第五讲-其它工具酶课件

其它工具酶其它工具酶2014-9-292014-9-29其它工具酶2014-9-29一、逆转录酶一、逆转录酶一、逆转录酶一、逆转录酶n逆逆转录酶（转录酶（reverse transcriptase）是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，又称RNA依赖的DNA聚合酶，其产物DNA 称cDNA，即互补DNA。n逆转录酶也是一个逆转录酶也是一个多功能酶多功能酶一、逆转录酶1、RNA依赖的依赖的DNA聚合酶聚合酶以以RNA链为模板，以带有链为模板，以带有3-OH末端的末端的DNA片段为引物，沿片段为引物，沿5 3方向方向合成合成DNA链。链。几乎所有真核生物的几乎所有真核生物的mRNA分子分子3末端都有一段末端都有一段Poly A，故加入寡聚，故加入寡聚dT后，后，mRNA就可以成为逆转录酶很好的模板，由此可合成就可以成为逆转录酶很好的模板，由此可合成cDNA。1、RNA依赖的DNA聚合酶2、外切、外切RNA酶活性酶活性底物是RNA-DNA杂交分子中的RNA链，其水解方向有两种：从RNA链5末端外切：称5 3外切RNA酶从RNA链3末端外切：称3 5外切RNA酶2、外切RNA酶活性3、DNA依赖的依赖的DNA聚合酶聚合酶以ssDNA为模板，以带有3-OH末端的DNA片段为引物，沿5 3方向合成DNA链。可在新合成的DNA链上合成另一条互补DNA。3、DNA依赖的DNA聚合酶4、逆转录酶在基因工程中的应用、逆转录酶在基因工程中的应用合成合成cDNA，克隆至载体中；，克隆至载体中；黏性末端补平、标记；黏性末端补平、标记；双脱氧测序时，如用其它酶效果不好，可使用反双脱氧测序时，如用其它酶效果不好，可使用反转录酶。转录酶。4、逆转录酶在基因工程中的应用合成cDNA，克隆至载体中；5、商品化的逆转录酶、商品化的逆转录酶禽成髓细胞瘤病毒（禽成髓细胞瘤病毒（AMV）逆转录酶）逆转录酶Moloney鼠白血病病毒（鼠白血病病毒（Mo-MLV）逆转录酶）逆转录酶两种逆转录酶均无两种逆转录酶均无35外切外切DNA酶活性，故不具备校对功能，在高酶活性，故不具备校对功能，在高浓度浓度dNTP和和Mn2+存在下，容易出现核苷酸错误掺入。存在下，容易出现核苷酸错误掺入。5、商品化的逆转录酶二、甲基化酶（二、甲基化酶（二、甲基化酶（二、甲基化酶（MethylaseMethylase）(一)甲基化酶的种类与识别序列(二二)甲基化对限制酶切的影响甲基化对限制酶切的影响二、甲基化酶（Methylase）(一)甲基化酶的种类与识原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。不被相应的限制酶所切割。1.限制修饰系统限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶型中的甲基化酶三个系统中的甲基化酶可使细菌三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成和腺嘌呤发生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤。甲基腺嘌呤。在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶位点可同可不同。M.EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同不同 MHpaI C mCGG HpaI C CGG 相同相同原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 2.E.coli的的dam、dcm甲基化酶甲基化酶这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。饰系统。Dam甲基化酶可在甲基化酶可在GATC序列中的序列中的腺嘌呤腺嘌呤N6位位置上引入甲基。置上引入甲基。GmATCDcm甲基化酶识别甲基化酶识别CCAGG或或CCTGG序列，在序列，在第二个第二个胞嘧啶胞嘧啶C5位置上引入甲基。位置上引入甲基。CmCAGGCmCTGG2.E.coli 的dam、dcm甲基化酶这类甲基化酶与限该酶可使该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与反应与DNA复制、基因转录等过程有关。