基因功能研究课件

教师：教师：王华王华单位：吉单位：吉 林林 大大 学学 基础医学院基础医学院 分子生物学教研室分子生物学教研室电话：电话：85619369(L)E-mail:Strategies for analyzing gene function基因功能的基因功能的鉴定技定技术之二之二教师：王华电话：85619369(L)Strategie在在mRNA水平上水平上RNA干涉干涉反义反义RNA在基因水平上在基因水平上基因敲除技术基因敲除技术转基因技术转基因技术在蛋白质水平上在蛋白质水平上酵母双杂交技术酵母双杂交技术基因功能的研究是基因功能的研究是2121世纪生命科学研究的重点之一，世纪生命科学研究的重点之一，希望能发现更多的功能基因造福于人类。希望能发现更多的功能基因造福于人类。基因功能的基因功能的鉴定技定技术之二之二在mRNA水平上RNA干涉反义RNA在基因水平上基因敲除技术反义反义RNA（anti-sense RNA）能与能与mRNAmRNA互补的互补的RNARNA链链,称作反义称作反义 RNA.RNA.反义技术的应用实例：反义技术的应用实例：用用BCL-2Anti-senseoligonucleotide,通过与细胞内特定通过与细胞内特定mRNA互补，封闭特定基因的表达，达到治疗疾病的目的。互补，封闭特定基因的表达，达到治疗疾病的目的。治疗治疗B淋巴瘤淋巴瘤和和白血病。白血病。BCL-2癌基因癌基因第三节第三节 通过封闭通过封闭mRNAmRNA，而使基因功能失，而使基因功能失活活反义RNA（anti-sense RNA）能与mRNA互补的美国科学家安德鲁美国科学家安德鲁法尔法尔(左左)和克雷格和克雷格梅洛梅洛(右右)：发现了干扰机制。发现了干扰机制。2006年年Andrew Z.FireStanford University School of Medicine Craig C.MelloUniversity of Massachusetts Medical School 第四节第四节 RNARNA干涉干涉（RNAinterference,RNAi）美国科学家安德鲁法尔(左)和克雷格梅洛(右)：发现了问问:你知道最早发现你知道最早发现RNAi现象是在什么情况下吗？现象是在什么情况下吗？1995年，年，康奈尔大学康奈尔大学Su Gou博士的实验：博士的实验：用反义用反义RNA(anti-sense RNA)转染线虫可以阻断转染线虫可以阻断par-1基基因的表达；因的表达；在正义在正义RNA(sense RNA)的对照组中也出现了基因受抑的对照组中也出现了基因受抑现象。现象。Larva:幼虫幼虫Moult:脱毛脱毛 线虫的优点：线虫的优点：1.1.可用大肠杆菌饲喂可用大肠杆菌饲喂2.about 1000 cells,2.about 1000 cells,3.3.基因组小基因组小(100 Mbp)(100 Mbp)4.4.在生活史的各阶段皆在生活史的各阶段皆透明透明 5.3.55.3.5天一代天一代.Hatch:孵化孵化提示提示:一些实验现象可能是当时知识背景下所不能认识的，一些实验现象可能是当时知识背景下所不能认识的，但客观地呈现这些实验现象是非常重要的。但客观地呈现这些实验现象是非常重要的。许多科学的重大发现都源于意外的实验现象许多科学的重大发现都源于意外的实验现象诸如：诸如：RNAi现象现象青霉素青霉素霉菌，抑菌环霉菌，抑菌环葡萄酒葡萄酒葡萄变葡萄变“坏坏”伟哥伟哥心肠变硬的药，提高性欲，治疗冠心病心肠变硬的药，提高性欲，治疗冠心病纯化抗体纯化抗体杂蛋白吸附到介质上（杂蛋白吸附到介质上（pH值的变化）值的变化）Why？该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。一、一、RNAiRNAi的历史的历史问:1995年，Larva:幼虫 线虫的优点：Hatc（1）用纯化后的单链用纯化后的单链RNA注射线虫，基注射线虫，基因抑制现象是非常微弱的！因抑制现象是非常微弱的！（2）将）将双链双链RNA给线虫注射，出现了给线虫注射，出现了高高效效、特异性的基因抑制效应。、特异性的基因抑制效应。（3）Su Guo博士在转染正义博士在转染正义 RNA时污时污染了染了微量微量反义反义RNA，“十分错误十分错误”地地将双链将双链RNA(dsRNA)导入了细胞。导入了细胞。Andrew Z.FireStanford University School of Medicine Craig C.MelloUniversity of Massachusetts Medical School 1998年年:Fire和和Mello的实验揭开这个悬疑之谜：的实验揭开这个悬疑之谜：他们将这种由双链他们将这种由双链RNA引起的特异性基引起的特异性基因抑制现象，称作因抑制现象，称作RNA干涉（干涉（RNAi）。Fire,A.etal.