结核病的实验室诊断分析课件

结核病的实验室诊断结核病的实验室诊断 结核病的实验室诊断 主要内容主要内容 结核病的流行情况 1 结核病的病原学 3 2 结核病的实验室诊断 3 结核病的分子药敏 3 4 主要内容 结核病的流行情况 1 结核病的病原学 3 2 结核1.1.结核病的流行概况结核病的流行概况?全球范围内结核病疫情急剧恶化?人口大规模流动?结核菌耐药现象益发严重?结核病合并艾滋病感染?我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国?结核菌感染率 44.5%?新发活动性结核患者 130万/年?死亡13万/年 1.结核病的流行概况?全球范围内结核病疫情急剧恶化?人口2011 WHO tuberculosis control report 我国是全球27个耐药结核病高负担国家之一 2013年世界卫生组织宣布全球耐多药结核病紧急状态 2011 WHO tuberculosis control 全球的结核病患者全球的结核病患者,在接受治疗在接受治疗之前已经传染给了别人！早期快速诊断与治疗成为制约结核病控制的关键：约结核病控制的关键：有细菌学诊断依据的病人不超过菌学诊断依据的病人不超过50%全球的结核病患者,在接受治疗之前已经传染给了别人！早期当前结核研究的热点?新型抗结核药物(50%)?新型快速诊断技术(40%)?新型结核疫苗(10%)当前结核研究的热点?新型抗结核药物(50%)?新型快速诊 7/45 近期结核病诊断方法的相关研究 JID 2012:205(Suppl 2),S147.7/45 近期结核病诊断方法的相关研究 JID 2012:2.结核病的病原学结核病的病原学?结核分枝杆菌(M.tuberculosis)是引起人类结核病的主要病原体。?1882年由德国医生Koch发现。?结核分枝杆菌属于厚壁门、裂殖菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。?分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型结核分枝杆菌是人类主要的致病菌。2018/6/17 GDTB 8 2.结核病的病原学?结核分枝杆菌(M.tuberculo结核分枝杆菌结核分枝杆菌(M.tuberculosis)生物学主要特点：1.细胞壁中含有大量脂质 2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿 3.抗酸染色阳性 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)生物学主要特点生长特点：生长特点：生长缓慢，繁殖一代在人工培养基内约需要1520小时，在静脉感染未经免疫小鼠肺中约需要15小时，在巨噬细胞内约需要1520小时，在家兔角膜中约需要2022小时。生长特点：生长缓慢，繁殖一代在人工培养基内约需要1520实验室检查方法的历史实验室检查方法的历史 1880s Tubercle bacilli 的发现 Ziehl-Neelsen 染色方法 1900s Mantoux test(TST with tuberculin)1920s Petragnani medium Purified Protein Derivative（PPD）1930s Lewenstein-Jensen 培养基 1940s Dubos agar,Ogawa 培养基 1950s Middlebrook 7H9 1990s NAAT 2000s ELISPOT,QuantiFERON,2010s LPA,GeneXpert 2020s?实验室检查方法的历史 1880s Tubercle baci3.结核病的实验室诊断结核病的实验室诊断 细菌学 涂片：敏感性低 传统固体培养：所需时间长，23月 分子生物学 TB-DNA TB-mRNA 血清/免疫学 IGRA：有望替代TST，但不能区分活动性TB与潜伏感染 血清学：存在抗原纯度和特异性差等方面的问题 液体培养及药敏试验：平均时间20天 3.结核病的实验室诊断 细菌学 涂片：敏感性低 传.细菌学诊断.细菌学诊断 萋尼氏染色 荧光染色 罗氏培养/药敏试验 我国目前最常用的结核病实验室诊断技术我国目前最常用的结核病实验室诊断技术 快培/药敏试验 萋尼氏染色 荧光染色 罗氏培养/药敏试验 我国目前最常用的涂片?干燥?