迅速冷冻细胞，随后在37 融化，反复几次融化，反复几次4二维电泳的蛋白质提取和样品制备n去污剂裂解去污剂裂解组织细胞组织细胞溶解细胞膜、裂解细胞，释放内容物溶解细胞膜、裂解细胞，释放内容物n酶裂解法酶裂解法消化细胞壁消化细胞壁溶菌酶溶菌酶 细菌细菌纤维素酶、果胶酶纤维素酶、果胶酶 植物植物溶细胞酶溶细胞酶 酵母酵母在等渗溶液中处理细胞在等渗溶液中处理细胞5二维电泳的蛋白质提取和样品制备二、剧烈裂解法二、剧烈裂解法n超声裂解法超声裂解法细胞样品细胞样品通过切应力裂解细胞通过切应力裂解细胞 迅速超声重悬细胞，并在冰上冷却迅速超声重悬细胞，并在冰上冷却n弗氏压碎器（弗氏压碎器（French Pressure cell）含有细胞壁的微生物含有细胞壁的微生物在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力6二维电泳的蛋白质提取和样品制备n研磨法研磨法固体组织、微生物固体组织、微生物冻存于液氮中，随后研磨成粉末冻存于液氮中，随后研磨成粉末n机械匀浆法机械匀浆法固体组织固体组织将组织切成小片，加入预冷的匀浆缓冲液，简将组织切成小片，加入预冷的匀浆缓冲液，简单匀浆，通过过滤或离心获得裂解液单匀浆，通过过滤或离心获得裂解液n玻璃珠匀浆法玻璃珠匀浆法细胞悬液、微生物细胞悬液、微生物剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁7二维电泳的蛋白质提取和样品制备三、蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解三、蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解n蛋白酶抑制剂鸡尾酒（蛋白酶抑制剂鸡尾酒（protease inhibitor cocktail）苯甲基磺酰氟苯甲基磺酰氟(Pheylmethylsulfonyl fluoride(Pheylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)PMSF)：不可逆的抑制剂，使用浓度为不可逆的抑制剂，使用浓度为1mmol/L1mmol/L，抑制丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸，抑制丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中迅速失活蛋白酶，但在水溶液中迅速失活AEBSFAEBSF ：丝氨酸抑制剂，使用浓度为：丝氨酸抑制剂，使用浓度为4mmol/L4mmol/L，AEBSFAEBSF的抑制活性与的抑制活性与PMSFPMSF相近，但它更易溶于相近，但它更易溶于水而且毒性低，水而且毒性低，AEBSFAEBSF可能改变蛋白的等电点可能改变蛋白的等电点8二维电泳的蛋白质提取和样品制备EDTAEDTA，EGTAEGTA：使用浓度为：使用浓度为1mmol/L1mmol/L，通过鳌合，通过鳌合蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属蛋白酶。蛋白酶。