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature391,806-811.(1998)进一步的研究发现：进一步的研究发现：（1 1）RNAiRNAi的活性可以远程表现的活性可以远程表现（2 2）RNAiRNAi的作用可传给后代的作用可传给后代 在在C.elegansC.elegans应用应用双链双链RNARNA的途径：的途径：（1 1）直接注射到肠道）直接注射到肠道（2 2）饲喂）饲喂（3 3）浸泡）浸泡例如：例如：GFP GFP 转基因植物的叶子转基因植物的叶子:从叶片的一端注射从叶片的一端注射GFP siRNA,GFP siRNA,可干扰整个叶片可干扰整个叶片 GFP GFP 的表达。的表达。RNAiRNAi广泛存在于自然界广泛存在于自然界（1）用纯化后的单链RNA注射线虫，基因抑制现象是非常微弱的想想：想想：由于由于antisense-RNA的原因的原因,在细胞内出现在细胞内出现dsRNA正常吗？正常吗？细胞内是否存在特异性降解细胞内是否存在特异性降解dsRNA的机制？的机制？Dicer负责识别并切割负责识别并切割dsRNARNase家族中成员家族中成员识别、降解双链识别、降解双链RNA产生约产生约2123nt bp片段片段每个片段每个片段3 端有端有2个碱基突出个碱基突出二、二、RNA RNA 干涉（干涉（RNAiRNAi）的机理）的机理想想：Dicer负责识别并切割dsRNARNase 家族活化阶段活化阶段：siRNA与细胞内的某些与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。RISC中中的解旋酶的解旋酶将其中的将其中的siRNA变成单链变成单链,成为成为activatedRISC。Longdouble-strandedRNAs(dsRNAs;typically200nt)canbeusedtosilencetheexpressionoftargetgenesinavarietyoforganismsandcelltypes(e.g.,worms,fruitflies,andplants).Uponintroduction,thelongdsRNAsenteracellularpathwaythatiscommonlyreferredtoastheRNAinterference(RNAi)pathway.First,thedsRNAsgetprocessedinto20-25nucleotide(nt)smallinterferingRNAs(siRNAs)byanRNaseIII-likeenzymecalledDicer(initiationstep).Then,thesiRNAsassembleintoendoribonuclease-containingcomplexesknownasRNA-inducedsilencingcomplexes(RISCs),unwindingintheprocess.ThesiRNAstrandssubsequentlyguidetheRISCstocomplementaryRNAmolecules,wheretheycleaveanddestroythecognateRNA(effecterstep).CleavageofcognateRNAtakesplacenearthemiddleoftheregionboundbythesiRNAstrand.Inmammaliancells,introductionoflongdsRNA(30nt)initiatesapotentantiviralresponse,exemplifiedbynonspecificinhibitionofproteinsynthesisandRNAdegradation.Themammalianantiviralresponsecanbebypassed,however,bytheintroductionorexpressionofsiRNAs.效应阶段：效应阶段：ActivatedRISC与靶与靶mRNA结合，利用自身核酸内切酶活结合，利用自身核酸内切酶活性在距离性在距离siRNA3端端12个碱基的位置个碱基的位置将将mRNA切断、降解靶切断、降解靶mRNA。起始阶段：起始阶段：异常异常dsRNA被细胞内的被细胞内的Dicer酶特异识别、切割成长酶特异识别、切割成长2123nt的短双链的短双链RNA，称为，称为小干扰性小干扰性RNA（smallinterferingRNA,siRNA）。Viral RNAViral RNAdsRNA激活激活Dicer，降，降解具有互补序列的外解具有互补序列的外源源RNA或细胞或细胞RNA。