固定 初染 脱色 复染 显微镜检查 登记/报告 显微镜检查 碱性复红 盐酸酒精 亚甲兰 石炭酸金胺O 盐酸酒精 高锰酸钾 光学显微镜检查 荧光显微镜检查 涂片?干燥?固定 初染 脱色 复染 显微镜检查 登萋尼氏染色镜下形态萋尼氏染色镜下形态 萋尼氏染色镜下形态 荧光染色镜下形态 荧光染色镜下形态 LED Fluorescence microscopy LED荧光显微镜 LED Fluorescence microscopy LELED 荧光显微镜?成本低廉的超亮发光二极管?可承受的价格，价格接近于现有的光学显微镜?寿命长（15-20,000小时）?省电?可用电池供能?可靠性更强?不需要空调设施?不需要暗室?诊断性能优于标准荧光显微镜?操作人员工作负荷减轻 LED 荧光显微镜?成本低廉的超亮发光二极管?可承受的价普通荧光显微镜和发光二极管荧光显微镜性能比较（不同实验室的结果进行汇总与平均）显微镜 方法 灵敏度(%)特异度(%)普通荧光显微镜 直接涂片 67.4 96.1 普通荧光显微镜 浓集涂片 66.6 99.2 发光二极管 荧光显微镜 直接涂片 71.6 (p=0.1025)96.4 发光二极管 荧光显微镜 浓集涂片 72.4 (p=0.0073)98.8 普通荧光显微镜和发光二极管荧光显微镜性能比较（不同实验室的结 Bactec?MGIT 960/320 Bact/Alert 3D VERSA TREK 生产厂家 美国BD公司 法国生物 梅里埃公司 美国Trek 诊断公司 仪器定位 专业分枝杆菌检测系统 业内金标准 普通细菌血培养系统 需加装分枝杆菌培养特殊组件 普通细菌血培养系统 需加装分枝杆菌培养特殊组件 单机容量 960个检测位 每年可至少检测8000个样本 240个瓶位 每年可检测2000个样本 528个瓶位 日均标本处理量 2530个 67个 9个 检测原理 荧光增强法：采用敏感性较强的荧光信号探测氧气的变化情况，只需单一反应，所以速度快，准确性高 PH值比色法：值比色法：当培养瓶内有微生物生长，其释放出的CO2，经水饱和后，产生H+，使PH值产生变化，感应器的颜色也随之变化。需双重反应，因此速度较慢，假阳性率较高，此技术已趋向淘汰 压力检测：压力检测：检测细菌生长中各种气体产生和消耗而引起的瓶内压力的变化。灵敏度差。此技术已趋向淘汰 检测技术 瓶外检测技术 瓶外检测技术 瓶内检测技术 易导致污染及生物安全问题 平均阳性报告时间 811天 1521天 不详 药敏试剂 5种一线抗TB药物，全部具有FDA及SFDA认证 无药敏试剂提供 只有3种一线药物 培养/药敏试验 Bactec?MGIT 960/320 Bact/Ale阴性培养 阳性培养 无或微弱荧光 F F FO2 FO2 FO2 FO2 FO2 F FO2 FO2 CO2 O2 O2 O2 O2 O2 O2 O2 O2 CO2 CO2 O2 F F F F FO2 FO2 F F F F CO2 O2 O2 O2 O2 O2 强荧光 传感器 对氧气高度敏感的钌复合物 肉汤 改良Middlebrook 7H9 肉汤 上部空间 已预先充填10%CO2 BACTEC?MGIT?960/320 指示器系统 阴性培养 阳性培养 无或微弱荧光 F F FO2 FO2 FMGIT/3D 制造的液体培养基 优点?比固体培养快(平均 10-12 天 vs.20-24 天)?比固体培养基更敏感?可以自动判读，或使用标准指示管和操作手册进行判读?也加快了药敏试验的速度 局限?需要NALC-NaOH 进行痰处理和离心?普通菌群的污染很常见?比固体培养更经常地检出非结核分枝杆菌（常常不致病）?确定诊断前必须对所有的阳性培养物进行结核分枝杆菌的鉴定?比固体培养基昂贵 MGIT/3D制造的液体培养基 优点?比固体培养快(平血清学诊断 血清学诊断技术优势：是一种对疾病进行早期诊断的理想方法。?无需活细胞培养和特殊仪器设备?操作简便?结果显示快速 目前用于血清学诊断的主要方法:?酶联免疫吸附试验(ELlSA)?斑点金免疫渗滤法(DIGFA)?免疫印迹法(Western Blotting)等等 血清学诊断 血清学诊断技术优势：是一种对疾病进行早期诊断的WHO对来自不同国家的19种试剂盒产品进行评估，结果表明：与痰培养相比，这些试剂盒检测的灵敏度为1%60%，特异度为5399%1。原因：由于所用的测定方法、使用的试剂种类或抗原、抗体的不同等，导致测定结果差异较大，并且缺乏可比性。WHO认为现有的血清学诊断试剂的敏感度和特异度都有待进一步提高，不推荐其作为一种快速诊断的方法在临床使用。