多肽蛋白酶抑制剂多肽蛋白酶抑制剂：使用浓度为：使用浓度为2-20ug/ml 2-20ug/ml 亮抑酶肽亮抑酶肽（LeupeptinLeupeptin）能抑制多种丝）能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶；氨酸和半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制剂（pepstatinpepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶；）抑制天冬氨酸蛋白酶；抑酶肽抑酶肽（aprotininaprotinin）能抑制许多丝氨酸蛋白酶；）能抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁苯丁抑制剂抑制剂（bestatinbestatin）能抑制氨基多肽酶）能抑制氨基多肽酶9二维电泳的蛋白质提取和样品制备甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（TLCkTLCk），甲苯磺酰苯），甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（丙氨酰氯甲酮（TPCTPC）K K：使用浓度为：使用浓度为0.1-0.1-0.5mmol/L0.5mmol/L，不可逆的抑制丝氨酸和半胱氨酸，不可逆的抑制丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶的蛋白酶苄脒（苄脒（BenzamidineBenzamidine）：使用浓度为：使用浓度为1-1-3mmol/L3mmol/L，抑制丝氨酸蛋白酶，抑制丝氨酸蛋白酶10二维电泳的蛋白质提取和样品制备四、蛋白沉淀步骤四、蛋白沉淀步骤1 1、硫酸铵沉淀（盐析）、硫酸铵沉淀（盐析）n原理原理：在高盐溶液中，蛋白质倾向于聚合，并从：在高盐溶液中，蛋白质倾向于聚合，并从溶液中沉淀下来，许多潜在的杂质（如核酸）将溶液中沉淀下来，许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中保持在溶液中n步骤步骤：蛋白浓度大于：蛋白浓度大于1mg/ml1mg/ml，缓冲液浓度大于，缓冲液浓度大于50mmol/L50mmol/L，并含有，并含有EDTA,EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和，缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌搅拌1030min1030min，通过离心沉淀蛋白，通过离心沉淀蛋白n只能预分离或富集蛋白，残存的硫酸铵会干扰等只能预分离或富集蛋白，残存的硫酸铵会干扰等电聚焦电聚焦n硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用基有敏感作用 11二维电泳的蛋白质提取和样品制备2 2、三氯醋酸（、三氯醋酸（TCATCA）沉淀）沉淀n原理原理 在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐 作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团露出较多的疏水性基团,使之聚集沉淀使之聚集沉淀12二维电泳的蛋白质提取和样品制备2 2、三氯醋酸（、三氯醋酸（TCATCA）沉淀）沉淀n原理原理 随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大，随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大，TCA 可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，在电泳可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，在电泳前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎片，而且随时间的延长这一作用愈加明显片，而且随时间的延长这一作用愈加明显 