第1讲细胞因子与细胞粘附因子的测定课件

第一讲第一讲 细胞因子与细胞粘细胞因子与细胞粘 附因子的测定附因子的测定任春锋任春锋第一讲 细胞因子与细胞粘1第一节生物学测定方法第一节生物学测定方法 一、促进细胞增殖和抑制细胞增殖测定法一、促进细胞增殖和抑制细胞增殖测定法 二、细胞毒活性测定法二、细胞毒活性测定法 三、抗病毒活性测定法三、抗病毒活性测定法 四、趋化活性测定法四、趋化活性测定法 五、生物学活性测定方法学评价五、生物学活性测定方法学评价第二节第二节 免疫测定方法免疫测定方法 一、一、ELISAELISA方法方法 二、流式细胞分析法二、流式细胞分析法 三、酶联免疫斑点试验三、酶联免疫斑点试验 四、免疫学测定方法学评价四、免疫学测定方法学评价第一节生物学测定方法第二节 免疫测定方法2第三节第三节 分子生物学检测方法分子生物学检测方法 一、一、NorthernNorthern和和Southern BlotSouthern Blot 二、二、PCRPCR和和RT-PCRRT-PCR 三、原位杂交、原位三、原位杂交、原位PCRPCR和原位和原位RT-PCRRT-PCR第四节第四节 细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用 一、临床应用原则一、临床应用原则 二、特定疾病诊断的辅助指标二、特定疾病诊断的辅助指标 三、评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后三、评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后第三节 分子生物学检测方法3 是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌的活性物质，其主要生物学功能是介导和调节免疫的活性物质，其主要生物学功能是介导和调节免疫应答及炎症反应，其化学本质是蛋白质或多肽。应答及炎症反应，其化学本质是蛋白质或多肽。细胞因子细胞因子细胞粘附因子细胞粘附因子 是介导细胞间及细胞与细胞外基质间粘附作用是介导细胞间及细胞与细胞外基质间粘附作用的分子，其化学本质为糖蛋白，可以细胞膜表面表的分子，其化学本质为糖蛋白，可以细胞膜表面表达和可溶性两种形式存在。达和可溶性两种形式存在。是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌的活性物质，4细胞因子的主要生物学作用细胞因子的主要生物学作用1、抗感染和抗肿瘤2、免疫调节作用3、刺激造血细胞增殖分化4、参与和调节炎症反应5、其它细胞因子的主要生物学作用1、抗感染和抗肿瘤5细胞因子以生物学作用进行划分的分类细胞因子以生物学作用进行划分的分类白细胞介素（Interleukin）IL-1、IL-2、IL-18干扰素（Interferon）IFN-、IFN-、IFN-肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor）TNF-、TNF-集落刺激因子（Colony-stimulating factor）M-CSF、G-CSF转化生长因子（Transforming growth factor）TGF-趋化因子（Chemokine）IL-8、GROs、MCP-1生长因子（Growth factor）EGF、FGF、IGF、PDGF细胞因子以生物学作用进行划分的分类白细胞介素（Interle61、分泌特点：自分泌、旁分泌、内分泌性2、多源与同源性3、高效性4、多效性（pleiotropy）5、重叠性（redundancy）6、协同性7、拮抗性8、网络性细胞因子的作用特点细胞因子的作用特点1、分泌特点：自分泌、旁分泌、内分泌性细胞因子的作用特点7自分泌自分泌 autocrine内分泌内分泌 endocrine血液循环血液循环远距离作用远距离作用旁分泌旁分泌 paracrine作用于比邻作用于比邻细胞细胞作用于分泌细胞作用于分泌细胞自身自身细胞因子分泌的方式细胞因子分泌的方式自分泌 autocrine内分泌 endocrine血液8肥大细胞肥大细胞胸腺细胞胸腺细胞BIL-4 多效性多效性pleiotropy活化、活化、增殖、增殖、分化分化增殖增殖增殖增殖肥大细胞胸腺细胞BIL-4 多效性活化、增殖、分化增殖增殖10IL-2、IL-4、IL-5IL-4 +IL-5B细胞细胞IL-4IFN-g g 拮抗性拮抗性antagonism 