固相膜免疫测定课件

第十二第十二第十二章固相膜免疫测第十二章固相膜免疫测定定第十二第十二章固相膜免疫测定1 随着免疫学技术和相关生物化学技术的发随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上派生出了多种类型的固相膜展，检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫快速检测试验。该类试验的最大特点是免疫快速检测试验。该类试验的最大特点是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。掌握操作要求和判定标准。随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上2第一节第一节 概述概述 标记免疫测定标记免疫测定放射免疫测定放射免疫测定 1960 1960酶免疫测定酶免疫测定 1970 1970荧光免疫测定荧光免疫测定 1980 198019901990化学发光免疫测定化学发光免疫测定 1990 1990膜固相免疫测定膜固相免疫测定 1990 1990第一节 概述 3一、免疫测定分类一、免疫测定分类免疫浊度测定免疫浊度测定Ag+Ab AgAb +AbAg+Ab AgAb +Ab标记免疫测定标记免疫测定 Ag+Ab*Ag Ab*+Ab*Ag+Ab*Ag Ab*+Ab*（B B）（F F）一、免疫测定分类免疫浊度测定4二、免疫测定原理二、免疫测定原理利用抗原抗体反应检测标本中微量物质利用抗原抗体反应检测标本中微量物质抗原抗原+抗体抗体 抗原抗体复合物抗原抗体复合物 Ag+Ab Ag+Ab Ag*AbAg*Ab二、免疫测定原理利用抗原抗体反应检测标本中微量物质5三、固相免疫测定三、固相免疫测定B与与F分离分离 Ab*Ab*Ag+Ag +Ab*Ab Ab三、固相免疫测定B与F分离 Ab*6四、固相膜的特点四、固相膜的特点多孔性多孔性 毛细管作用毛细管作用非共价键高度吸附抗体或抗原非共价键高度吸附抗体或抗原 高度敏感性高度敏感性易于漂洗易于漂洗 操作简便操作简便四、固相膜的特点7五、常用的固相膜五、常用的固相膜玻璃纤维素玻璃纤维素(fiberglass)膜膜尼龙尼龙(nylon)膜膜聚偏氟乙稀聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜膜硝酸纤维素硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜膜五、常用的固相膜玻璃纤维素(fiberglass)膜8六、固相膜的技术要求六、固相膜的技术要求孔径：孔径：0.20.20.6 m0.6 m流速：以流速：以ml/cm2/minml/cm2/min表示表示蛋白质结合力：吸附力很强，以蛋白质结合力：吸附力很强，以g/cmg/cm2 2表示表示均一性均一性六、固相膜的技术要求孔径：0.20.6 m9第二节免疫金标记技术第二节免疫金标记技术 免疫金标记技术免疫金标记技术(Immunogold labelling techique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色称之为免疫金银染色（immunogold silver staining，IGSS）。第二节免疫金标记技术 免疫金标记技术(Immuno10一、胶体金制备一、胶体金制备胶体金胶体金（colloidal gold）的制备一般采用的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（gold solution）。一、胶体金制备胶体金（colloidal gold）的制备11 胶体金的制备及特性胶体金的制备及特性胶体金粒径胶体金粒径1%1%柠檬酸钠加入量柠檬酸钠加入量胶体金特性胶体金特性（nm)nm)（ml)*ml)*呈色呈色lmax(nmlmax(nm)16162.00 2.00 橙色橙色51851824.524.51.50 1.50 橙红色橙红色52252241411.00 1.00 红色红色52552571.571.50.70 0.70 紫色紫色535535*还原还原100 ml0.01%HAuCl4 100 ml0.01%HAuCl4 所需量所需量 胶体金的制备及特性胶体金粒径1%柠檬酸钠加入量胶体金特性（12胶胶 体体 金（金（Colloidal Gold）1560 nm优优 质质劣劣 质质胶 体 金（Colloidal Gold）1560 