siRNA不仅能引导不仅能引导RISC切割切割同源单链同源单链mRNA；RISC中的中的siRNA与靶与靶RNA结结合时还可作为引物，并在合时还可作为引物，并在RNA聚合酶聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下，作用下，合成更多新的合成更多新的dsRNA；新合成的新合成的dsRNA再由再由Dicer切切割产生大量的次级割产生大量的次级siRNA，从，从而使而使RNAi的作用进一步放大，的作用进一步放大，最终将靶最终将靶mRNA完全降解。完全降解。二、二、RNA RNA 干涉（干涉（RNAiRNAi）的机理）的机理 *RNARNA干扰过程主要有干扰过程主要有3 3个步骤：个步骤：活化阶段：siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称三、三、RNAiRNAi技术技术 利用利用短双链短双链RNA(siRNA)能能启动启动 特定特定 mRNA降解的特性，降解的特性，将人工设计的将人工设计的 siRNA 导入靶细胞中，启动导入靶细胞中，启动RNAi，从而诱导特定，从而诱导特定mRNA降解，降解，抑制抑制特定特定基因表达的技术。基因表达的技术。*三、RNAi技术 利用短双链RNA(siRNA)能启确定目的基因确定目的基因设计设计SiRNA序列序列化学合成或体外转录化学合成或体外转录在体外，获得在体外，获得SiRNA构建构建SiRNA表达载体表达载体转染细胞转染细胞转染细胞转染细胞细胞内表达细胞内表达SiRNARNAi效果检测效果检测如何开展如何开展RNAi实验？实验？确定目的基因设计 SiRNA 序列化学合成或体外转录在体外，构建构建SiRNASiRNA表达载体表达载体,在细胞内在细胞内转录转录RNA pol 启动子启动子(U6)可以在哺乳动物可以在哺乳动物细胞中表达小分子细胞中表达小分子RNA。BamHIHindIIII将重组质粒转染细胞，在细胞内，转录产生发夹将重组质粒转染细胞，在细胞内，转录产生发夹siRNAUU35UU CAAGAGALoopSense strandAntisense strand19 nt了解了解构建SiRNA表达载体,在细胞内转录RNA pol 启动子UUSiRNADicer RNase IIIA.TransfectionABCTargetingmRNA cleavagesuppressionSiRNADSiRNA如何开展如何开展RNAi实验？实验？UUSiRNADicer A.TransfectionABC四、四、SiRNASiRNA的设计原则：的设计原则：随机选取随机选取不考虑位点信息不考虑位点信息脱靶效应严重脱靶效应严重 NCBI 软件软件生物信息分析生物信息分析具有最小脱靶效应的功具有最小脱靶效应的功能性能性siRNA避开起始避开起始100bpAA（N19）TT GC含量含量BLAST检索检索.大量筛选大量筛选了解了解四、SiRNA的设计原则：随机选取 NCBI 五、五、RNAiRNAi技术的应用技术的应用 1)研究基因的功能研究基因的功能用用RNAi来抑制癌基因的表来抑制癌基因的表达，进而抑制肿瘤的生长。达，进而抑制肿瘤的生长。肿瘤细胞肿瘤细胞2)封闭有害基因的表达：抗肿瘤、抗病毒封闭有害基因的表达：抗肿瘤、抗病毒缩短人类对基因功能的认识时间缩短人类对基因功能的认识时间CD4siRNA封闭受体，封闭受体，使使HIV不易不易进入宿主细进入宿主细胞。胞。p24siRNA抑制抑制HIV蛋蛋白质的合成白质的合成和和HIV的复的复制。制。五、RNAi技术的应用 1)研究基因的功能 用 R六、六、RNAi RNAi 技术优点技术优点RNAi(knockdown)VS同源重组同源重组(knockout)高效率高效率易于操纵易于操纵可实现多种基因突变可实现多种基因突变六、RNAi 技术优点RNAi(knockdown)VRNA干扰干扰(RNAinterference,RNAi)*是由是由短双链短双链RNA（double-strandedRNA，SiRNA）诱发的、同源诱发的、同源mRNA高高效特异性降解效特异性降解的现象。的现象。其抑制基因表达的效率比反义其抑制基因表达的效率比反义RNA至少高至少高2个数量级。个数量级。mRNAmRNAsiRNAsiRNA是可以反复利用的是可以反复利用的!通过封闭通过封闭mRNAmRNA反推基因的功能反推基因的功能Summary:Summary:Post-transcriptional gene silencing，PTGS相关技术：相关技术：Anti-sense RNARNAi橙色：解旋酶橙色：解旋酶绿色：内切酶绿色：内切酶由于使用由于使用RNAi技术可以特异技术可以特异性关闭特定基因的表达，所以已性关闭特定基因的表达，所以已被广泛用于探索基因功能和传染被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗。性疾病及恶性肿瘤的治疗。