1WHO World Health Organization.Diagnosis evaluation series No.2:laboratory-based evalution of 19 commercially available rapid diagnostic tests for tuberculosis.2008.WHO对结核抗体评估对结核抗体评估 WHO对来自不同国家的19种试剂盒产品进行评估，结果表明：与2011年WHO正式公告：由于目前的商业血清学试剂在结核检测中存在较大差异，且检测结果很高比例的假阳性和假阴性，因此不建议使用血清学方法作为结核杆菌的诊断实验1。1WHO Commercial Serodiagnostic Tests for Diagnosis of Tuberculosis.http:/whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241502054_eng.pdf 不能早期诊断！容易漏诊、误诊！血清学检测的评价 2011年WHO正式公告：由于目前的商业血清学试剂在结核检测?结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。?由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。?基于IGRA原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中。?目前应用的进口IGRA主要有两种商品化的试剂：1）澳大利亚Cellestis公司的 Quanti FERON-TB GOLD In Tube（QFT-GIT）2）英国Oxford Immunotec 公司的T-SPOT.TB 蛋白水平分子诊断:-干扰素释放实验（IGRA)?结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次-干扰素释放实验（IGRA）干扰素 检测阴性 干扰素 检测阳性 TB抗原多肽 T细胞 活化T细胞 干扰素 -干扰素释放实验（IGRA）干扰素 检测阴性 干扰T-SPOT?.TB原理 T-SPOT?.TB是以拥有专利的特异抗原（ESAT-6/CFP-10），通过酶联免疫斑点技术（ELISPOT）检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否感染结核杆菌（现症感染）的新方法。结核杆菌特异抗原：?早期分泌抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6，ESAT-6）?培养滤液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10，CFP 10）T-SPOT?.TB原理 T-SPOT?.TB是以拥有专利的结核杆菌特异抗原?由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白?所有的卡介苗（BCG）均丢失该基因序列?绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区 ESAT-6与CFP-10抗原 结核杆菌特异抗原?由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码结核杆菌特异抗原结核杆菌特异抗原 苏氏 海 堪萨斯 戈登 牛 非洲 结核杆菌特异抗原 苏氏 海 堪萨斯 戈登 牛 非洲 T-SPOT?.TB临床性能指标?特异性 只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应 美国FDA数据：特异性 97.1%(297/306)国内临床数据：特异性 94.1%(478/508)?灵敏度 基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率 美国FDA数据：灵敏度 95.6%(175/183)国内临床数据：灵敏度 95.3%(624/655)T-SPOT?.TB临床性能指标?