生物化学实验FolinWu法定量测定课件

生物化学实验-Folin-Wu法定量测定41、实际上，我们想要的不是针对犯罪的法律，而是针对疯狂的法律。马克吐温42、法律的力量应当跟随着公民，就像影子跟随着身体一样。贝卡利亚43、法律和制度必须跟上人类思想进步。杰弗逊44、人类受制于法律，法律受制于情理。托富勒45、法律的制定是为了保证每一个人自由发挥自己的才能，而不是为了束缚他的才能。罗伯斯庇尔生物化学实验-Folin-Wu法定量测定41、实际上，我们1生物化学实验FolinWu法定量测定课件2生物化学实验FolinWu法定量测定课件3生物化学实验FolinWu法定量测定课件4生物化学实验FolinWu法定量测定课件5血糖测定的目的和意义血糖测定的目的和意义临床：临床：血糖检测是目前诊断糖代谢异常相关疾病的血糖检测是目前诊断糖代谢异常相关疾病的主要依据。主要依据。科研：科研：在代谢疾病的研究中，常测定血糖。在某些在代谢疾病的研究中，常测定血糖。在某些药物的研究中，也涉及血糖的测定。药物的研究中，也涉及血糖的测定。v调节血糖水平的激素：调节血糖水平的激素：胰岛素、胰高胰岛素、胰高血糖素、糖皮质激素和肾上腺素。血糖素、糖皮质激素和肾上腺素。v血糖水平异常：血糖水平异常：高血糖及糖尿病；高血糖及糖尿病；低血糖低血糖血糖测定的目的和意义临床：血糖检测是目前诊断糖代谢异常相关疾6 高血糖症：高血糖症：指空腹血糖浓度超过7.3mmol/L,有生理性和病理性之分，临床上最常见的病理性高血糖症是糖尿病。糖尿病：糖尿病：是一种慢性、复杂的代谢紊乱性疾病,系胰岛素绝对不足或相对不足，以高血糖症为基本生化特点。同时伴有糖、脂类、蛋白质、水、电解质和酸碱平衡紊乱，甚至出现一系列并发症如眼、肾的微血管病变及神经病变等。高血糖症：指空腹血糖浓度超过7.3mmol/L,有生理性7 症状随机血浆葡萄糖症状随机血浆葡萄糖 11.1mmol/L,11.1mmol/L,或空腹或空腹血浆葡萄糖血浆葡萄糖 7.0mmol/L 7.0mmol/L。症状不典型者需另。症状不典型者需另一天再次证实。随机血糖是指一天中的任一时一天再次证实。随机血糖是指一天中的任一时间采血测得的血糖浓度。间采血测得的血糖浓度。糖尿病典型的症状是糖尿病典型的症状是“三多一少三多一少”，即多饮即多饮、多尿、多食及消瘦多尿、多食及消瘦糖尿病的糖尿病的诊诊断断标标准准 症状随机血浆葡萄糖 11.1mmol/L,或空腹血浆8血糖的血糖的测测定方法定方法测定测定方法方法酶法：酶法：（1 1）己糖激酶法（）己糖激酶法（HKHK）（2 2）葡萄糖氧化酶法（）葡萄糖氧化酶法（GODGOD法）法）特异性高，灵敏度高，干扰因素少特异性高，灵敏度高，干扰因素少，适用于自动化适用于自动化分析，为葡萄糖测定的分析，为葡萄糖测定的参考方法参考方法，但是试剂较贵但是试剂较贵无机化学法：无机化学法：Folin-WuFolin-Wu法，特异性差法，特异性差有机化学法：有机化学法：邻甲苯胺法、联苯胺法、氨基联苯法邻甲苯胺法、联苯胺法、氨基联苯法干扰因素多干扰因素多血糖的测定方法测定方法酶法：（1）己糖激酶法（HK）无机化9掌握FolinWu法测定血糖含量的原理和方法。学会制备无蛋白血滤液。掌握7200型可见分光光度计的使用方法。一一、目的要求目的要求掌握FolinWu法测定血糖含量的原理和方法。一、目的要求10二、二、实验原理原理葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基基，CuCu2+2+即被葡萄糖还原成即被葡萄糖还原成CuCu+（CuCu2 2O O）而沉淀。）而沉淀。Cu Cu2+2+(CuSO(CuSO4 4)+)+葡萄糖葡萄糖 Cu Cu+（CuCu2 2O O）无蛋白血滤液中的葡萄糖和酸性钼酸盐溶液共热反应无蛋白血滤液中的葡萄糖和酸性钼酸盐溶液共热反应,CuCu2 2O O又把酸性钼酸试剂（又把酸性钼酸试剂（MoMo6+6+）还原成低价的蓝色钼化合物）还原成低价的蓝色钼化合物钼蓝钼蓝 。CuCu2 2O+O+酸性钼酸试剂酸性钼酸试剂 蓝色钼化合物蓝色钼化合物 OD OD420420比色比色 血滤液中葡萄糖的含量与产生的血滤液中葡萄糖的含量与产生的CuCu2 2O O成正比，而成正比，而CuCu2 2O O的量的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。