电泳图谱显示，电泳图谱显示，BSA、HSA 单体谱带有较明显的展宽现单体谱带有较明显的展宽现象，这可能是由于象，这可能是由于TCA 的结合，使的结合，使SDS 与蛋白质的结合与蛋白质的结合量产生偏差，从而造成蛋白质所带电荷的不均一性，造成量产生偏差，从而造成蛋白质所带电荷的不均一性，造成迁移率的不一致迁移率的不一致13二维电泳的蛋白质提取和样品制备2 2、三氯醋酸（、三氯醋酸（TCATCA）沉淀）沉淀n有效的沉淀方法有效的沉淀方法：将：将TCATCA加到提取液中，终加到提取液中，终浓度高达浓度高达1020%1020%，冰上沉淀，冰上沉淀30min30min；组织样；组织样可直接用可直接用1020%TCA1020%TCA进行匀浆；最后用丙酮进行匀浆；最后用丙酮清洗沉淀，以除去清洗沉淀，以除去TCATCAn蛋白质再溶解很困难，且不能完全再溶蛋白质再溶解很困难，且不能完全再溶14二维电泳的蛋白质提取和样品制备3 3、丙酮沉淀、丙酮沉淀n沉淀机理沉淀机理：降低水的介电常数，导致具有表面水：降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出n优点：优点：分辨能力比盐析法高，分辨能力比盐析法高，沉淀不用脱盐，过滤较为容易沉淀不用脱盐，过滤较为容易n在常温下，沉淀的蛋白质往往引起变性在常温下，沉淀的蛋白质往往引起变性 15二维电泳的蛋白质提取和样品制备4 4、在丙酮中用、在丙酮中用TCATCA沉淀沉淀n两者联合更加有效两者联合更加有效n10%TCA10%TCA在丙酮中重悬裂解的样品溶液在丙酮中重悬裂解的样品溶液(含有含有0.01%0.01%-巯基乙醇溶液或巯基乙醇溶液或20mmol/L DTT)20mmol/L DTT)，至少，至少-2020沉淀沉淀45min45minn仍然存在难再溶现象仍然存在难再溶现象16二维电泳的蛋白质提取和样品制备5 5、用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀、用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀n杂质含量高的植物样品很有效杂质含量高的植物样品很有效n蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋酸蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白铵从酚相中沉淀蛋白n此法较复杂，并且耗时较多此法较复杂，并且耗时较多17二维电泳的蛋白质提取和样品制备五、清除影响二维电泳图谱的杂质五、清除影响二维电泳图谱的杂质1 1、盐离子、痕量缓冲液和其他带电荷的小分子、盐离子、痕量缓冲液和其他带电荷的小分子n在在IPGIPG胶条中，盐离子可导致溶液的电导率增大胶条中，盐离子可导致溶液的电导率增大n胶条中的盐离子可能导致较大区域不能聚焦胶条中的盐离子可能导致较大区域不能聚焦n透析、旋转透析、凝胶过滤和沉淀透析、旋转透析、凝胶过滤和沉淀/重悬进行脱盐重悬进行脱盐处理处理18二维电泳的蛋白质提取和样品制备样品中太多盐离子干扰样品中太多盐离子干扰IEF丙酮沉淀去除盐和杂质丙酮沉淀去除盐和杂质19二维电泳的蛋白质提取和样品制备A.蛋白提取物蛋白提取物未经处理未经处理B.经脱盐处理经脱盐处理C.