RNA干扰(RNA interference,基因功能研究的策略基因功能研究的策略在在mRNA水平上水平上RNA干涉干涉反义反义RNA在基因水平上在基因水平上基因敲除技术基因敲除技术转基因技术转基因技术在蛋白质水平上在蛋白质水平上酵母双杂交技术酵母双杂交技术基因功能的研究是基因功能的研究是2121世纪生命科学研究的重点之一，世纪生命科学研究的重点之一，希望能发现更多的功能基因造福于人类。希望能发现更多的功能基因造福于人类。基因功能研究的策略在mRNA水平上RNA干涉反义RNA在基第五节第五节 酵母双杂交（酵母双杂交（Yeast-Two-Hybrid）转录激活因子转录激活因子（TAF=BD+AD）Activation domainBD(AD)DNA binding domain(BD)回忆：转录激活因子的结构特征回忆：转录激活因子的结构特征AD的作用：的作用：促进基因转录促进基因转录两个结构域是转录激活因子发挥活性所必需的，缺一不可。两个结构域是转录激活因子发挥活性所必需的，缺一不可。一、原理一、原理第五节 酵母双杂交（Yeast-Two-Hybrid）转1.两个结构域分别与两个蛋白融合，各自均没有两个结构域分别与两个蛋白融合，各自均没有转录激活因子的活性转录激活因子的活性 第五节第五节 酵母双杂交（酵母双杂交（Yeast-Two-Hybrid）一、原理一、原理1.两个结构域分别与两个蛋白融合，各自均没有转录激活因子的2.BD和和AD空间位置靠近，可以恢复空间位置靠近，可以恢复TAF的作用：的作用：BDADBD-融合蛋白融合蛋白(诱饵诱饵)AD-融合蛋白融合蛋白(待测待测)两个蛋白相互作用使两个蛋白相互作用使BD和和AD空间位置靠近空间位置靠近一、原理一、原理2.BD和AD空间位置靠近，可以恢复TAF的作用：BDAD酵母双杂交（酵母双杂交（Yeast-Two-Hybrid）在真核模式生物酵母中，在真核模式生物酵母中，利用利用蛋白质蛋白质-蛋白质相互蛋白质相互作用作用来来激活报告基因的转录激活因子激活报告基因的转录激活因子，并以报告基因表达产物作为检测信号来并以报告基因表达产物作为检测信号来检测蛋白检测蛋白质间是否发生了相互作用的技术方法质间是否发生了相互作用的技术方法。体内体内(活细胞内活细胞内)检测；检测；敏感敏感方法。方法。报告基因报告基因转录转录酵母双杂交（Yeast-Two-Hybrid）在真核模式生物二、酵母双杂交实验是如何进行的：二、酵母双杂交实验是如何进行的：二、酵母双杂交实验是如何进行的：BD MCSPBDvectorligationligationTransformationTransformation1 1、构建两种酵母表达载体、构建两种酵母表达载体AD MCSPADvector已知基因：已知基因：baitbaitcDNAcDNA文库基因：文库基因：FishFishexpressGAL4-BD-已知蛋白已知蛋白.selectedonTrpdeficientmedia.色氨酸色氨酸expressGAL4-AD-Fishprotein.selectedonLeudeficientmedia.LeucineBD MCSP BD vectorligationligatMatingplatingTransformationTransformation交配交配2 2、将两种载体放到一个酵母细胞中、将两种载体放到一个酵母细胞中selectedonTrpdeficientmedia.selectedonLeudeficientmedia.只有只有共共转化转化成功的酵母菌才能在成功的酵母菌才能在Trp&Leu deficient的培养基的培养基上生长！上生长！BD MCSPBDvectorligationligationAD MCSPADvector已知基因：已知基因：baitbait未知基因：未知基因：FishFishexpressGAL4-BD-已知蛋白已知蛋白.expressGAL4-AD-Fishprotein.Mating platingTransformation3 3、筛选发生了蛋白质、筛选发生了蛋白质-蛋白质相互作用的酵母株蛋白质相互作用的酵母株报告基因报告基因-Lac Z基因和基因和His基因的转录激活因子都是基因的转录激活因子都是GAL4，即启，即启动子上都有动子上都有GAL4的的bindingsite。但启动子序列除了但启动子序列除了GAL4bindingsite相同外，其余序列完全不同。相同外，其余序列完全不同。HistidineOnly yeast cells expressing interacting protein survive.LacZ 表达产物检测：使底表达产物检测：使底物物X-GAL显蓝色显蓝色营养代谢有关基因表达产营养代谢有关基因表达产物检测：物检测：HIS基因的表达可基因的表达可以使酵母细胞在相应的营以使酵母细胞在相应的营养物质缺乏的平板上生长养物质缺乏的平板上生长lacZGAL4-bindingsiteHis3PromoterReportorGene酵母菌株酵母菌株Auxotrophic具有报告基因：具有报告基因：LacZ和和His。