二、实验原理葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原11三、三、实验仪实验仪器器1 1、25mL25mL血糖管血糖管33支；支；2 2、血糖管橡胶塞、血糖管橡胶塞33个；个；3 3、沸水浴小锅沸水浴小锅11个个；4 4、100mL100mL锥形瓶锥形瓶22个；个；5 5、电炉、电炉11个；个；6 6、滤纸、滤纸11盒；盒；7 7、吸耳球、吸耳球22个；个；8 8、72007200型分光光度计型分光光度计11台台;血糖管血糖管7200型分光光度计型分光光度计三、实验仪器1、25mL血糖管3支；2、血糖管橡胶塞12 1 1、标准葡萄糖溶液（、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml0.1mg/ml）(1)1%(1)1%葡萄糖母液：称取葡萄糖母液：称取1.000g1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml100ml。(2)(2)葡萄糖标准液：取葡萄糖标准液：取1.0ml1.0ml葡萄糖母液于葡萄糖母液于100ml100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。容量瓶中，加蒸馏水定容。2 2、10%10%钨酸钠溶液：钨酸钠溶液：称取钨酸钠称取钨酸钠10g10g，溶于蒸馏水并定容至，溶于蒸馏水并定容至100100毫升。毫升。3 3、0.33mol/LH0.33mol/LH2 2SOSO4 4溶液：溶液：于于53ml53ml蒸馏水中加入蒸馏水中加入1ml1ml的浓硫酸。的浓硫酸。4 4、碱性硫酸铜溶液、碱性硫酸铜溶液 A A液：无水碳酸钠液：无水碳酸钠35g35g，酒石酸钠，酒石酸钠13g13g及碳酸氢钠及碳酸氢钠11g11g溶于蒸馏水，稀释溶于蒸馏水，稀释定容至定容至1000ml.1000ml.B B液：硫酸铜晶体液：硫酸铜晶体5g5g，溶于蒸馏水并定容至，溶于蒸馏水并定容至100ml100ml。临用时，临用时，A A液：液：B B液液=9=9：1 1混合（体积比），混合液于冰箱中保存混合（体积比），混合液于冰箱中保存（44）。）。四、四、实验试剂实验试剂 1、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）四、实验试剂中国海洋135 5、酸性钼酸盐溶液：、酸性钼酸盐溶液：称取钼酸钠称取钼酸钠600g,600g,用少量蒸馏水溶解后倾入用少量蒸馏水溶解后倾入2000ml 2000ml 的容量瓶中，加蒸的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml0.5ml，摇匀，摇匀，静止数小时后取上清夜静止数小时后取上清夜500ml500ml，于，于1000ml1000ml容量瓶中，徐徐加入容量瓶中，徐徐加入225ml85%225ml85%磷酸，边加边摇匀，再加磷酸，边加边摇匀，再加25%25%硫酸硫酸150ml150ml。置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加99%99%醋酸醋酸75ml75ml，摇匀，摇匀，用蒸馏水稀释定容至用蒸馏水稀释定容至1000ml,1000ml,贮于棕色瓶中。贮于棕色瓶中。四、四、实验试剂实验试剂5、酸性钼酸盐溶液：四、实验试剂中国海洋大学生物基础实验教学141 1、无蛋白血滤液的制备、无蛋白血滤液的制备：用用5ml5ml移移液液管管吸吸取取全全血血（已已加加抗抗凝凝剂剂）1ml,1ml,缓缓缓缓放放入入100ml100ml锥锥形形瓶瓶中中，加加蒸蒸馏馏水水7ml7ml，摇摇匀匀，溶溶血血后后（血血液液变为红色透明）加变为红色透明）加10%10%钨酸钠钨酸钠1ml1ml，摇匀，摇匀.。再再加加0.33mol/L 0.33mol/L H H2 2SOSO4 41ml1ml，边边加加边边摇摇，加加毕毕充充分分摇摇匀匀，放放置置5 51515分分钟钟，至至沉沉淀淀变变为为暗暗棕棕色色（如如不不变变色色可可再再加加0.33mol/L H0.33mol/L H2 2SOSO4 41-21-2滴）。滴）。用用干干滤滤纸纸过过滤滤。先先倾倾入入少少许许，待待滤滤纸纸湿湿润润后后在在全全部部倒倒入入，如如滤滤液液不不清清需需重重新新过过滤滤。每每毫毫升升无无蛋蛋白白血血滤滤液液相相当于当于1/10ml1/10ml全血。全血。五、五、实验实验步步骤骤1、无蛋白血滤液的制备：五、实验步骤中国海洋大学生物基础实验152 2、血糖的定量测定：、血糖的定量测定：取取25ml25ml的血糖管的血糖管3 3支，编号。第一支血糖管中加入支，编号。第一支血糖管中加入2ml2ml蒸馏水蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加（空白管）；第二支血糖管中加2ml2ml标准葡萄糖液；用吸管标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液吸取无蛋白血滤液2ml2ml，放入第三支血糖管中。