复制、基因转录等过程有关。3.哺乳动物的甲基化酶哺乳动物的甲基化酶该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA复制、基因E.coli 中至少有中至少有3种依赖于甲基化的限制系种依赖于甲基化的限制系统统 mcrA、mcrBC 和和mrr它们识别的序列各不相同，但只识别经过甲它们识别的序列各不相同，但只识别经过甲基化的序列基化的序列都降解由都降解由CpG甲基化酶（甲基化酶（MSss）作用的）作用的DNA。4.E.coli中依赖于甲基化的限制修饰系统中依赖于甲基化的限制修饰系统E.coli 中至少有 3 种依赖于甲基化的限制系统 mcr(一）甲基化酶的种类与识别序列(二）甲基化对限制酶切的影响二）甲基化对限制酶切的影响(一）甲基化酶的种类与识别序列1、修饰酶切位点、修饰酶切位点M.Taq处理处理DNA后，后，GTCGAC将不受将不受Hinc切割。切割。GTCGACGTCAACGTTGACGTTAACHincM.TaqTCGA1、修饰酶切位点M.Taq 处理 DNA 后，GTCGA2、产生新的酶切位点、产生新的酶切位点Dpn 是依赖甲基化的限制酶TCGATCGA受 M.Taq 处理后形成甲基化产物 TCG*ATCG*A，其中 G*ATC 即为 Dpn 位点。2、产生新的酶切位点Dpn 是依赖甲基化的限制酶三、核酸酶三、核酸酶三、核酸酶三、核酸酶SISISISI1.作用特点：作用特点：此酶是从米曲霉（Aspergillus oryzae）中提取的，可降解ssDNA或RNA，又称单链特异性酶，其降解产物是5-磷酸末端的单或寡核苷酸片段。核酸酶SI对DNA底物的活性比对RNA强。高浓度的核酸酶SI可从缺口（nick）或裂口（gap）处降解dsDNA。三、核酸酶SI1.作用特点：核酸酶SI对DNA底物的活性比2.作用条件：作用条件：需要Zn2+作为辅助因子，最适pH是4.5这是与基因工程的其它工具酶不同的两个特点。3.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：由于核酸酶SI能从DNA片段中切除单链尾巴，因而在质粒的重建和DNA重组中被广泛使用。切除单链粘性末端，产生平末端，再用T4连接酶连接。切除cDNA的发夹结构。2.作用条件：1.作用特点：作用特点：此酶是从小牛腺中提取的，可催化单核苷酸转移到另一个DNA分子的3-OH末端上，不需要模板，其引物是带3-OH末端的ssDNA（Mg2+为辅因子）。平末端的dsDNA或带有3延伸末端的dsDNA，只有CO2+存在时才能作引物。四、末端脱氧核苷酸转移酶四、末端脱氧核苷酸转移酶四、末端脱氧核苷酸转移酶四、末端脱氧核苷酸转移酶1.作用特点：四、末端脱氧核苷酸转移酶2.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：在连接平末端DNA片段时加上互补的同源多聚物（同聚物加尾法）2.在基因工程中的应用：五、外核酸酶五、外核酸酶III1.作用特点：作用特点：此酶是从E.coli中分离得到的，是一种从dsDNA的3-OH末端降解产生5单核苷酸的外切酶。2.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：产生具有5延伸末端的DNA片段制备特异的DNA探针五、外核酸酶III1.作用特点：1.作用特点作用特点此酶是从乳白短杆菌（Brevibacerium aldidum）中提取的。能以渐进的方式从线型DNA分子的3，5两端同时降解，产物是单核苷酸或寡核苷酸片段：形成截短了的平端双链 DNA 分子（约占 10-20%）以及带有约 5 个核苷酸突出单链的截短分子（约占 80-90%）。作用对象：可以是带粘末端或是平末端的dsDNA，对3，5两端的结晶速度相同。六、外核酸酶六、外核酸酶Bal 31作用特点六、外核酸酶Bal 312.作用条件：作用条件：降解时需要Ca2+作辅助因子，以EDTA作螯合剂，可使Bal 31失活3.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：可用于组建DNA的物理图谱，以及造成克隆DNA分子的末端缺失2.