重叠性重叠性redundancy协同性协同性synergy均有刺激均有刺激B细胞细胞增殖的功能增殖的功能更有效地诱导更有效地诱导IgE类别转换类别转换IFN-g g 阻断阻断IL-4诱诱导导类别转化的作用，类别转化的作用，IL-4抑制抑制IFN-g g BBBIL-2、IL-4、IL-5IL-4 +IL-511细胞因子检测的方法细胞因子检测的方法免疫学检测方法抗原性检测细胞生物学检测方法生物活性检测分子生物学检测方法基因表达检测细胞因子检测的方法免疫学检测方法抗原性检测131、粘蛋白样家族（integrin family）2、免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily,IgSF)3、选择素家族（selectin family）4、整合素家族（Integrin family）5、钙离子依赖性家族（简称钙粘素Cadherin）6、其它未归类的粘附分子如CD36、CD44、CD45等 粘附因子以结构特点进行划分的分类粘附因子以结构特点进行划分的分类1、粘蛋白样家族（integrin family）粘附因子以14粘附因子功能及应用：主要功能是调节细胞与细胞、细胞与间质之间的相互作用。病理情况下，由于粘附因子在细胞表面或血循环中的数量和质量有所改变，进而影响原有细胞与细胞、细胞与间质之间的平衡，因此，细胞内外粘附因子的测定对于某些疾病的发生发展机制探讨、辅助诊断、治疗监控及预后方面有重要应用价值。粘附因子功能及应用：主要功能是调节细胞与细胞、细胞与间质之间15第一节第一节 生物学测定方法生物学测定方法第一节 生物学测定方法16根据细胞因子根据细胞因子特定的生物学活性特定的生物学活性,应用相应的靶细胞应用相应的靶细胞指示系统指示系统,同时与标准品对比测定同时与标准品对比测定,从而得知样品中从而得知样品中细胞因子的活性水平细胞因子的活性水平,一般以活性单位一般以活性单位(U/ml)(U/ml)表示表示生物活性测定法原理生物活性测定法原理有助于细胞因子有助于细胞因子检测的活性作用检测的活性作用刺激细胞增殖或集落形成的活性维刺激细胞增殖或集落形成的活性维持细胞生长和存活的特性持细胞生长和存活的特性抑制细胞生长或破坏细胞的效应促抑制细胞生长或破坏细胞的效应促进细胞趋化或抗病毒作用进细胞趋化或抗病毒作用根据细胞因子特定的生物学活性,应用相应的靶细胞指示系统,同时17是最常用的细胞因子生物活性测定方法：以细胞因以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过观察特定的子依赖性细胞株为靶向，通过观察特定的细胞因子刺激或抑制依赖性细胞株增殖来细胞因子刺激或抑制依赖性细胞株增殖来评估细胞因子的活性水平。评估细胞因子的活性水平。一、促进细胞增殖和增殖抑制测定法一、促进细胞增殖和增殖抑制测定法是最常用的细胞因子生物活性测定方法：以细胞因子依赖性细胞株为18直接计数法直接计数法 简便、直观简便、直观,但费时、主观因素影响大、难但费时、主观因素影响大、难以标准化和自动化，不适用大量标本检测，因此以标准化和自动化，不适用大量标本检测，因此常用其他间接指示细胞增殖的方法检测常用其他间接指示细胞增殖的方法检测 细胞代谢活性测定方法细胞代谢活性测定方法 3 3H-TdRH-TdR、125125I-UdRI-UdR掺入法或掺入法或MTTMTT等比色法等比色法细胞代谢产物测定法细胞代谢产物测定法 代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表面标代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表面标记或可溶性分子测定法记或可溶性分子测定法细胞增殖检测方法分类细胞增殖检测方法分类直接计数法 细胞增殖检测方法分类19 原理：原理：通过检测细胞通过检测细胞DNADNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在细胞的增殖过程中，在细胞的增殖过程中，DNADNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（3 3H/H/125125I I），通过检），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。