，放入第三支血糖管中。然后向三支血糖管中各加入然后向三支血糖管中各加入2ml2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中同时置于沸水浴中8 8分钟，取出，在流水中迅速冷却后分钟，取出，在流水中迅速冷却后,勿摇勿摇动动，各加，各加4ml4ml酸性钼酸盐溶液。酸性钼酸盐溶液。一分钟后，用蒸馏水稀释至一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml25ml，混匀，用，混匀，用72007200分光光度计分光光度计在在420nm420nm波长处比色，以空白管调节零点。波长处比色，以空白管调节零点。2、血糖的定量测定：中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分16按下式计算按下式计算100ml100ml全血中所含血糖的含量全血中所含血糖的含量m=Am=A1 1/A/A0 0CC0 00.1100100式中式中:m m=100ml=100ml全血中含血糖毫克数全血中含血糖毫克数;C C0 0=标准液葡萄糖含量标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml0.1mg/ml）；A A1 1=样品液光吸收值样品液光吸收值;A A0 0=标准液光吸收值标准液光吸收值 0.10.1：1ml1ml无蛋白血溶液相对于无蛋白血溶液相对于0.1ml0.1ml全血全血六、六、结结果果计计算：算：按下式计算100ml全血中所含血糖的含量六、结果计算：中国17七、思考七、思考题题实验过程中那些操作可能影响实验结果的实验过程中那些操作可能影响实验结果的准确性？准确性？实验中，血糖管有什么作用？实验中，血糖管有什么作用？实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱性硫酸铜液反应后的血糖管？性硫酸铜液反应后的血糖管？七、思考题实验过程中那些操作可能影响实验结果的准确性？中国海18注意事项注意事项：1.1.加硫酸、钨酸钠时，要边加边摇匀加硫酸、钨酸钠时，要边加边摇匀2.2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸生成钨酸，在沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸生成钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性沉淀，如果沉淀不变暗棕色或适当酸度时，使血红蛋白变性沉淀，如果沉淀不变暗棕色或重新过滤后仍混浊，是因为血液中所加抗凝剂过多，可以加重新过滤后仍混浊，是因为血液中所加抗凝剂过多，可以加入入1010硫酸硫酸1-21-2滴，待暗棕色后再过滤。滴，待暗棕色后再过滤。3.3.用定量滤纸过滤后应该得到完全澄清无色之无蛋白血滤液。用定量滤纸过滤后应该得到完全澄清无色之无蛋白血滤液。如果得到仍带有红色的血滤液则说明蛋白质未被完全去除。如果得到仍带有红色的血滤液则说明蛋白质未被完全去除。注意事项：中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实19五、五、实验实验步步骤骤1 1、无蛋白血滤液的制备、无蛋白血滤液的制备：蒸馏水蒸馏水7ml 7ml 摇匀摇匀 10%10%钨酸钠钨酸钠1ml 1ml 摇匀摇匀 0.33mol/L 0.33mol/L H H2 2SOSO4 41ml 1ml 边加边摇边加边摇,加毕充分摇匀加毕充分摇匀 放置放置515分分(沉淀变为暗棕色沉淀变为暗棕色)(如不如不变色色,再加再加0.33mol/L H2SO412滴滴)干滤纸过滤干滤纸过滤 无蛋白血滤液无蛋白血滤液(每毫升相当于每毫升相当于1/10ml1/10ml全血全血)20ml20ml锥形瓶锥形瓶溶血溶血(变为红色透明变为红色透明)用用5ml5ml移液管移液管取全血取全血1ml1ml（已加抗凝剂（已加抗凝剂2、血糖的定量测定：、血糖的定量测定：m=OD1/OD2 C 10 100五、实验步骤1、无蛋白血滤液的制备：蒸馏水7ml 摇匀 1020分光光度分光光度计计的工作原理的工作原理分光光度计的工作原理中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分21朗伯朗伯-比比尔尔定律定律朗伯定律朗伯定律：A=kA=k1 1L L 比尔定律比尔定律：A=kA=k2 2C C朗伯朗伯-比尔定律比尔定律：如同时考虑液：如同时考虑液层厚度和溶液浓度对吸光度的层厚度和溶液浓度对吸光度的影响，则吸光度与溶质的浓度影响，则吸光度与溶质的浓度和溶液的厚度的乘积成正比。