补体检测及应用课件

补体检测及应用四川大学华西医院临床免疫实验室刘瑾补体检测及应用四川大学华西医院临床免疫实验室1第一节 补体的性质与活化途径补体是一组存在于人和脊柱动物血清及组织液中,具有酶样活性,不耐热,功能上连续反应的糖蛋白,是抗体溶解细胞必要的补充条件。一、补体的性质第一节 补体的性质与活化途径补体是一组存在于人和脊柱动物血清2补体的固有成分；C1-C9、C1q、C1r C1s共11中蛋白分子调节和控制补体系统活化的成分；C1抑制物，膜协同因子蛋白等补体受体：补体C3的受体，CR1-5等补体系统组成补体的固有成分；C1-C9、C1q、C1r C1s共11中蛋3补体系统功能参与机体的抗感染防御反应，介导细胞溶解，调理吞噬，免疫黏附以及参与炎症反应引起的机体的免疫损伤，是体内具有生物学功能的免疫效应系统和放大系统补体系统功能参与机体的抗感染防御反应，介导细胞溶解，调理吞4二、主要两种补体的活化途径（一）经典途径：是以IgG或IgM类抗体结合抗原后的免疫复合物为主要的激活剂，补体的11种成分全部参与的途经。分为识别、活化和膜攻破三个阶段。二、主要两种补体的活化途径（一）经典途径：是以IgG或Ig5（二）替代途径（旁路途经）激活剂是微生物的菌体多糖、内毒素、蛋白水解酶、IgG4和IgA聚合物等，参与的成分C3、C5-C9、B因子、D因子、P因子。（二）替代途径（旁路途经）激6两种补体激活途径的比较激活物 抗原抗体复合物 脂多糖、酵母多糖参与成分 C1-C9 C3、C5-C9 B、D、P因子始动分子 C1q C3b所需离子 Ca+2、Mg+2 Mg+2C3 转化酶 C4b2a C3bBbC5转化酶 C4b2a3b （C3b）nBb 或（C3b）nBbP 经典途径 替代途径两种补体激活途径的比较激活物 抗原抗体复合物7第二节 补体总活性测定一、血清补体总活性测定（CH50试验）（一）实验原理：特异性抗体与红细胞结合后可激活补体，导致红细胞表面形成跨膜小孔，使胞外水分渗入，引起红细胞肿胀而发生溶血，溶血程度与补体的活性有关。溶血反应程度与补体的剂量依赖呈S型曲线。第二节 补体总活性测定一、血清补体总活性测定（CH50试验）8补体检测及应用课件9（二）试验方法1.2%-5%绵羊红细胞（SRBC）的配置2.溶血素：抗绵羊红细胞抗体，是以SRBC免疫家兔所得的兔抗血清。试验前要进行溶血素的稀释和滴定。3.稀释缓冲液:PH7.2-7.4磷酸盐缓冲液 Ca+2、Mg+2（二）试验方法1.2%-5%绵羊红细胞（SRBC）的配置10不同稀释度溶血素的配置最终稀释度 稀释液(ml)稀释度 溶血素（ml）1:1000 1.8 1:100 0.21:2000 0.2 1:1000 0.21:3000 0.4 1:1000 0.21:4000 0.2 1:2000 0.21:5000 0.8 1:1000 0.21:6000 0.2 1:3000 0.21:8000 0.2 1:4000 0.21:10000 0.2 1:5000 0.2不同稀释度溶血素的配置最终稀释度 稀释液(ml)11溶血素的滴定1 1：1000 0.1 0.2 0.2 0.1 全溶血2 1：2000 0.1 0.2 0.2 0.1 全溶血3 1：3000 0.1 0.2 0.2 0.1 37 全溶血4 1：4000 0.1 0.2 0.2 0.1 30分钟 全溶血5 1：5000 0.1 0.2 0.2 0.1 大部分溶血6 1：6000 0.1 0.2 0.2 0.1 微溶血7 1：8000 0.1 0.2 0.2 0.1 不溶血8 1：10000 0.1 0.2 0.2 0.1 不溶血9 对照 _ _ 0.2 0.1 不溶血管号 溶血素 试管内加入的试剂量（ml）稀释度 溶血素 1:60 补体 缓冲液 2%SRBC 结果溶血素的滴定1 1：1000 0.1 12以最高稀释度的溶血素仍能产生完全溶血为最大有效反应管(1：4000)即为1个单位，一般试验使用2个单位(1：2000)以最高稀释度的溶血素仍能产生完全溶血为最大有效反应管(1：4134.50%溶血标准管配制4.50%溶血标准管配制145.血清总补体50%溶血活性测定(ml)1 0.10 1.400.5 0.52 0.15 1.350.50.53 0.20 1.300.50.54 0.25 1.250.50.55 0.30 1.200.50.56 0.35 1.150.50.57 0.40 1.100.50.58 0.45 1.050.50.59 0.50 1.000.50.510 0,00 1.500.50.5试管号试管号 1：20稀释血清稀释血清 巴比妥缓冲巴比妥缓冲 2u溶血素溶血素 2%SRBC5.