结果客观易于自动化；结果客观易于自动化；适用于大标本量的测定适用于大标本量的测定 方法的特异性受依赖细胞方法的特异性受依赖细胞株影响；放射性污染株影响；放射性污染(1)(1)放射性核素掺入法放射性核素掺入法 原理：通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖20常见细胞因子常见细胞因子3 3H-TdRH-TdR掺入检测法所需细胞及参考试验条件掺入检测法所需细胞及参考试验条件细细 胞胞 株株所需浓度所需浓度（细胞数（细胞数/ml/ml）3 3H-TdRH-TdR前培养时间前培养时间3 3H-TdRH-TdR后培养时间后培养时间检测细胞因子检测细胞因子D10G4.1D10G4.12102105 5484818-2018-20IL-1IL-1L929L9292102105 556561616IL-1IL-1CTLL-2CTLL-210105 524244-64-6IL-2IL-2FDC-P1,32DCL-27FDC-P1,32DCL-275105104 424244-84-8IL-3IL-3CT.4SCT.4S10105 524244-64-6IL-4IL-4CH12CH125105103 348486 6IL-5IL-5B13B135105104 436361212IL-5IL-5T88-MT88-M1101105 524241212IL-5IL-5BCL1BCL110105 572726 6IL-5IL-5Clone-K,IN/2bxClone-K,IN/2bx10105 524244-64-6IL-7IL-7TS1TS13103104 466666 6IL-9IL-9T10T1010105 572726 6IL-11IL-11UT-7UT-71.5101.5105 572726 6SCFSCF（干细胞因子）（干细胞因子）CCL-64*CCL-64*5105108 872728 8TGF-TGF-DA3.15,IFDA3.15,IF5105104 424244-84-8GM-CSFGM-CSFM14/NES60.4M14/NES60.45105104 424244-84-8M-CSF/G-CSFM-CSF/G-CSF常见细胞因子3H-TdR掺入检测法所需细胞及参考试验条件细 21 原理：一种不使用放射性核素，以细胞代谢作为细胞增殖指示物的细胞因子生物活性间接测定方法。MTT在活细胞线粒体中的在脱氢酶的作用下，被还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，其量与细胞增殖的程度呈正比。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。(2)MTT 比色法比色法 原理：一种不使用放射性核素，以细胞代谢作为细胞增22特点：不使用放射性核素，特点：不使用放射性核素，以细胞代谢变化为增殖指征以细胞代谢变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关 测定步骤类似测定步骤类似与同位素掺入法相比与同位素掺入法相比掺入物：掺入物：MTTMTT而非而非3 3H-TdRH-TdR；反应条件：选用的细胞及其浓度、反应条件：选用的细胞及其浓度、培养时间不同培养时间不同(2)MTT(2)MTT 比色法比色法特点：不使用放射性核素，测定步骤类似相同点不同点与同位素掺入23细胞株细胞株/原代细胞原代细胞细胞终浓度（细胞数细胞终浓度（细胞数/ml/ml）加入加入MTTMTT前温育时间（前温育时间（h h）检测细胞因子检测细胞因子B9B9，MH60,BSF2,TTD1MH60,BSF2,TTD15105104 4/210/2105 596/4896/48IL-6IL-6B9-11B9-115105104 49696IL-11IL-11B9-1-3B9-1-35105104 49696IL-13IL-13KYM-1D4KYM-1D42102103 37272MV-3D9MV-3D95105103 3120120TGF-TGF-WEHI-164/clone13WEHI-164/clone132102103 37272TNFTNF32D/Mp110S32D/Mp110S1101103 34444L929L9292102105 55656TNFTNFCTLL-2CTLL-210105 522-2422-24IL-2IL-2小鼠基质细胞小鼠基质细胞,32DCL-27,32DCL-271.5101.5105 57272IL-3IL-3细胞增殖或抑制活性检测的细胞增殖或抑制活性检测的MTTMTT比色法常用靶细胞比色法常用靶细胞细胞株/原代细胞细胞终浓度（细胞数/ml）加入MTT前温育时24 对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡。因此，对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡。因此，待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。试验时，与细胞增殖或抑制作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。试验时，与细胞增殖或抑制方法一样，以已知活性的细胞因子标准品为对照。死、活细胞情况可用同位素方法一样，以已知活性的细胞因子标准品为对照。死、活细胞情况可用同位素5151CrCr释放法判断，或应用台盼兰染色死细胞后直接计数。也可通过结晶紫、萘酚蓝黑、释放法判断，或应用台盼兰染色死细胞后直接计数。也可通过结晶紫、萘酚蓝黑、MTTMTT、NBBNBB等着染活细胞，再用脱色液脱出染料后酶标仪比色测定吸光值。死细胞数、等着染活细胞，再用脱色液脱出染料后酶标仪比色测定吸光值。死细胞数、5151CrCr释放量越高或比色测定的吸光值越低，表明待测细胞因子的细胞毒活性则越高。释放量越高或比色测定的吸光值越低，表明待测细胞因子的细胞毒活性则越高。应用系列稀释的细胞因子标准品，制作其活性与剂量关系的标准曲线，以此作为待应用系列稀释的细胞因子标准品，制作其活性与剂量关系的标准曲线，以此作为待测品活性的定量测定的基础。测品活性的定量测定的基础。本法常用于本法常用于TNFTNF等的测定等的测定二、细胞毒活性测定法二、细胞毒活性测定法基本原理基本原理 对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导25本法本法常用于常用于IFNIFN测定测定，IFNIFN可诱导细胞产生抑制病毒可诱导细胞产生抑制病毒RNARNA和和DNADNA合成的酶，保护细胞合成的酶，保护细胞不受病毒感染，抑制病毒产生细胞病变效应（不受病毒感染，抑制病毒产生细胞病变效应（CPECPE）。）。细胞因子样品处理易感细胞，使细胞建立抗病毒状态，然后用适量病毒攻击细胞，评价病毒的复制量或病毒引起细胞病变被抑制的程度，即可判断样品中细胞因子的生物活性。三、抗病毒活性测定法三、抗病毒活性测定法常用于检测抗病毒活性的细胞株常用于检测抗病毒活性的细胞株常用于攻击细胞的病毒常用于攻击细胞的病毒检测抗病毒活性的方法检测抗病毒活性的方法抑制病毒的致细胞病变效应抑制病毒的致细胞病变效应(CPE)、抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量VSV、EMCV及及Sindbis virus等等Wish、Hep2/c 人干扰素人干扰素L929 小鼠干扰素小鼠干扰素Ratec 大鼠干扰素大鼠干扰素A549MDBK 多种族的多种族的IFN-和和IFN-本法常用于IFN测定，IFN可诱导细胞产生抑制病毒RNA和D26细胞病变程度分为细胞病变程度分为5 5个等级，个等级，即：即：“0”“0”，表示无明显，表示无明显CPECPE；“1+”“1+”，CPE25CPE25；“2+”“2+”，CPECPE为为25255050；“3+”“3+”，CPECPE为为50507575；“4+”“4+”，CPECPE为为7575100100。根据病变程度找出根据病变程度找出CPEI50CPEI50的标的标本稀释范围，并以此计算出距本稀释范围，并以此计算出距离比例和确定离比例和确定IFNIFN效价。效价。该法操作复杂、影响因素较该法操作复杂、影响因素较多，在试验前应对所用的病毒多，在试验前应对所用的病毒进行滴定。进行滴定。标本稀释度log4两孔平均CPE细胞病变抑制程度细胞病变抑制积累细胞病变积累细胞病变抑制率30416016/16(100%)40412012/12(100%)504808/8(100%)61.52.541.54/5.5(73%)72.51.51.541.5/5.5(27%)800080/8(0%)细胞病变抑制法结果判断举例细胞病变抑制法结果判断举例*结果：结果：CPEI50CPEI50稀释度介于稀释度介于4-6-4-74-6-4-7之间，距离比例为之间，距离比例为(73-50)/(73-(73-50)/(73-27)=0.5027)=0.50，效价为，效价为46.546.5；同法计算；同法计算IFNIFN标准品的标准品的CPEI50CPEI50稀释度，将稀释度，将IFNIFN效价换算成国际单位，效价换算成国际单位，IFNIFN国际单位国际单位=样品样品CPEL50CPEL50的稀释度的稀释度/标准品标准品CPEI50CPEI50稀释度稀释度标准品的单位。