商品化试剂商品化试剂盒沉淀处理盒沉淀处理20二维电泳的蛋白质提取和样品制备带电荷杂质带电荷杂质21二维电泳的蛋白质提取和样品制备样品不纯样品不纯22二维电泳的蛋白质提取和样品制备2 2、内源性小分子（如核酸、代谢物和磷脂）、内源性小分子（如核酸、代谢物和磷脂）n带带负电荷，能发生偏阳极侧的聚焦不全负电荷，能发生偏阳极侧的聚焦不全nTCA/TCA/丙酮沉淀除去这类物质特别有效丙酮沉淀除去这类物质特别有效23二维电泳的蛋白质提取和样品制备3 3、离子去污剂、离子去污剂n与多肽形成复合物与多肽形成复合物n不能正确聚焦不能正确聚焦n重泡胀溶液可稀释含重泡胀溶液可稀释含SDSSDS样品样品n丙酮沉淀可去除部分丙酮沉淀可去除部分SDSSDSn高温下沉淀将最大限度除去高温下沉淀将最大限度除去SDS,SDS,但在但在-20-20沉淀会沉淀会更完全更完全24二维电泳的蛋白质提取和样品制备4 4、核酸（、核酸（RNARNA、DNADNA）n核酸增加样品的黏度，并导致背景弥散核酸增加样品的黏度，并导致背景弥散n高分子质量的核酸能阻滞凝胶孔径高分子质量的核酸能阻滞凝胶孔径n核酸可通过电稳态相互作用与蛋白结合，阻碍聚核酸可通过电稳态相互作用与蛋白结合，阻碍聚焦焦n核酸也将被银染染色，导致高背景核酸也将被银染染色，导致高背景nDNase/RNase ADNase/RNase A混合物处理混合物处理n超离超离25二维电泳的蛋白质提取和样品制备5 5、多糖、多糖n阻碍凝胶孔径、导致沉淀、延长聚焦时间、出现阻碍凝胶孔径、导致沉淀、延长聚焦时间、出现水平条纹、与蛋白质形成复合物水平条纹、与蛋白质形成复合物n硫酸铵或苯酚硫酸铵或苯酚/醋酸铵沉淀，随后离心醋酸铵沉淀，随后离心n超速离心超速离心26二维电泳的蛋白质提取和样品制备6 6、脂类、脂类n膜蛋白与脂类形成复合物，降低溶解性，影响等膜蛋白与脂类形成复合物，降低溶解性，影响等电点和分子量电点和分子量n脂类与去污剂形成复合物，减低其效率脂类与去污剂形成复合物，减低其效率n强变性剂和去污剂最大程度减少蛋白与脂类的相强变性剂和去污剂最大程度减少蛋白与脂类的相互作用互作用27二维电泳的蛋白质提取和样品制备7 7、酚类组分、酚类组分n通过酶催化的氧化反应来修饰蛋白通过酶催化的氧化反应来修饰蛋白n应用还原剂防止苯酚的氧化应用还原剂防止苯酚的氧化n通过沉淀方法迅速从酚组分中分离蛋白通过沉淀方法迅速从酚组分中分离蛋白n用抑制剂灭活多酚氧化酶用抑制剂灭活多酚氧化酶nPVPPVP或或PVPPPVPP吸收酚来清除酚组分吸收酚来清除酚组分28二维电泳的蛋白质提取和样品制备8 8、不溶物质、不溶物质n阻碍凝胶孔径，导致聚焦不良阻碍凝胶孔径，导致聚焦不良n阻碍蛋白进人阻碍蛋白进人IPGIPG胶条胶条n先除去不溶物质先除去不溶物质29二维电泳的蛋白质提取和样品制备六、裂解液的组分六、裂解液的组分n基本成分：尿素、一种或几种去污剂基本成分：尿素、一种或几种去污剂n尿素：中性离液剂，可溶解和解折叠大多数蛋白尿素：中性离液剂，可溶解和解折叠大多数蛋白质，形成完全随机的构象，使所有的离子基团暴质，形成完全随机的构象，使所有的离子基团暴露于溶液中露于溶液中n去污剂：去污剂：确保蛋白完全溶解，防止通过疏水相互确保蛋白完全溶解，防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合作用导致蛋白聚合n还原剂还原剂：断裂二硫键，以保持蛋白处于一种还原：断裂二硫键，以保持蛋白处于一种还原状态状态n载体两性电解质、载体两性电解质、IPG bufferIPG buffer:通过电荷与电荷之通过电荷与电荷之间的相互作用减少蛋白聚合以增加溶解性间的相互作用减少蛋白聚合以增加溶解性30二维电泳的蛋白质提取和样品制备1 