特异性 只针对结核分灵灵 敏敏 度度 Reference Sensitivity Jafari et al 2006 AJRCCM 174;9:1048-53 100.0%(12/12)Ferrara et al Lancet 2006 376;1328-34*83.3%(20/24)Lee et al Eur Respir J 2006 28;24-30*96.6%(84/87)Goletti et al Clin Microbiol Infect 2006 12;6:544-50*91.3%(21/23)Meier et al EJCMID 2005 24;529-536 95.9%(70/73)Kang et al Chest.2007 Sep;132(3):959-65*92.2%(59/64)Janssens et al ERJ 2007 30(4):722-8 98.3%(57/58)Clarke et al Clin Exp Immunol 2007 150(2):238-44.90.0%(27/30)Detjen et al CID 2007 1;45(3):322-8*92.9%(26/28)Ozekinci et al J Int Med Res 2007;35:696-703 92.9%(26/28)Soysal et al IJTLD 2008 12(1):50-56*80.8%(80/99)Dominguez et al Clin Vacc Immunol 2008 15(1);168-71*85.7%(36/42)Chee et al J Clin Microbiol.2008 Apr 9*94.1%(254/270)Vincenti et al Clin Exp Immunol.2007 Oct;150(1):91-8*84.6%(11/13)Wang et al Emerging Infect Dis 2007 13;4:553-8 87.2%(34/39)Losi et al Eur Respir J.2007 Dec;30(6):1173-9 100.0%(10/10)Kim et al Arch Intern Med 167;20:2255-2259 100.0%(22/22)Connell et al PLoS ONE 2008.3;7:e2624*100.0%(9/9)Kobashi et al.Scand J Infect Dis 2008.40;8:629-34*87.5%(42/48)Kobashi et al.J Infect.2008 Epub ahead of print.*90.0%(36/40)Domnguez et al.Diagn Microbiol Infect Dis.2008.*Epub ahead of print 84.2%(32/38)Goletti et al.PLoS ONE.2008.3;10:e3417.*89.9%(62/69)Bosshard et al.Respir Med.2008.Epub ahead of print 98.4%(62/63)Higuchi Med Microbiol Immunol.2008.Epub ahead of print*95.9%(47/49)TOTAL 92.0%(1139/1238)灵 敏 度 Reference Sensitivity 特特 异异 性性 All Studies of Specificity in Subjects in Low Endemicity Settingsn Specificity(100-A)%n Specificity(100-A)%Lalvani et al Am J Respir Crit Care Med 2001;163:824-28?26100.0%Lalvani et al J Infect Dis 2001 183;3:469-7?40100.0%Pathan et al J Immunol 2001;167:5217-5225?32100.0%Chapman et al AIDS 2002 16;2285-93?40100.0%Adams et al Scand J Infect Dis.2008;40(3):196-203.18100.0%Bocchino et al Eur J Clin Mircro Infect Dis(2008)May 10*4989.8%5084.0%Detjen et al Clin Infect Dis 2007 Aug 1;45(3):322-8*4097.5%4057.5%Barsegian et