n13胶体金结合物（胶体金结合物（Conjugate）胶体金结合物（Conjugate）14膜固相免疫测定的特点膜固相免疫测定的特点第三节膜载体免疫测定的种类与第三节膜载体免疫测定的种类与原理原理优点优点不足之处不足之处简便，快速简便，快速敏感度略低，价格略高（与敏感度略低，价格略高（与ELISAELISA比）比）单份测定单份测定精密度较差，质控困难精密度较差，质控困难保存期长（优质试剂）保存期长（优质试剂）稳定性较差（普通试剂）稳定性较差（普通试剂）可测定物范围广（主要为定性试验）可测定物范围广（主要为定性试验）不易制备定量、半定量试剂不易制备定量、半定量试剂感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断妊娠、排卵的诊断妊娠、排卵的诊断肿瘤标志肿瘤标志心肌标志心肌标志滥用药物滥用药物膜固相免疫测定的特点第三节膜载体免疫测定的种类与原理优点不15固相微孔膜测定种类固相微孔膜测定种类斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay,DIGFA)免疫层析试验免疫层析试验（immunochromatography assay,ICA）斑点斑点ELISA(dot enzyme linked immunosorbent assay,Dot-ELISA)酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot,ELISPOT)免疫印迹法免疫印迹法(immunoblotting test,IBT)放射免疫沉淀试验放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)固相微孔膜测定种类斑点金免疫渗滤试验(dot immunog16一、免疫渗滤测定一、免疫渗滤测定(IFA)一、免疫渗滤测定(IFA)17IFA双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原ABIFA双抗体夹心法测抗原AB18IFA结果判断结果判断IFA结果判断19二、免疫层析测定（二、免疫层析测定（ICA）二、免疫层析测定（ICA）20ICA 试剂条试剂条样样品品垫垫结结合合物物垫垫NCNC膜膜吸吸水水垫垫ICA 试剂条样结NC吸21 ICA双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原 ICA双抗体夹心法测抗原22ICA间接法测抗体间接法测抗体ICA间接法测抗体23ICA 结果观察结果观察 阳性阳性阴性阴性无效无效ICA 结果观察 阳性阴性无效24IFA与与ICA的比较的比较IFAIFAICAICA试剂形式试剂形式渗滤装置及附渗滤装置及附加试剂加试剂试剂条试剂条试剂保存试剂保存4 48 68 6个月个月室温一年室温一年操作步骤操作步骤3 35 51 1观察时间观察时间3 min3 min3 320 min20 min阳性反应颜色阳性反应颜色浓度浓度操作结束颜色操作结束颜色不变不变颜色逐渐加深颜色逐渐加深IFA与ICA的比较IFAICA试剂形式渗滤装置及附加试剂试25IFA IFA 穿流（穿流（FLOW THROUGHFLOW THROUGH）ICA ICA 横流（横流（LATERAL FLOWLATERAL FLOW）IFA 26GIFA技术的发展（间接法测抗体）技术的发展（间接法测抗体）阳性阴性固相膜固相膜固相固相抗原抗原待测待测抗体抗体金标记抗人金标记抗人IgGIgG抗体抗体人人IgGIgG固相抗人固相抗人IgGIgG抗体抗体快速检测（渗滤法）原理图快速检测（渗滤法）原理图GIFA技术的发展（间接法测抗体）阳性阴性固相膜固相抗原待测27GIFA技术的发展技术的发展第一代第一代 1988 1988 HIVCHEK HIVCHEK（DuPontDuPont）单点，单点，5 51010分钟，分钟，血清，血清，金标试剂瓶装冻干品金标试剂瓶装冻干品改进抗原改进抗原HIV 1+2HIV 1+2，提高敏，提高敏感度和特异性，缩短反应时感度和特异性，缩短反应时间，减少步骤，样品多样化间，减少步骤，样品多样化 。第八代第八代INSTANTCHEK HIV 1+2INSTANTCHEK HIV 1+22 2点（测试点（测试+控制）控制）金标试剂：单人份、液体金标试剂：单人份、液体样品：样品：血清、血浆、全血、血清、血浆、全血、尿液尿液第九第九 十二代十二代 研制中研制中单一试剂单一试剂GIFA技术的发展第一代 HIVCHEK（DuPont28ICA技术的发展技术的发展19901990年年 ABBOTT ABBOTT公司公司 胶体硒标记胶体硒标记ICAICA Unipath Unipath公司公司 CLEARVIEW CLEARVIEW 立明衣原体立明衣原体 彩色胶乳标记彩色胶乳标记ICAICA ROCHE Cardiac Reader ROCHE