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目录摘要3Abstract4第一章 绪论61.1 引言61.2 新型样品前处理技术的评价及发展61.2.1 样品前处理方法的评价61.2.2 样品预处理方式及适用条件61.2.3 常用预处理方法：固相萃取技术71.2.4 样品预处理技术的发展81.3 免疫分析81.3.1 抗原91.3.2 抗体101.3.3 抗原抗体反应101.4 免疫亲和层析柱（IAC）111.4.1 简述及现状111.4.2 IAC 的原理111.4.3 IAC的优势12第二章 氯霉素单组分免疫亲和色谱法的建立132.1 氯霉素检测方法的现状132.2 氯霉素132.2.1 氯霉素分类132.2.2氯霉素检测方法142.3 本课题的研究意义及目的142.4 实验材料152.4.1 实验试剂152.4.2 溶液配制152.4.3 实验仪器和设备162.5 实验部分172.5.1操作条件172.5.2 抗体的获取与纯化182.5.3 抗体蛋白含量的测定192.5.4抗体纯度测定202.5.5 氯霉素免疫亲和柱的制备202.5.6 氯霉素免疫亲和柱的表征212.7 结果与讨论232.7.1 氯霉素抗体浓度的测定232.7.2 氯霉素抗体纯度的测定242.7.3 IAC交联程度测定242.7.4 氯霉素免疫亲和柱特性表征252.7.5 对比SPE柱净化结果讨论26总结27参考文献28致谢30摘要 食品安全引人重视，国计民生时刻关注。食品安全无疑是小民生里渗透着的大科学。如何使民众的身体健康与生命安全的得到有效保障？严峻的形势亟待我们建立一种有效的针对食品中存在的有毒有害物质进行提取，纯化并与检测仪器结合使用的高效分析检测方法。这种预处理方法还应该具备简单、便捷、高效和可靠的特点。氯霉素作为一种对人体健康有害的，常被滥用于农水产品的抗生素，有必要施行对它的便捷的预处理，以便后续检测。本实验旨在建立一种单组分的氯霉素的免疫亲和色谱法，用于萃取分离富集虾肉样品的氯霉素残留。将样品用免疫亲和层析柱预处理，再用高效液相色谱-质谱联用检测，在准确可靠的前提条件下，使得样品预处理的操作简单高效化，从而缩短分析时间，达到了简单便捷，高效可靠的目标。本研究采用的免疫亲和柱，是把Protein G 树脂胶纯化的氯霉素的单克隆抗体，和溴化氰活化Sepharose 4B琼脂糖凝珠共价结合交联，再将此种复合物分装进EP管中制备而成的多个微型小“柱”。经过实验的验证，实际样品虾肉能够用采用这种方法制备的免疫亲和色谱柱分析：它能将氯霉素从虾肉样品中提取分离，每50L柱胶的最大柱容量为200ng每50L柱胶。在探究上样、淋洗和洗脱的条件后，建立梯度浓度氯霉素标液的S型曲线测定，找到了线性关系、检测限，线性范围内标液的回收率为78.9%-129.9%。之后的实际样品的加标测定结果为：虾肉和奶粉加标量分别为 2ng g1时，回收率在80%左右，奶粉达到了90%。为保证实验严谨，还进行了空白样品过柱实验作为阴性对照，并用HPLC-MS/MS进行测定无信号证明虾肉基质本身呈阴性。关键词：样品预处理 免疫亲和层析柱 虾肉检测 氯霉素 高效液相色谱-质谱联用 食品安全AbstractFood safety and peoples livelihood attracts attention a lot. Food safety is undoubtedly a kind of great science that permeates the small peoples livelihood. How to ensure peoples food security, health and life quality? This is a grim situation that calls for us to establish an effective detection method for harmful toxic substances contained in food. This method should be simple, convenient, efficient and reliable as well. Chloramphenicol as a kind of antibiotic that harmful to human health, is often abused in agricultural water products ,so its naturally to carry out a kind of convenient detection of it. The aim of this experiment was to establish a single component of chloramphenicol immunoaffinity chromatography for the extraction of chloramphenicol residues in the