1、可溶性样品、可溶性样品n血清、血浆、尿样、脑脊液以及细胞和组织的水血清、血浆、尿样、脑脊液以及细胞和组织的水溶性提取物，经很少的前处理便可进行溶性提取物，经很少的前处理便可进行2-DE2-DEn蛋白质浓度较高的样品，适量样品裂解缓冲液稀蛋白质浓度较高的样品，适量样品裂解缓冲液稀释后直接分析释后直接分析n较低的蛋白质浓度或较高盐浓度的样品，可透析较低的蛋白质浓度或较高盐浓度的样品，可透析或液相色谱脱盐，通过冻干、聚乙二醇的透析、或液相色谱脱盐，通过冻干、聚乙二醇的透析、超滤、超滤、TCA/TCA/丙酮沉淀浓缩样品丙酮沉淀浓缩样品导致蛋白酶失活，进而减少蛋白质导致蛋白酶失活，进而减少蛋白质降解，去除杂质、富集碱性蛋白质降解，去除杂质、富集碱性蛋白质七、样品制备七、样品制备31二维电泳的蛋白质提取和样品制备2 2、组织样品、组织样品n组织在液氮中冷冻后破碎组织在液氮中冷冻后破碎n组织样品的异质性组织样品的异质性免疫亲和技术免疫亲和技术激光捕获微量切割技术（激光捕获微量切割技术（LCMLCM）32二维电泳的蛋白质提取和样品制备3 3、细胞、细胞n体外悬浮培养细胞或周期性细胞样品：离心收集，体外悬浮培养细胞或周期性细胞样品：离心收集，随后用磷酸盐缓冲液清洗并溶于样品缓冲液随后用磷酸盐缓冲液清洗并溶于样品缓冲液n固体基质中培养的细胞：去除培养基质，固体基质中培养的细胞：去除培养基质，PBSPBS或等或等渗蔗糖溶液清洗细胞层，刮擦方法收获细胞，避渗蔗糖溶液清洗细胞层，刮擦方法收获细胞，避免使用蛋白裂解酶；或加入少量体积裂解缓冲液，免使用蛋白裂解酶；或加入少量体积裂解缓冲液，将附着在基质上的细胞直接裂解将附着在基质上的细胞直接裂解n核酸含量过高，用不含蛋白酶的核酸含量过高，用不含蛋白酶的DNase/RNaseDNase/RNase混合混合物来处理样品物来处理样品33二维电泳的蛋白质提取和样品制备4 4、样品分级、样品分级n目的：降低样品的复杂性并富集低拷贝蛋白质目的：降低样品的复杂性并富集低拷贝蛋白质n亚细胞收集、液相电泳、吸附色谱、选择性沉淀亚细胞收集、液相电泳、吸附色谱、选择性沉淀n蛋白质在一系列溶解能力逐渐增强的缓冲液中溶蛋白质在一系列溶解能力逐渐增强的缓冲液中溶解性能的不同解性能的不同34二维电泳的蛋白质提取和样品制备八、溶解八、溶解n理想的理想的2-DE溶解应能达到破坏所有非共价溶解应能达到破坏所有非共价结合蛋白质复合物和聚积体，形成各个多结合蛋白质复合物和聚积体，形成各个多肽的溶解液肽的溶解液样品中结合牢固的蛋白质复合物可能使样品中结合牢固的蛋白质复合物可能使2-DE中出现新的蛋白质点，相应地表示单个多肽的中出现新的蛋白质点，相应地表示单个多肽的点强度将下降点强度将下降必须允许去除可能干扰必须允许去除可能干扰2-DE分离的盐、脂类、分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质多糖和核酸等物质样品中蛋白质在样品中蛋白质在2-DE过程中必须保持可溶性过程中必须保持可溶性35二维电泳的蛋白质提取和样品制备n起载体作用的两性电解质：即使在变性剂和表面起载体作用的两性电解质：即使在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质质也需要在盐活性剂存在的情况下，某些蛋白质质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则在离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则在其其pI点时会发生沉淀点时会发生沉淀 两性电解质的浓度应小于两性电解质的浓度应小于0.2%(w/v)，过高，过高会使会使IEF速度降低速度降低 两性电解质的两性电解质的pH应与应与IPG胶条的胶条的pH范围相符范围相符增加样品溶解性手段增加样品溶解性手段37二维电泳的蛋白质提取和样品制备第二节第二节 