Cardiac Reader TnT TnT 定量定量 0.1 0.13 3 ng/mlng/ml 合成合成TnTTnT质控点质控点ICA技术的发展1990年 ABBOTT公司 胶体硒29IFAIFA肌红蛋白肌红蛋白双孔法双孔法 S S：测定孔：测定孔 C C：定量质控：定量质控 100g/L 100g/LIFAIFA微量白蛋白微量白蛋白单孔法单孔法 T T：测定孔：测定孔 C1 C1：定量质控：定量质控 30 30 mg/Lmg/L C2 C2：定量质控：定量质控 200 200 mg/Lmg/L 结果判定：结果判定：（-）30 200 mg/L 200 mg/LICAICA甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFPAFP）参考值：参考值：30 g/L30 g/L肝癌诊断值：肝癌诊断值：400 400 g/Lg/L结果判定：结果判定：（-）30 400 g/L 400 g/LSCTC2 C1测测定定线线对对照照线线半定量测定半定量测定IFAIFAICASCT测对半定量测定30三、斑点酶免疫吸附试验三、斑点酶免疫吸附试验 Dot-ELISA三、斑点酶免疫吸附试验 Dot-ELISA31四、酶联免疫斑点试验四、酶联免疫斑点试验 ELISPOT20世纪世纪80年代，国外的科研工作者根据年代，国外的科研工作者根据ELISA技技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌B细胞和细胞因子分泌细胞和细胞因子分泌T细胞的酶联免疫斑点试细胞的酶联免疫斑点试验验(enzyme linked immunospot,ELISPOT)。四、酶联免疫斑点试验 ELISPOT20世纪80年代，32 ELISPOT 检测原理检测原理 细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT 底物孵育后，底物孵育后，PVDF 孔板出现孔板出现“紫色紫色”的斑点表明细胞产生了细的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过胞因子，通过 CTL 公司生产的公司生产的 ELISPOT 酶联斑点酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。分析系统对斑点的分析后得出结果。ELISPOT 检测原理 细胞受到刺激后局部产生细胞33固相膜免疫测定课件34ELISPOT 分析仪解决以下问题分析仪解决以下问题哪些斑点是抗原特异性哪些斑点是抗原特异性 T 细胞产生的（此斑点具有进细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有有 T 细胞研究价值）细胞研究价值）斑点大小的意义斑点大小的意义 在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸和最小尺寸 如何从单个细胞基础上分析如何从单个细胞基础上分析 实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果？子，在多大程度上会干扰分析结果？几次重复实验才能使结果更有意义？几次重复实验才能使结果更有意义？ELISPOT 分析仪解决以下问题哪些斑点是抗原特异性 T 35ELISAPOTELISAPOT36ELISPOT结果判断结果判断ELISPOT结果判断37五、免疫印迹法五、免疫印迹法Westernblot法法原理原理Westernblot抗原表位可能被破坏而漏检抗原表位可能被破坏而漏检五、免疫印迹法Westernblot法原理Western38六、放射免疫沉淀试验六、放射免疫沉淀试验原理原理放射免疫沉淀试验放射免疫沉淀试验抗原表位不会破坏抗原表位不会破坏六、放射免疫沉淀试验原理放射免疫沉淀试验抗原表位不会破坏39小小 结结 固相膜免疫测定与固相膜免疫测定与ELISA相类似，其特点相类似，其特点是以微孔膜作为固相。固相膜的特点在于其多是以微孔膜作为固相。固相膜的特点在于其多孔性，像滤纸一样，固相膜可被液体穿过流出，孔性，像滤纸一样，固相膜可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行，利用这种性能建立了多种类型的快速检验方法。利用这种性能建立了多种类型的快速检验方法。固相膜免疫测定包括了斑点金免疫渗滤试验、固相膜免疫测定包括了斑点金免疫渗滤试验、免疫层析试验、斑点免疫层析试验、斑点ELISA、酶联免疫斑点试、酶联免疫斑点试验、免疫印迹法、放射免疫沉淀试验。验、免疫印迹法、放射免疫沉淀试验。小 结 固相膜免疫测定与ELISA相40