标准品的单位。细胞病变程度分为5个等级，即：标本稀释度log4两孔平均C27本法主要用于测定趋化因子和本法主要用于测定趋化因子和IL-8IL-8的生物活性测定。的生物活性测定。趋化性趋化性(chemotaxis)(chemotaxis)：诱导细胞向由诱导细胞向由趋化因子低浓度出向趋化因子低浓度出向趋化因子高浓度处作定向趋化因子高浓度处作定向移动的特性移动的特性,可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验。可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验。化学增活性化学增活性(chemokinesis)(chemokinesis)：细胞因子增强细胞的随机运动能力的特性细胞因子增强细胞的随机运动能力的特性,可采用琼脂糖可采用琼脂糖小滴化学动力学试验检测。小滴化学动力学试验检测。趋化因子诱导细胞移动的方式趋化因子诱导细胞移动的方式四、趋化活性测定法四、趋化活性测定法本法主要用于测定趋化因子和IL-8的生物活性测定。趋化因子诱28滤膜：计数受趋化细胞趋化因子靶细胞趋化试验原理示意趋化试验原理示意滤膜：计数受趋化细胞趋化因子靶细胞趋化试验原理示意29各类细胞因子检测的常用靶细胞各类细胞因子检测的常用靶细胞-1细胞因子 实验系统 干扰因素IL-1 D10（M）增殖法 IL-2、IL-4 EL-4（M）增殖法 IL-4 A352（H）增殖抑制法IL-2 CTLL（M）增殖法 IL-4IL-3 KG-1（H）增殖法 TF-1（H）增殖法 GN-CSF、IL-5 IL-6、EPOIL-4 CTLL（M）增殖法 IL-2IL-5 BCL-1（M）增殖法 IL-4各类细胞因子检测的常用靶细胞-1细胞因子 30各类细胞因子检测的常用靶细胞各类细胞因子检测的常用靶细胞-2细胞因子 实验系统 干扰因素IL-6 B9（M）增殖法 IL-4、IL-11 BM60（H）增殖法 IL-7 Clone-IXN/2b（M）增殖法 IL-8 中性粒细胞（M、H）趋化法GM-CSF TF-1（H）增殖法 IL-3、IL-5 IL-6、IL-5TNF/L929（M、H）细胞毒法IFN wish（H）病变保护法 IFN-、IFN-L929（M）病变保护法 IFN-、IFN-各类细胞因子检测的常用靶细胞-2细胞因子 31五、生物学活性测定方法学评价五、生物学活性测定方法学评价优点优点生物学活性的测定生物学活性的测定灵敏度高灵敏度高缺点缺点特异性差特异性差操作繁琐操作繁琐易受干扰易受干扰五、生物学活性测定方法学评价优点32第二节第二节 免疫学测定法免疫学测定法 细胞因子细胞因子(或受体或受体)与相应的特异性抗体与相应的特异性抗体(单克隆抗体或多克隆抗体单克隆抗体或多克隆抗体)结合，通过同位素、结合，通过同位素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示，荧光或酶等标记技术加以放大和显示，从而从而定性或定量显示细胞因子定性或定量显示细胞因子(或受体或受体)的水平。的水平。第二节 免疫学测定法 细胞因子(或受体)与相应的特异性33根据抗体性质和特异性不同，夹心法根据抗体性质和特异性不同，夹心法ELISAELISA可分为：可分为：1.PcAb1.PcAb与与McAbMcAb夹心法夹心法2.McAb2.McAb与与PcAbPcAb夹心法夹心法 3.3.双双McAbMcAb夹心法夹心法4.4.细胞、细胞、McAbMcAb夹心法夹心法一、一、ELISAELISA方法方法ELISA法是应用最为广泛的非均相酶标免疫分析技术，一步或多步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成ELISA的基本步骤，可作定性或定量分析。ELISA法不仅可以用于可溶性细胞因子检测，也可用于可溶性细胞因子受体或可溶性粘附因子的测定。