血清总补体50%溶血活性测定(ml)1 15按以下公式求50%溶血的总补体值 1CH50（U/ml）=稀释倍数 血清用量总补体活性参考范围:50-100 U/ml按以下公式求50%溶血的总补体值 16(三)方法评价CH50测定经典途径总补体溶血活性反应的是补体9种成分综合水平缓冲液PH、离子强度、Ca+2、Mg+2浓度各个环节严加控制。(三)方法评价CH50测定经典途径总补体溶血活性17第三节 单个补体成分的测定主要检测的单个补体成分：C3、C4、C1q、B因子和C1脂酶抑制物方法：免疫溶血法 测定补体的溶血活性 免疫化学法 测定补体的含量第三节 单个补体成分的测定主要检测的单个补体成分：C3、C418一、免疫溶血法 定义：抗原与特异性抗体结合后激活补体的经典途径，导致红细胞溶解。当缺乏某种补体成分时，加入指示系统，不能使补体连续激活，不发生溶血；再加入待测血清，使原来缺乏的成分得到补偿，补体成分齐全，级联反应恢复，产生溶血，溶血程度与以待测补体成分活性有关，以50%溶血为终点。一、免疫溶血法 定义：抗原与特异性抗体结合后激活补体的经19 （1）指示系统：兔抗血清致敏SRBC （2）实验反应系统的补体：选用或制备缺乏某单一补体成分动物或人血清的试剂 （3）待测血清：待测血清标本中的补体 （1）指示系统：兔抗血清致敏SRBC20补体检测及应用课件21二、免疫化学法单向免疫扩散法火箭免疫电泳透射比浊法散射比浊法二、免疫化学法单向免疫扩散法22第四节 补体结合试验一、试验原理补体结合试验三个系统：反应系统：已知抗原或抗体与待测抗体或抗原补体系统：豚鼠血清指示系统：SRBC与溶血素结合成为致敏绵羊红细胞 第四节 补体结合试验一、试验原理23图19-3图19-324二、试验方法（一）试剂的制备1.抗原适当纯化2.抗原和抗体的滴定:选择抗原与抗体均呈强阳性反应（100%不溶血）的最高稀释度作为抗原和抗体的效价，即一个单位由方阵滴定表可见1:64的抗原和1:32的抗体为一个单位,正式试验抗原用2-4个单位,抗体用4个单位二、试验方法（一）试剂的制备25抗原与抗体效价的方阵滴定注:1、2、3、4分别表示补体结合反应强度;0表示全溶血,补体结合试验阴性抗原与抗体效价的方阵滴定注:1、2、3、4分别表示补体结合反263.补体的滴定管 号 1234561：60补体(ml)0.040.060.080.100.120.14缓冲液(ml)0.260.240.220.200.180.16抗原(2U/ml)0.10.10.10.10.10.1 37水浴30min1%SRBC(ml)0.20.20.20.20.20.2 37水浴30min结 果 不溶血 不溶血微溶血 微溶血 全溶血 全溶血3.补体的滴定管 号 12 327能产生完全溶血的最少量的补体为1个实用单位，正式试验选用2个单位。由表19-9的结果为1：60的补体0.12ml可产生完全溶血为1个实用单位，按比例公式：20.12/60=0.2/XX=1/50能产生完全溶血的最少量的补体为1个实用单位，正式试验选用2个28（二）血清标本及时分离血清，尽快检测或-20保存试验前灭活补体（二）血清标本及时分离血清，尽快检测或-20保存29（三）正式试验反应物(ml)待测血清 阳性对照 阴性对照 抗原或抗体 补体对照 红细胞 测定 对照 测定 对照 测定 对照 对照管 2U 1U 0.5U 对照管稀释血清0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 -抗原或抗体0.1 -0.1-0.1 -0.1 0.1 0.1 0.1 -缓冲液-0.1 -0.1 -0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.4补体 2U0.2 0.2 0.20.2 0.2 0.2 0.2 0.2 -补体 1U -0.2 -补体 0.5U-0.2 -混匀，37水浴1h或41618hSRBCs 0.2 0.2 0.20.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 混匀，37水浴30分钟，观察结果（三）正式试验30三 方法评价灵敏度高 0.05ug/ml特异性强结果明显试验条件要求低参与成分多，操作繁琐三方法评价灵敏度高 0.05ug/ml31第五节 补体测定的应用诊断病原体感染检测补体的功能检测单个成分的含量及活性相关疾病时补体的检测补体参与的试验流行病学调查补体应用于临床治疗后的检测第五节 补体测定的应用诊断病原体感染32相关疾病时补体的检测免疫性疾病与补体相关的遗传性疾病补体含量显著降低的疾病高补体血症相关疾病时补体的检测免疫性疾病33