和溶液的厚度的乘积成正比。A=KLC A=KLC 朗伯-比尔定律朗伯定律：A=k1L 中国海洋大学生物基础实验22朗伯朗伯-比比尔尔定律定律应应用用A A标标=KC=KC标标L LA A样样=KC=KC样样L L 标准品法测定未知样品含量标准品法测定未知样品含量C C样样=A A样样A A标标C C标标朗伯-比尔定律应用A标=KC标L标准品法测定未知样品含量C样2372007200型分光光度型分光光度计计的操作程序的操作程序连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。接通电源，使仪器预热接通电源，使仪器预热2020分钟。分钟。用用键设置测试方式：投射比（键设置测试方式：投射比（T T），吸光度（），吸光度（A A），），已知标准样品浓度值方式（已知标准样品浓度值方式（C C）和已知标准样品斜率（）和已知标准样品斜率（F F）方式。方式。用波长选择旋钮设置您所需的分析波长用波长选择旋钮设置您所需的分析波长。7200型分光光度计的操作程序连接仪器电源线，确定仪器供电电24将参比样品溶液和被测样将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放一般情况下，参比样品放在第二个槽位中。在第二个槽位中。将将0 0T T校具（黑体）置入校具（黑体）置入光路中，在光路中，在T T方式下按方式下按“0“0T”T”键，此时显示器显示键，此时显示器显示“000.0”“000.0”将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，25按按 MODE MODE键选择键选择A A模式模式将参比样品拉入光路中，将参比样品拉入光路中，按按“0A/100“0A/100T”T”键调键调0A/1000A/100T T，此时显示器，此时显示器显示的显示的“BLA”“BLA”直至显示直至显示“0.000”A“0.000”A为止。为止。当仪器显示器显示出当仪器显示器显示出“0.000”A“0.000”A后，将被测样后，将被测样品推入光路，这时，您便品推入光路，这时，您便可从显示器上得到被测样可从显示器上得到被测样品的吸光度。品的吸光度。按 MODE键选择A模式中国海洋大学生物基础实验教学中心生化26中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室27中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室28 分光光度分光光度计计的使用注意事的使用注意事项项:比比色色皿皿的的清清洁洁程程度度，直直接接影影响响实实验验结结果果。因因此此，特特别要将比色皿清洗干净。别要将比色皿清洗干净。装装样样前前处处理理：自自来来水水反反复复冲冲洗洗蒸蒸馏馏水水漂漂洗洗2 2次次待待装溶液漂洗装溶液漂洗2 2次。次。用用完完后后用用自自来来水水和和蒸蒸馏馏水水洗洗净净并并用用檫檫镜镜纸纸檫檫干干放放回回比色皿盒中。比色皿盒中。分光光度计的使用注意事项:比色皿的清洁程度，直29 拿放比色皿时，应持其拿放比色皿时，应持其“毛面毛面”，不要接触，不要接触“光面光面”。光面光面毛面毛面若若比比色色皿皿外外表表面面有有液液体体，应应用用擦擦镜镜纸纸朝朝同同一一方方向向拭拭干干，以保证吸光度测量不受影响。以保证吸光度测量不受影响。拿放比色皿时，应持其“毛面”，不要接触“光面”30 比比色色皿皿内内盛盛液液应应为为其其容容量量的的2/32/3，过过少少会会影影响响实实验验结结果，过多易在测量过程中外溢，污染仪器。果，过多易在测量过程中外溢，污染仪器。容容量量的的2/32/3 比色皿的光面要与光源在一条线上。比色皿的光面要与光源在一条线上。光透过窗口光透过窗口 比色皿内盛液应为其容量的2/3，过少会影响实验31骑封篙尊慈榷灶琴村店矣垦桂乖新压胚奠倘擅寞侥蚀丽鉴晰溶廷箩侣郎虫林森-消化系统疾病的症状体征与检查林森-消化系统疾病的症状体征与检查11、越是没有本领的就越加自命不凡。邓拓12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。爱尔兰13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。老子14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。歌德15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。迈克尔F斯特利谢谢骑封篙尊慈榷灶琴村店矣垦桂乖新压胚奠倘擅寞侥蚀丽鉴晰溶廷32