通常采用双抗体夹心法通常采用双抗体夹心法 根据抗体性质和特异性不同，夹心法ELISA可分为：一、ELI34敏感性偏低敏感性偏低不能判断细胞因子的生物学活性。不能判断细胞因子的生物学活性。ELISAELISA特异、简便特异、简便易于推广和标准化等优点易于推广和标准化等优点可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理细胞因子测定的首选方法细胞因子测定的首选方法敏感性偏低ELISA特异、简便优点缺点35二、流式细胞分析法二、流式细胞分析法 流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测，精确判断不同细胞亚群细胞因子和膜分子的细胞因子或粘附因子的检测，精确判断不同细胞亚群细胞因子和膜分子的表达情况。的表达情况。1 1分离和培养靶细胞分离和培养靶细胞2 2细胞固定细胞固定 3 3封闭非特异性结合位点封闭非特异性结合位点 4 4加入特异的荧光素标记抗体加入特异的荧光素标记抗体5.5.用流式细胞仪测定用流式细胞仪测定基本步骤基本步骤二、流式细胞分析法 流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色36活化剂第第1步中：分离和培养靶细胞步中：分离和培养靶细胞培养靶细胞需要活化剂与靶细胞一起培养使其活化T细胞活化剂：抗原、植物血凝素（A）、离子霉素、抗T细胞受体抗体、抗CD3抗体B细胞活化剂：抗原、脂多糖（LPS）、金黄色葡萄球菌内毒素A受体、B细胞受体抗体单核细胞活化剂：脂多糖（LPS）、某些细胞因子。为增强靶细胞活化，上述活化剂可以共用。活化剂第1步中：分离和培养靶细胞37使用流式细胞分析法，可以：使用流式细胞分析法，可以：区分不同分泌特性的细胞亚群：区分不同分泌特性的细胞亚群：Th1 Th1细胞细胞 IFN-IFN-Th2 Th2细胞细胞 IL-4 IL-4细胞表面的粘附分子或细胞因子受体：细胞表面的粘附分子或细胞因子受体：单克隆抗体技术单克隆抗体技术 直接或间接荧光抗体染色直接或间接荧光抗体染色 无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭 待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态使用流式细胞分析法，可以：区分不同分泌特性的细胞亚群：38三、酶联免疫斑点试验三、酶联免疫斑点试验(ELISPOT(ELISPOT或或ElisaSpot)ElisaSpot)在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加入可在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无刺激物存分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因子于其周围，在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获。后续的反应如同并被板上的特异性抗体捕获。后续的反应如同ELISAELISA，即在洗去细胞后视用于试验的酶标抗体为一抗或二，即在洗去细胞后视用于试验的酶标抗体为一抗或二抗，分别作直接或间接法。抗，分别作直接或间接法。一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关 基基本本原原理理三、酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot)39ELISPOTELISPOT40四、免疫学测定方法学评价四、免疫学测定方法学评价优点优点：特异性高特异性高 操作简便、快速，无需依赖细胞株操作简便、快速，无需依赖细胞株 影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化。影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化。缺点缺点：所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定呈正比所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定呈正比 结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系，使用不同来源的结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系，使用不同来源的单抗，对同一标本测定结果可能不同。