samples. The sample pretreatment with immune affinity chromatography column, then detect with HPLC-MS/MS detection, at the same time ensuring the premise that accurate and reliable, make sample pretreatment operation simple and efficient, so as to shorten the analysis time, to achieve a simple and convenient, reliable and efficient target.The immune affinity column used in this research adopts chloramphenicol monoclonal antibody that has been purified and dialysis with the Protein G resin, covalently combine with CNBr activated Sepharose 4B gel beads, then repackage this compound into EP tube into multiple tiny little column. As the experimental verification shows, the actual samples of the preparation of shrimp can use this immune affinity chromatography column way to analysis: it can do extraction and separation of chloramphenicol from the shrimp samples, every 50L column glue has the maximum column capacity of 200ng. On inquiry, leaching and elution conditions, establish the gradient concentration determination of chloramphenicol to draw a standard curve that give us the linearity, detection limit and the recovery rate of the fluid inside the limits of 78.9%-129.9%.The result of the addition of the actual sample was: 2ng g-1,recovery of shrimp on average is 80% and for milk its 90%.In order to conduct an accurate enough experiment, the blank sample was carried out as the negative control, with detection using HPLC-MS/MS.The outcome shows relative standard deviation of the real sample is blank.Keywords: specimen pretreatment, immune affinity chromatography column ，shrimp flesh detection, chloramphenicol, HPLC-MS/MS, food safety.第一章 绪论 1.1 引言对样品进行分析测试的整个流程大致为：目标样品的收集，样品的分解，样品净化，样品进样前的处理和样品上机测定一共五个流程，并且除了样品的测定外，剩余步骤粗泛而言都属于样品预处理。对于从事分析化学的科研人员来说，我们主要关注样品分解和净化两个环节，这是狭义分析预处理环节1。我们的目的就是将待检测的样品处理成满足仪器分析要求的性态，而且在绝大多数情况下要处理成溶液的样品状态。样品预处理是检测与分析工作中的关键环节。从时长来讲，分析过程约60%以上的时间都在样品预处理这一步耗费；从实验本身来讲，样品预处理环节是的分析误差的主要来源。因此，样品的前处理技术是否科学简便，决定着着分析化学技术发展的顺畅与否。1.2 新型样品前处理技术的评价及发展1.2.1 样品前处理方法的评价 样品预处理，概括来说是获得样品后将其中的目标组分提取、净化、浓缩、复溶到需要状态的全过程。首要目标是维护仪器安全，避免基质对实验结果造成干扰，提高所用检测方法的选择性、准确度、灵敏度，降低检测限2。因此，这些标准也就自然而然的成为对样品前处理方法评价的标准。首先，方法的选择要有针对性，依据样品中残留物质的不同特点而灵活参考。