蛋白质分步提取技术蛋白质分步提取技术n分步提取法所采用裂解液的溶解性能是逐渐增加分步提取法所采用裂解液的溶解性能是逐渐增加的的n第一步裂解液第一步裂解液：只含有：只含有40mmol/L Tris40mmol/L Tris，其余为去，其余为去离子水，只溶解偏亲水性的蛋白质离子水，只溶解偏亲水性的蛋白质n第二步裂解液第二步裂解液：属传统的裂解方法，含有表面活：属传统的裂解方法，含有表面活性剂性剂CHAPSCHAPS、还原剂、还原剂DTTDTT、解聚剂、解聚剂UreaUrea等成分，具等成分，具有良好的溶解能力，可以溶解亲水性、中性和较有良好的溶解能力，可以溶解亲水性、中性和较疏水性的蛋白疏水性的蛋白n第三步裂解液第三步裂解液：添加了能促进疏水性蛋白质溶解：添加了能促进疏水性蛋白质溶解的成分（表面活性剂的成分（表面活性剂SB3-10SB3-10、还原剂、还原剂DTTDTT、解聚剂、解聚剂thiourea,thiourea,）主要溶解偏疏水性的蛋白质）主要溶解偏疏水性的蛋白质38二维电泳的蛋白质提取和样品制备蛋白样品蛋白样品40mmol/L Tris收集上清收集上清冷冻干燥冷冻干燥8mol/L Uter,4%CHAPS,100mmol/L DTT,40mmol/L Tris,0.5%CA在在40mmol/L Tris中不溶的沉淀中不溶的沉淀8mol/L Uter,4%CHAPS,2mmol/L TBP,40mmol/L Tris,0.5%CA收集上清收集上清39二维电泳的蛋白质提取和样品制备在在8mol/L Uter,4%CHAPS,100mmol/L DTT,40mmol/L Tris,0.5%CA中不溶的沉淀中不溶的沉淀5mol/L Uter,2mol/L thiourea,2%CHAPS,2%SB3-10,2mmol/L TBP,40mmol/L tris-base,0.5%CA收集上清收集上清在在5mol/L Uter,2mol/L thiourea,2%CHAPS,2%SB3-10,2mmol/L TBP,40mmol/L tris-base,0.5%CA不溶的沉淀不溶的沉淀分步提取法示意图分步提取法示意图40二维电泳的蛋白质提取和样品制备第三节第三节 亚细胞分离与蛋白质提取亚细胞分离与蛋白质提取n亚细胞的纯化和分级可获得高度纯化和富集的蛋亚细胞的纯化和分级可获得高度纯化和富集的蛋白白n最基本的方法：依据蛋白的大小和密度差异来进最基本的方法：依据蛋白的大小和密度差异来进行亚细胞分级行亚细胞分级低速离心，从胞质细胞器中分离出细胞核和未破碎的低速离心，从胞质细胞器中分离出细胞核和未破碎的细胞，获得所需上清细胞，获得所需上清通过各种密度梯度从上清中分离出各种细胞器通过各种密度梯度从上清中分离出各种细胞器二维电泳分离，计算机帮助图像分析显示出差异蛋白二维电泳分离，计算机帮助图像分析显示出差异蛋白41二维电泳的蛋白质提取和样品制备一、膜蛋白的提取和分离一、膜蛋白的提取和分离42二维电泳的蛋白质提取和样品制备一、膜蛋白的提取和分离一、膜蛋白的提取和分离n膜蛋白：多肽链跨越脂双分子层数次的蛋白，为膜蛋白：多肽链跨越脂双分子层数次的蛋白，为膜整合或膜内在蛋白膜整合或膜内在蛋白n膜内在蛋白结构域必须折叠成膜内在蛋白结构域必须折叠成螺旋或螺旋或片片层层的二的二级结级结构构n跨膜蛋白占跨膜蛋白占细细胞胞总总蛋白的蛋白的30%n膜蛋白膜蛋白处处于于细细胞的胞的边边界，在界，在细细胞的各种生命活胞的各种生命活动动中中发挥发挥重要的作用重要的作用信号信号转导、细胞粘附、代胞粘附、代谢、离子交、离子交换、内吞、内吞等等43二维电泳的蛋白质提取和样品制备提取膜蛋白应注意：提取膜蛋白应注意：n膜蛋白的纯度膜蛋白的纯度沉淀或分级技术也分离膜连的细胞器（如线粒体）沉淀或分级技术也分离膜连的细胞器（如线粒体）样品的制备中，并不是每一个蛋