单抗，对同一标本测定结果可能不同。敏感性相对较低敏感性相对较低 标本中细胞因子的可溶性受体，会影响检测结果标本中细胞因子的可溶性受体，会影响检测结果 标本中存在各种细胞因子结合蛋白如标本中存在各种细胞因子结合蛋白如细胞因子抗体或载体蛋白如白蛋白细胞因子抗体或载体蛋白如白蛋白等可干扰其测定等可干扰其测定 考点四、免疫学测定方法学评价优点：41 一、一、NorthernNorthern和和Southern BlotSouthern Blot 二、二、PCRPCR和和RT-PCRRT-PCR PCR-SSCP PCR-SSCP、PCR-RFLPPCR-RFLP、荧光实时定量、荧光实时定量PCRPCR 荧光实时定量荧光实时定量RT-PCRRT-PCR、直接测序等、直接测序等 三、原位杂交、原位三、原位杂交、原位PCRPCR和原位和原位RT-PCRRT-PCR 测定的是细胞因子的基因，测定的是细胞因子的基因，揭示何种细胞因子基因的改揭示何种细胞因子基因的改变与特定疾病发生发展之间的关系变与特定疾病发生发展之间的关系第三节、分子生物学测定方法第三节、分子生物学测定方法 一、Northern和Southern Blot第三42第四第四节节 细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用细胞因子的测定主要应用于细胞因子的测定主要应用于：考点考点特定疾病的辅助诊断特定疾病的辅助诊断机体免疫状态的评估机体免疫状态的评估临床疾病治疗效果的监测和指导用药临床疾病治疗效果的监测和指导用药疾病预防疾病预防第四节 细胞因子的测定主要应用于：考点43一、临床应用原则一、临床应用原则 细胞因子和粘附分子的细胞因子和粘附分子的异质性异质性、功能交叉性功能交叉性和和多多样性、来源的复杂性样性、来源的复杂性和和组织细胞的非特异性组织细胞的非特异性，决定了，决定了在进行这些分子检测时，必须对方法选择和结果判断在进行这些分子检测时，必须对方法选择和结果判断作出综合考虑。作出综合考虑。一、临床应用原则 细胞因子和粘附分子的异质性、功能交叉44细胞因子的检测方法多种多样，各有利弊。细胞因子的检测方法多种多样，各有利弊。生物学方法：测定细胞因子的生物学活性生物学方法：测定细胞因子的生物学活性免疫学方法：测定细胞因子的蛋白含量和细胞定位免疫学方法：测定细胞因子的蛋白含量和细胞定位基因分析法：测定的是基因（基因分析法：测定的是基因（DNADNA）及基因表达（）及基因表达（mRNA)mRNA)每种方法都有其应用特点和局限性，因此要了解一种细胞因子在特每种方法都有其应用特点和局限性，因此要了解一种细胞因子在特定疾病中的意义，应使用多种方法综合分析。定疾病中的意义，应使用多种方法综合分析。（一）方法的联合应用（一）方法的联合应用细胞因子的检测方法多种多样，各有利弊。（一）方法的联合应用45常用临床标本：抗凝全血，并分离获得单个核细胞（原因：常用临床标本：抗凝全血，并分离获得单个核细胞（原因：-），），经培养刺激使细胞因子分泌后，取培养上清液作为标本进行检测。经培养刺激使细胞因子分泌后，取培养上清液作为标本进行检测。炎症局部细胞因子的水平：局部分泌液炎症局部细胞因子的水平：局部分泌液细胞因子或粘附分子的细胞内定位检测：相应细胞细胞因子或粘附分子的细胞内定位检测：相应细胞相应细胞因子的基因和相应细胞因子的基因和mRNAmRNA表达：相应细胞表达：相应细胞疗效观察和预后判断：疾病急性期和恢复期双份标本进行动态观测疗效观察和预后判断：疾病急性期和恢复期双份标本进行动态观测（二）标本的适当选取（二）标本的适当选取常用临床标本：抗凝全血，并分离获得单个核细胞（原因：-46意义：意义：细胞因子具有网络调节的特点，级联效应或相互抑制细胞因子具有网络调节的特点，级联效应或相互抑制作用的网络系统。联合检测有助于提供有效的疾病诊断和机作用的网络系统。联合检测有助于提供有效的疾病诊断和机体免疫状态信息。体免疫状态信息。