al J Hosp Inf(2008)epub ahead of print 9598.9%9566.3%Clark et al Clin&Exp Immunol 2007 Nov;150(2):238-44 47100.0%Dheda et al AIDS 2005 19;2038-4118100.0%Meier et al EJCMID 2005 24;529-536 11100.0%11100.0%Total:T-SPOT.TB vs.TST head:head studies only 19596.4%19670.9%p value 0.0001Total:T-SPOT.TB only 41698.3%T-SPOT.TBTST特 异 性 All Studies of SpecificiT-SPOT?.TB的实验步骤的实验步骤 用BD CPT 管或Ficoll提取液收集外周血单个核细胞 结核特异抗原（ESAT-6/CFP 10）刺激结核特异的效应T淋巴细胞使其分泌-干扰素 效应T淋巴细胞分泌的-干扰素与膜板预包被的抗-干扰素抗体结合并固定在细胞周围 1个斑点=1个效应T细胞 加入显色液，观察结果 过夜孵育，洗板，加入酶标二抗 T-SPOT?.TB的实验步骤 用BD CPT 管或Fico阴性结果 阳性结果 空白对照 抗原A ESAT-6 抗原B CFP10 阳性对照（PHA）实验效果图 阴性结果 阳性结果 空白对照 抗原A ESAT-6 方法学的优点方法学的优点?检测特异性的提高 帮助临床区分卡介苗接种和环境分枝杆菌感染引起的“假阳性”，避免了临床的无效用药?检测灵敏度的提高 有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的传播与扩散?快速 48小时出结果 方法学的优点?检测特异性的提高 帮助临床区分卡介苗接种和方法学的局限方法学的局限?不能区分活动性TB与潜伏感染?不能够提示临床患者的病变部位，需要结合临不能够提示临床患者的病变部位，需要结合临床的判断?目前还不能够根据斑点数量的多少来判断患者是活动性结核病或是潜伏感染者?检测收费高（800元/次）方法学的局限?不能区分活动性TB与潜伏感染?不能够提示临实验结果的解释?阴性结果 提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。假阴性结果：感染阶段不同；少数免疫系统功能不全/疾病；实验非正常操作。?阳性结果 提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果：4种环境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪萨斯）、M.szulgai（苏氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）实验结果的解释?阴性结果 提示患者体内不存在针对结核杆各国对潜伏感染风险人群的筛查指南 风险人群风险人群 美国指南美国指南 加拿大指南加拿大指南 英国指南 免疫力抑制人群（例如，HIV感染者，使用强的松或TNF-抑制剂治疗）TST或IGRA；如果是阴性或高度怀疑的，TST和IGRA都要检查 TST，如果TST阴性要用IGRA确认 TST或IGRA BCG接种者（如果也属于其它风险人群）推荐用IGRA 没有特定的推荐 TST或IGRA 与传染性肺结核患者密切接触 TST或IGRA TST，用IGRA进一步确认TST阳性 TST，用IGRA进一步确认TST阳性 医务工作者 TST或IGRA 推荐用TST TST或IGRA，视情况而定 无法再来确认TST结果的人群（例如，流浪汉，注射吸毒者或交通不方便）推荐用IGRA 没有特定的推荐 推荐用IGRA 国外出生的人群 只筛查过去5年内移民的人群；TST或者IGRA 只筛查过去2年内小于15岁的移民；TST，用IGRA进一步确认TST阳性 只筛查新移民；TST筛查5至15岁移民，用IGRA进一步确认TST阳性；IGRA筛查16至35岁移民 其它风险人群 TST或IGRA TST，用IGRA进一步确认TST阳性 TST，用IGRA进一步确认TST阳性 各国对潜伏感染风险人群的筛查指南 风险人群 美国指南 加拿大样本量为样本量为26 680 调查者的调查者的15个多中心研究显示个多中心研究显示,在在4年的随访中年的随访中,IGRA-阳阳性的个体中发病数为448 例/1000人/每年.2011年9月的研究结果提示，IGRA-阴性对于儿童（小于5岁）不能排除结核病(Pediatr.Infect.Dis.J.30,817818,2011).Childhood tuberculosis treatment remains imprecise scienceNature MedicineVolume:17,Page:116011 October 2011.