作用条件：1.作用特点：作用特点：此酶是从噬菌体T4感染的E.coli中分离的能催化ATP的-磷酸转移到DNA或RNA的5-OH末端上七、七、T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶1.作用特点：七、T4多核苷酸激酶2.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：可用于缺乏5-磷酸的待连接DNA片段的5端磷酸化：反转录mRNA生成的cDNA、人工合成的DNA片段及PCR扩增得到的DNA都缺少5-磷酸基，在与克隆载体连接之前，需用T4多核苷酸激酶将DNA的5-磷酸化。2.在基因工程中的应用：1.作用特点：作用特点：从细菌中分离的碱性磷酸化酶简称BAP从小牛肠中分离的简称CAP。它能特异性地切去DNA或RNA的5-磷酸。底物可以是ssDNA、dsDNA或RNA，也可以是核糖或脱氧核糖核苷三磷酸。八、八、八、八、碱性磷酸化酶碱性磷酸化酶碱性磷酸化酶碱性磷酸化酶 1.作用特点：八、碱性磷酸化酶 2.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：在用32P标记DNA的5末端之前，除去未标记的磷酸。在DNA重组技术中，除去DNA片段的5-磷酸，阻止质粒自身环化，提高转化效率。2.在基因工程中的应用：第五讲-其它工具酶课件形成带有两个缺口的开环分子，由于环状DNA（即使是有缺口的环状DNA）的转化效率比线状质粒DNA片段高得多，因此绝大多数转化子都含有重组质粒，并且这样的缺口在寄主细胞内可自行补上。形成带有两个缺口的开环分子，由于环状DNA（即使是有缺口的环九、依赖于九、依赖于九、依赖于九、依赖于 DNADNA的的的的 RNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 1、来源：SP6 噬菌体 RNA 聚合酶来源于感染鼠伤寒沙门氏菌 LT2 菌株 T4 或 T7 噬菌体 RNA 聚合酶来源于噬菌体感染的大肠杆菌九、依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶 1、来源：SP6 噬RNA 聚合酶实际上就是转录中的 RNA 合成酶，识别 DNA 中各自特异的启动子序列，并沿此 dsDNA 模板起始 RNA 的合成。无需引物，但需识别特异性位点。2、活性：体外合成 RNA 分子。用于表达外源基因。3、用途：RNA 聚合酶实际上就是转录中的 RNA 合成酶，识别 DNRNaseA 来源于牛胰，为内切核酸酶，可特异攻击 RNA 上嘧啶残基的 3端。可除去 DNA:RNA 中未杂交的 RNA 区，可用来确定 DNA 或 RNA 中单碱基突变的位置。广泛用来去除 DNA 样品中的 RNA。十、核糖核酸酶十、核糖核酸酶十、核糖核酸酶十、核糖核酸酶 AA（RNaseARNaseA）RNaseA 来源于牛胰，为内切核酸酶，可特异攻击 RNA DNase 来源于牛胰，是内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链 DNA。DNase 用途广泛，如切口平移标记时在 dsDNA 上随机产生切口；在闭环 DNA 上引入单切口，以将分子截短；建立随机缺失的嵌套缺失体，用于功能分析或测序；除去 RNA 样品中的 DNA。十一、脱氧核糖核酸酶十一、脱氧核糖核酸酶十一、脱氧核糖核酸酶十一、脱氧核糖核酸酶 （DNaseDNase）DNase 来源于牛胰，是内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷酸RNaseH是内切核酸酶，特异性水解与是内切核酸酶，特异性水解与DNA杂杂交的交的RNA上的磷酸二酯键，产生带有上的磷酸二酯键，产生带有3-OH和和5-磷酸末端的产物。磷酸末端的产物。十二、核糖核酸酶十二、核糖核酸酶十二、核糖核酸酶十二、核糖核酸酶 HH（RNaseHRNaseH）RNase H是内切核酸酶，特异性水解与 DNA 杂交的 R十三、十三、十三、十三、DNADNA结合蛋白结合蛋白结合蛋白结合蛋白 单链 DNA 结合蛋白（SSB）RecA 蛋白质 拓扑异构酶 十三、DNA结合蛋白 单链 DNA 结合蛋白（SSB）第五讲-其它工具酶课件