举例：举例：T T细胞、巨噬细胞和上皮样细胞分泌相应细胞因子的细胞、巨噬细胞和上皮样细胞分泌相应细胞因子的 功能：功能：IL-1IL-1、IL-2 IL-2、IFN-IFN-和和GM-CSFGM-CSF Th1/Th2 Th1/Th2细胞平衡状态：细胞平衡状态：IL-2IL-2、IL-4IL-4、IL-10IL-10和和IFN-IFN-（三）细胞因子的联合检测（三）细胞因子的联合检测意义：（三）细胞因子的联合检测47二、特定疾病诊断的辅助指标二、特定疾病诊断的辅助指标 许多疾病过程均可出现细胞因子表达的异常改许多疾病过程均可出现细胞因子表达的异常改变，高表达、低表达或是缺陷均可与某些特定变，高表达、低表达或是缺陷均可与某些特定疾病密切关联，同时还可反映疾病的进程疾病密切关联，同时还可反映疾病的进程 （一）细胞因子检测在特定疾病诊断中的意义（一）细胞因子检测在特定疾病诊断中的意义二、特定疾病诊断的辅助指标 许多疾病过程均可出现细胞因子表达48（二）粘附分子检测在特定疾病诊断中的意义（二）粘附分子检测在特定疾病诊断中的意义粘附分子有可溶性和膜结合性两种形式，均与机粘附分子有可溶性和膜结合性两种形式，均与机体的免疫状态和疾病的发生有关，在炎症、肿瘤体的免疫状态和疾病的发生有关，在炎症、肿瘤转移和器官移植排斥反应中发挥着重要的作用。转移和器官移植排斥反应中发挥着重要的作用。相关粘附分子的检测有助于此类疾病的诊断。相关粘附分子的检测有助于此类疾病的诊断。（二）粘附分子检测在特定疾病诊断中的意义粘附分子有可溶性和膜49三、评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后三、评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后 机机体体免免疫疫应应答答的的强强弱弱可可通通过过细细胞胞因因子子或或粘粘附附分分子子的的表表达达水水平平来来反反映，其过高或过低表达均系免疫调节异常的结果映，其过高或过低表达均系免疫调节异常的结果细细胞胞因因子子和和粘粘附附分分子子的的水水平平，作作为为观观察察治治疗疗效效果果和和判判断断预预后后的的重重要指标要指标其其他他：接接受受治治疗疗的的患患者者进进行行细细胞胞因因子子水水平平的的监监测测，对对保保证证治治疗疗效效果果具有指导意义；疾病预防。具有指导意义；疾病预防。三、评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后 机体免疫应答的强501 1细胞因子和细胞粘附分子概念？可分为几类？细细胞因子和细胞粘附分子概念？可分为几类？细 胞因子的作用特点有哪些？胞因子的作用特点有哪些？2 2细胞因子生物测定法的原理、种类、优缺点，放细胞因子生物测定法的原理、种类、优缺点，放射性核素法、射性核素法、MTTMTT比色法检测细胞因子的原理。比色法检测细胞因子的原理。3 3ELISAELISA法在细胞因子和粘附分子检测可应用于哪些法在细胞因子和粘附分子检测可应用于哪些 方面？方面？可溶性（细胞因子、细胞因子受体、粘附因子）可溶性（细胞因子、细胞因子受体、粘附因子）常用模式：双抗体夹心法常用模式：双抗体夹心法4 4ELISPOTELISPOT的原理、用途、与的原理、用途、与ELISAELISA的异同是什么？的异同是什么？思考题思考题1细胞因子和细胞粘附分子概念？可分为几类？细思考题516.6.细胞因子测定免疫学方法有哪些种类？优缺点？细胞因子测定免疫学方法有哪些种类？优缺点？7 7在应用流式细胞术分析细胞因子时，不同的靶在应用流式细胞术分析细胞因子时，不同的靶 细胞分别需要哪些活化剂？细胞分别需要哪些活化剂？8 8在临床疾病诊断中，检测细胞因子和粘附分子在临床疾病诊断中，检测细胞因子和粘附分子 的意义是什么？应用细胞因子检测方法的原则的意义是什么？应用细胞因子检测方法的原则 有哪些？有哪些？6.细胞因子测定免疫学方法有哪些种类？优缺点？521.1.细胞因子和粘附分子是构成免疫应答的重要物质基础，细胞因子和粘附分子是构成免疫应答的重要物质基础，检测这些分子可反映机体的免疫状态。检测这些分子可反映机体的免疫状态。2.2.细胞因子或粘附分子的检测方法包括生物学测定法、细胞因子或粘附分子的检测方法包括生物学测定法、免疫测定法和分子生物学测定法三大类。免疫测定法和分子生物学测定法三大类。3.3.细胞因子检测的临床应用有哪几方面？对某些特定疾细胞因子检测的临床应用有哪几方面？对某些特定疾病具有诊断价值；对细胞因子治疗具有监测和指导用病具有诊断价值；对细胞因子治疗具有监测和指导用药的意义；对机体的免疫状态具有评价作用。药的意义；对机体的免疫状态具有评价作用。小小 结结细胞因子和粘附分子是构成免疫应答的重要物质基础，检测这些分子53