3、筛选发生了蛋白质-蛋白质相互作用的酵母株报告基因-4 4、分析、分析 FishFish对对AD-fish质粒进行质粒进行DNA测序、测序、在在cDNA数据数据库库中进行同源性比较分析，确定中进行同源性比较分析，确定fish确定这些发生了相互作用的蛋白质中，哪些是目前确定这些发生了相互作用的蛋白质中，哪些是目前未知的未知的fish！4、分析 Fish对AD-fish质粒进行DNA测序、酵母双杂交技术的基本过程酵母双杂交技术的基本过程fish酵母双杂交技术的基本过程fish 三、酵母双杂交系统的应用三、酵母双杂交系统的应用1、筛选与已知蛋白质相互作用的未知蛋白，并确定、筛选与已知蛋白质相互作用的未知蛋白，并确定其编码基因其编码基因2、检测已知蛋白质间的相互作用的结构域及氨基酸、检测已知蛋白质间的相互作用的结构域及氨基酸序列序列通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸。三、酵母双杂交系统的应用1、筛选与已知蛋白质相互作用的未知拓展知识拓展知识拓展知识是细胞内的一类非编码小分子是细胞内的一类非编码小分子RNA(22nt)细胞内有细胞内有microRNA(miRNA)miRNA gene -Pre-microRNA(具有颈环结构的具有颈环结构的ssRNA，约，约70nt）-运输到细胞质运输到细胞质-被被Dicer切割切割miRNA控制着几乎每一个人类基因的活动。控制着几乎每一个人类基因的活动。拓展知识拓展知识1miRNA与与siRNA之间有许多相同之处：之间有许多相同之处：1.二者的长度都约在二者的长度都约在22nt左右。左右。2.二者都依赖二者都依赖Dicer酶的加工酶的加工,都是由双链都是由双链RNA或或RNA前体形成的。前体形成的。3.二者都是二者都是RISC组分组分，microRNA也可以引起也可以引起mRNA降解。降解。是细胞内的一类非编码小分子RNA(22nt)细胞内有mi micro-RNA的形成及作用机制的形成及作用机制 micro-RNA的形成及作用机制RNA干扰机制示意图干扰机制示意图翻译抑制（不完全匹配）翻译抑制（不完全匹配）剪切目的剪切目的mRNA（完全匹配）（完全匹配）RNA干扰机制示意图 翻译抑制（不完全匹配）剪切目的mRNA1.根本区别是根本区别是miRNA是是内源的内源的，调节基因表达，调节基因表达,是生物所固有的；是生物所固有的；而而siRNA是人工体外合成的是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是，通过转染进入人体内，是RNA干涉干涉的中间产物。的中间产物。正常情况下只有在病毒或其它正常情况下只有在病毒或其它dsRNA诱导情况下才产诱导情况下才产生生siRNA，作为，作为miRNA的完善和补充。的完善和补充。2.在作用位置上：在作用位置上：miRNA主要作用于靶标基因主要作用于靶标基因3-UTR区，区，可抑制靶标基因的翻译可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解也可以导致靶标基因降解;而而siRNA可作用于可作用于mRNA的任何部位，只能导致靶标基因降解。的任何部位，只能导致靶标基因降解。miRNA与与siRNA的区别：的区别：1.根本区别是miRNA是内源的，调节基因表达,是生物所固问：问：RNAi为什么可能存在在脱靶为什么可能存在在脱靶(off-targeting)效应？效应？拓展知识拓展知识2 1.1.正义链与正义链与RISCRISC结合结合问：RNAi为什么可能存在在脱靶(off-targetin 解决办法：解决办法：链偏好性链偏好性（Strand bias）使使RISC只结合只结合SiRNA的反义链。的反义链。解决办法：链偏好性（Strand bias）使RISC只结2.miRNA-likepathway：Off-targetsilencingviaseed-regionactivity2.miRNA-like pathway：Off-targ基因功能研究课件难点：难点：RNiRNi的机理、酵母双杂交的基本程序的机理、酵母双杂交的基本程序【重点内容重点内容】二、二、机理机理*一、一、定义定义 *三、生物学意义三、生物学意义*第三节第三节 RNiRNi第四节第四节 酵母双杂交酵母双杂交二、二、原理原理*一、一、定义定义 *三、基本程序三、基本程序难点：RNi的机理、酵母双杂交的基本程序【重点内容】二、机理【课后思考课后思考】miRNAmiRNA的检测在乳腺癌或胃肠癌的诊断或的检测在乳腺癌或胃肠癌的诊断或用药指导方面的应用。用药指导方面的应用。【课后思考】miRNA的检测在乳腺癌或胃肠癌的诊断或用药指导