样本量为26 680 调查者的15个多中心研究显示,在4年的TB-DNA检测：1.能稳定检测10copy的TB-DNA，灵敏度高，特异性强。2.早期、快速、准确地诊断结核病。痰液、肺及支气管灌洗液肺结核 血液播散性结核和各脏器的结核病 脑脊液中枢神经系统结核病 宫颈拭子、尿道拭子泌尿生殖道结核病 3.荧光定量PCR检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法。4.TB-DNA浓度可用于判断疗效：痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势，TB-DNA拷贝数下降。根据病原体DNA浓度，对药物治疗及疗效观察提供参考依据。分子生物学诊断分子生物学诊断 TB-DNA检测：1.能稳定检测10copy的TB-DReal-time PCR Real-time PCR 环介导等温扩增法(LAMP)的技术特点是针对靶基因的6个区域设计4 条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63-65)下保温3060分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR 相比，不需要模 板的热变性、温 度循环、电泳及 紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强的特点。环介导恒温扩增（环介导恒温扩增（LAMP）技术）技术 环介导等温扩增法(LAMP)的技术特点是针对靶基因的2小时全过程 目测法检测流程2小时全过程 目测法检测流程 检测方法说明检测方法说明 结果判断 在阴性对照反应管液体颜色呈橙色，阳性对照反应管液体颜色呈在阴性对照反应管液体颜色呈橙色，阳性对照反应管液体颜色呈绿色的条件下：?若待检样本反应管中液体颜色呈绿色，则可报告该样本检测结果为结核分枝杆菌阳性；?若待检样本反应管中液体颜色呈橙色，则可报告该样本检测结果为结核分枝杆菌阴性；?若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。检测方法说明 结果判断 在阴性对照反应管液体颜色RNA作为临床分子诊断靶标的优点：?RNA 拷贝数 DNA拷贝数?更具临床意义:生命力旺盛的病原体RNA转录活跃?RNA远不如DNA稳定?病原体死亡，RNA很快降解 1.交叉污染少 2.较好的愈后指标 结核杆菌RNA(TB-RNA)RNA作为临床分子诊断靶标的优点：?RNA 拷贝数 DNSAT技术原理技术原理 SAT技术原理 操作过程操作过程 操作过程 4.结核病的分子药敏结核病的分子药敏 HAIN 技术 DNA?STRIP?T-spot -Xpert MTB/RIF DNA微阵芯片 探针熔解曲线技术 4.结核病的分子药敏 HAIN 技术 DNA?STRIP?药物 药物作用机制 参与基因 编 码 酶 作 用 突变频率（%）INH 氧自由基对DNA，脂质等多效应 Kat G 触酶-过氧化物酶 活化原药 4258 INH对NADH竞争性 INH-NADH加成物抑制分支菌酸合成 代偿katG功能 inhA kasA ahpC ndh nat glf 烯酰基载体蛋白还原酶 酮酰基蛋白合成酶 烷基氢过氧化物酶 NADH脱氢酶 芳香胺乙酰转移酶 吡喃半乳糖变位酶 分支菌酸代谢靶酶 靶酶？靶酶？NAD+减少 乙酰化失活INH 靶酶？2134 1015 耐药标记物 RFP 抑制信使RNA转录 rpoB RNA多聚酶 靶酶 96100 PZA 酸化胞浆，失活酶活性 抑制脂肪酸代谢？替代烟酰胺掺入NAD 抑制膜转运功能 pncA FasI 吡嗪酰胺酶 Fas I？活化原药 靶酶？