白质都是膜蛋白样品的制备中，并不是每一个蛋白质都是膜蛋白应用盐：溴化钾应用盐：溴化钾n使与膜相互作用较弱的蛋白分离出来而富集内使与膜相互作用较弱的蛋白分离出来而富集内在蛋白在蛋白应用去污剂分级应用去污剂分级n除去膜蛋白制品中的可溶性杂质除去膜蛋白制品中的可溶性杂质44二维电泳的蛋白质提取和样品制备n膜蛋白很难出现二维电泳凝胶图谱中膜蛋白很难出现二维电泳凝胶图谱中膜蛋白是低丰度的、多为偏碱性、难溶于等电膜蛋白是低丰度的、多为偏碱性、难溶于等电聚焦的水相介质中的蛋白聚焦的水相介质中的蛋白必须实现必须实现3个条件个条件n必须保证膜的脂类环境，还应避免多余脂类必须保证膜的脂类环境，还应避免多余脂类对等电聚焦的干扰对等电聚焦的干扰n必须以一种可溶的形式（去污剂必须以一种可溶的形式（去污剂-蛋白复合蛋白复合物）从膜中分离出来物）从膜中分离出来n所提取的膜蛋白必须在等电聚焦过程中维持所提取的膜蛋白必须在等电聚焦过程中维持可溶状态，特别是在等电点的位置可溶状态，特别是在等电点的位置45二维电泳的蛋白质提取和样品制备n当当pH7时，膜蛋白斑点数多于胞外蛋白；随着时，膜蛋白斑点数多于胞外蛋白；随着pH的增大，的增大，膜蛋白的优势越来越明显。膜蛋白的优势越来越明显。结核分枝杆菌胞外蛋白和膜蛋白结核分枝杆菌胞外蛋白和膜蛋白2DE图谱图谱 46二维电泳的蛋白质提取和样品制备二、核蛋白的提取和分离二、核蛋白的提取和分离n普遍存在于各种生物的细胞核中的特殊形态的蛋普遍存在于各种生物的细胞核中的特殊形态的蛋白质，由核酸与组蛋白、精蛋白等的碱性蛋白结白质，由核酸与组蛋白、精蛋白等的碱性蛋白结合而成为细胞核的主要成分合而成为细胞核的主要成分n核蛋白中的蛋白质包括组蛋白核蛋白中的蛋白质包括组蛋白(或精蛋白或精蛋白)和非组和非组蛋白蛋白质。组蛋白含碱性氨基酸如精氨酸、赖蛋白蛋白质。组蛋白含碱性氨基酸如精氨酸、赖氨酸等丰富的碱性蛋白，带正电荷。精蛋白仅出氨酸等丰富的碱性蛋白，带正电荷。精蛋白仅出现于真核细胞中，含较多的天门冬氨酸、谷氨酸现于真核细胞中，含较多的天门冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸，是酸性蛋白，带负电荷等酸性氨基酸，是酸性蛋白，带负电荷47二维电泳的蛋白质提取和样品制备二、核蛋白的提取和分离二、核蛋白的提取和分离n核蛋白属于中等溶解度核蛋白属于中等溶解度联合尿素、硫脲和去污剂裂解核蛋白，可达到联合尿素、硫脲和去污剂裂解核蛋白，可达到足够的分辨率足够的分辨率n核蛋白是强碱性蛋白（核蛋白是强碱性蛋白（pI10）与二维电泳的第一维等电聚焦相容程度较低与二维电泳的第一维等电聚焦相容程度较低n核基质核基质核表面核纤层蛋白、多种低丰度核蛋白、核内核表面核纤层蛋白、多种低丰度核蛋白、核内不均一核糖核蛋白、与基质相关的不均一核糖核蛋白、与基质相关的DNA结合区结合区48二维电泳的蛋白质提取和样品制备在含有在含有0.05%TritonX-100和和1.2mmol/L蛋白酶蛋白酶抑制剂缓冲液中匀浆数分钟，离心去除脂类和抑制剂缓冲液中匀浆数分钟，离心去除脂类和可溶性蛋白（可溶性蛋白（Fey和和Penman建立的核基质提建立的核基质提取方法）取方法）多发性骨髓瘤耐药细胞株核基质蛋白多发性骨髓瘤耐药细胞株核基质蛋白 2-D图49二维电泳的蛋白质提取和样品制备二、核蛋白的提取和分离二、核蛋白的提取和分离n核膜的组成核膜的组成与内质网连续的核外膜、由核纤层支撑的核内与内质网连续的核外膜、由核纤层支撑的核内膜、由核纤层蛋白组成的中间网格、位于核孔膜、由核纤层蛋白组成的中间网格、位于核孔复合体的连接内外核膜的核孔膜复合体的连接内外核膜的核孔膜参照参照Dreger M方法方法50二维电泳的蛋白质提取和样品制备