7297 EMB 阿拉伯半乳聚糖合成抑制 阿拉伯呋喃糖累积 脂阿拉伯甘露聚糖合成抑制 embCAB embB 阿糖转移酶 靶酶 4765 SM 肽链翻译错误 rpsL rrs 核糖体30S亚基S12蛋白 核糖体16SrRNA 靶位 靶位 5259 821 AK/KM OFx 肽链翻译错误 抑制DNA回旋酶 rrs gyrA 核糖体16SrRNA DNA回旋酶A亚基 靶位 靶酶 7594 Cs 抑制肽聚糖合成 ulrA/dadB D-丙氨酸合成酶 靶酶 药物 药物作用机制 参与基因 编 码 酶 作 用 原理：采用线性探针技术（LiPA），扩增后的产物与预先固化在膜上的特异性探针杂交，通过显色反应判断结果。检测标本：?涂阳痰标本/TB-DNA阳性标本?固体或液体培养菌株 Hain 技术技术 原理：采用线性探针技术（LiPA），扩增后的产物与预先固化GT-Blot 48自动杂交仪1台 所需设备：所需设备：GTQ PCR 96扩增仪1台 Mikro 220 离心机1台 恒温器1台 超声波振荡仪1台 GT-Blot 48自动杂交仪1台 所需设备：GTQ PTARGET 靶基因 菌种鉴定 16SrRNA IS6110 异烟肼 katG、inhA、ahpC、oxyR、KasA、ndh 利福平 rpoB 乙胺丁醇 embB 吡嗪酰胺 pncA 链霉素 rpsL、rrs 喹诺酮类药物 gyrA、gyrB TARGET 靶基因 菌种鉴定 16SrRNA IS6110MTBDRplus 方法方法?原理：PCR扩增检测rpoB、katG和inhA基因突变位点，诊断RFP和INH耐药。MTBDRplus 方法?原理：PCR扩增检测rpoB、krpoB 野生型探针:WT1-WT8 rpoB 耐药突变探针:MUT1-3:D516V,H526Y,H526D,S531L 通过缺失的野生型信号进行突变探测 通过出现的突变信号进行突变探测 MTBDRplus rpoB 511 513 516 518 522 526 531 533 rpoB WT2 rpoB WT4 rpoB WT6 rpoB WT8 rpoB WT7 rpoB M UT1(D516V)rpoB MUT3(S531L)rpoB M UT2A(H526Y)rpoB M UT2B(H526D)514 515 rpoB WT1 rpoB WT3 rpoB WT5 509 508 505 rpoB 野生型探针:WT1-WT8 rpoB 耐药突MTBDRplus 操作流程操作流程 1)DNA提取 用NALC/NaOH 处理痰标本 2)PCR扩增 3)杂交 扩增产物和固化在 膜上的特异性探针杂交 4)结果判读 MTBDRplus 操作流程 1)DNA提取 用NALC/NMTBDRplus 反应条带(示范)MTBDRplus 反应条带(示范)Bandelette MTBDR?(Hain Lifescience)鉴定结核菌 利福平 rpoB INH katG 315 Bandelette MTBDR?(Hain Lifesc药物 GenoType MTBDRplus结果 比例法药敏结果 耐药 敏感 INH 耐药 45 0 敏感 7 16 灵敏度：86.5%(45/52)特异度：100%(16/16)符合率：89.7%(61/68)菌株标本 GenoType MTBDRplus 方法与比例法药敏试验结果比较 药物 GenoType MTBDRplus结果 比例法药敏结药物 GenoType MTBDRplus结果 比例法药敏结果 耐药 敏感 RFP 耐药 48 0 敏感 1 16 灵敏度：98.0%(48/49)特异度：100%(16/16)符合率：98.5%(64/65)菌株标本 GenoType MTBDRplus 方法与比例法药敏试验结果比较 药物 GenoType MTBDRplus结果 比例法药敏结痰标本（涂片阳性）痰标本（涂片阳性）GenoType MTBDRplus方方法与比例法药敏试验结果比较法与比例法药敏试验结果比较 药物 GenoType MTB DRplus结果 比例法药敏结果 耐药 敏感 INH 耐药 63 0 敏感 1 129 灵敏度：98.4%(63/64)特异度：100%(129/129)符合率：99.5%(192/193)痰标本（涂片阳性）GenoType MTBDRplus方法与痰标本（涂片阳性）痰标本（涂片阳性）GenoType MTBDRplus方法与比例法药敏试验结果比较方法与比例法药敏试验结果比较 药物 GenoType MTBDR plus结果 比例法药敏结果 耐药 敏感 RFP 耐药 39 12 敏感 2 140 灵敏度：95.1%(39/41)特异度：92.1%(140/152)符合率：92.7%(179/193)痰标本（涂片阳性）GenoType MTBDRplus方法与优点：?Hain 技术可以快速检测RFP和INH的耐药?时间短、操作简单、安全高?特异性和灵敏度较高、重复性好?主观因素影响小、更为可靠 优点：?Hain 技术可以快速检测RFP和INH的耐药?缺点缺点:?需要专门设备；?未发现所有的耐药突变位点，不能检测所有药物的耐药基因型；?MTBDR plus 试剂盒的检测试纸条，缺少ahpC-oxyR 间隔序列范围，否则可进一步提高INH耐药检测的敏感性；?不能取代传统细菌学检测、只能作为参考。缺点:?需要专门设备；?未发现所有的耐药突变位点，不能检?进行标本处理、实时PCR和利福平耐药性检测的完整平台?此平台由FIND和Cepheid（一个加州公司）所开发?痰标本可以直接放入模块中，而无需与任何试剂进行混合处理?GeneXpert 设备可进行标本液化、去污染、富集、DNA提取、rpoB实时扩增、应用分子灯塔检测耐药相关的突变?该系统非常容易使用，不需要进行分子生物学培训?该检测方法另外一个特点是操作完全自动化，使用起来既容易又安全。.Xpert MTB/RIF?进行标本处理、实时PCR和利福平耐药性检测的完整平台?此?设计五个重叠的分子信标，检测81碱基 rpoB核心区域所有可能的突变?用不同的荧光基团标记每个分子信标，使仅在一个反应中完成整个检测成为可能?探针能检测野生型菌株（RIF-敏感人群）；ropB突变造成特定信标的信号丢失（RIF-耐受人群）?每个探针必须：能检测野生型菌株；不能检测Rif耐药突变菌株，不能检测出非TB分枝杆菌.Xpert MTB/RIF 的引物设计?设计五个重叠的分子信标，检测81碱基 rpoB核心区域所有Xpert MTB/RIF Xpert MTB/RIF 结核病的实验室诊断分析课件Xpert MTB/RIF 与 Hain的比较：?只能做TB-DNA和利福平耐药基因；?只能通过8个缺失的野生型信号进行突变检测，不能探检测出现的突变信号；?样本通量少(4个/次）；?所需样本量大（1mL/次）；?仪器断电后只能重新开始；Hain有记忆功能。?维护：刚进入中国市场，故障后只能返厂修理，费用昂贵。Xpert MTB/RIF 与 Hain的比较：?只能做.DNA微阵芯片?基本原理：与Southern、Northern 是一致的，都是应用已知核酸序列作为探针固定在玻璃等基片上，然后与待测样品的DNA或RNA互补的靶核苷酸序列杂交，从而获得待测样品的信息而获得待测样品的信息.DNA微阵芯片?基本原理：与Southern、Nor基因芯片的检测过程基因芯片的检测过程 基因芯片的检测过程 结核耐药快速检测基因芯片73?结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（DNA微阵列芯片法）基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核分枝杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）?通量：两种一线抗结核药物、8个突变位点?速度：6小时versus传统48周?灵敏度：103CFU/反应?特异性：防污染体系；对照设计严谨；自动判读利福平耐药 利福平敏感 结核耐药检测基因芯片 软件判读激光共焦扫描仪 样品制备仪杂交仪发表文章：TheInternationalJournalofTuberculosisandLungDisease.2009,13(7):914 920.发明专利：申请号：200810105172.X。授权公告号：CN101285062B。结核耐药快速检测基因芯片 73?结核分枝杆菌耐药基因检测试1.晶芯?分枝杆菌核酸检测试剂盒 2.晶芯?十七种分枝杆菌菌种鉴定试剂盒 3.晶芯?分枝杆菌耐药检测试剂盒 4.晶芯?九项遗传性耳聋基因检测试剂盒 DNA微阵芯片微阵芯片 1.晶芯?分枝杆菌核酸检测试剂盒 2.晶芯?十七种分枝杆菌菌.探针熔解曲线技术 .探针熔解曲线技术 检测结果判断检测结果判断 检测结果判断 Sputum 涂片 培养孵育8周（阳性）药敏试验观察 孵 育4周观察生长情况 涂片/TB-DNA/TB-RNA （阳性）分子诊断/药敏技术 液体培养及药敏试验 平均时间2-3个月 平均时间 20天 只需1-2天 小小 结结 Sputum 涂片 培养孵育8周（阳性）药敏试验感 谢 聆 听！感 谢 聆 听！