因此，怎样因材施法，将最适合的方法应用于所分析样品是关键问题。所以我们应该考虑多种因素作为评价预处理方法的标准：是否浓缩了样本，使得方法的灵敏度对应提高、回收率高低、基质干扰，人力物力的耗费、所要求检测条件苛刻与否、是否可以重复实验结果等3。所有因素要综合考虑，不能把优势以偏概全，也不能看到缺点就因噎废食。1.2.2 样品预处理方式及适用条件数量众多的样品预处理方式各有其原理与适用范围4，如表1.1所示。 表1.1样品预处理方式的原理及应用范围 1.2.3 常用预处理方法：固相萃取技术我们常用SPE代表固相萃取技术，它是现今许多实验室和单位常用的样品处理方法。常常用于纯化生物产品，用于临床医学，生物化学，法医学和药物研究等领域的进一步分析5。SPE的普及部分归因于它实现较高的选择性和回收率，易于使用以及对危险萃取溶剂的消耗较少等实用性6。它作为一种净化技术常与液相色谱联用，目前这种应用非常普遍7。比如环境样品分析、食品样品分析以及药物检测，生物样品分析等8。目前商业上应用比较广泛的预处理耗材就是SPE柱，柱床是一个长约十厘米的塑料小柱，填料根据目标物特性各有不同。使用时先活化洗涤，再将样品溶液稀释一定比例后从柱上口加入，样品溶液通过SPE柱下端流入贮液器中。样品溶液过柱后洗涤吹干，可在柱下端出口处减压抽气，或于柱上口加压。最后用适当溶液洗脱，洗脱液用离心管或试管收集即完成净化9。1.2.4 样品预处理技术的发展随着科学技术的进步和科研工作者的开发研究，样品前处理技术有了新的发展。10但寻求利大于弊，适用性更佳的样品预处理新方法研工作者孜孜以求的目标，是目前分析化学这门学科面临的一个亟待解决的问题。在传统预处理仍被应用的同时，科学家根据净化原理进一步改进，对待测样本“量体裁衣”，结合新的微波、超临界流体等技术，创造拓展了新的样品预处理领域。超临界流体萃取法、固相微萃取法、液膜萃取法、微波辅助萃取法等，都是最近几年兴起并发展迅速的预处理方法，这些方法被越来越多人推崇的很大原因归结于它们减少或避免了有害溶剂的使用。未来，样品前处理将更多地向绿色化学(无溶剂)、样品微量化、装置小型化发展。较为突出的，如固相微萃取(SPME)技术已日益成熟并成为多个领域应用中的标准方法，应用越来越广泛。液相微萃取(LPME)克服了传统液-液萃取技术繁琐、浪费、污染等缺点，具有消耗溶剂少(仅需L级)，富集倍数大，萃取效率高，操作更简便，便于实现分析的自动化等突出优点，被广泛研究和应用，有着很大发展潜力。此外，新型的吸附介质如石墨烯等各种纳米材料、磁性介质等也被大量用于样品前处理，未来实现工业化生产后，将可能大大提高样品前处理的效率11。1.3 免疫分析免疫分析：一种生物化学分析方法，原理是抗原抗体特异性结合，种类包含酶联免疫分析，免疫亲和层析柱等，给予免疫原理的分析方法往往灵敏度高且特异性强12。1.3.1 抗原 抗原(Antigen，Ag)能够刺激机体的免疫系统，然后诱导动物机体发生免疫应答。12抗原最基本的两个特性是：异物性，它在结构上和自身机体不一样，异种物质或者同种异体物质都包含在内；大分子性，一般拥有一万以上的分子质量，并且分子质量越大，抗原的特异性就越强13；免疫原性，一种诱发免疫应答的能力；二：抗原性，与免疫应答产物相反应的能力。根据抗原特质，可把它分为两类： 如表1.2中所示。表1.2 抗原分类不同抗原如何区分定义？不同抗原的独特性来自不同抗原决定簇。这种独特性表现在两个方面：一种抗原仅能引发一种免疫应答；只有由抗原诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞才能与抗原结合。14还有一种普遍的情况：同一类的化合物，某种抗原决定簇也会出现在其他化合物上，这两种化合物拥有重合的部分称为共同抗原表位，也叫交叉抗原(Cross antigen)，能够与类似物刺激产的抗体发生交叉反应(Cross reaction)15。例如：氯霉素，氟苯尼考，甲砜霉素等化合物都是一类结构性质相近的小分子化合物，均属于半抗原。半抗原修饰的方法可以将其转变为完全抗原，用载体连接的小分子才能有免疫原性，进而刺激机体，产生抗体。 1.3.2 抗体图1.1 抗体结构图抗体结构如图1.1所示，它本质上是与特定抗原进行结合得的糖蛋白类免疫球蛋白(Ig)。在体内,抗体是由外源分子的侵袭，免疫系统受刺激而产生的。抗体由 4 条多肽链组成Y形状分子, 其中两条较长、分子量较大的相同的重链；两条较短，分子质量较小的相同的轻链。链间由二硫键和非共价键联结成一个整体分子。轻链有k和两种，重链有、和五种。给定的物种，不同的抗体分子具有几乎相同的顶端链上氨基酸序列和种类，叫做C区，恒定区。16而位于Y形状末端的一小段相对不稳定的部分叫可变区。任何一个抗体位于Y形状末端的部位是抗原结合片段，Fab，柄部是结晶片段，Fc端。1.3.3 抗原抗体反应抗原抗体拥有“锁和钥匙”结构，这种结合可以发生在体内外。这一重要原理是免 疫 分 析 之 基 础。它们之间的结合异常迅速，只需几秒。先以氢键结合脱水，然后紧密结合为成分子间的非共价键。17值得注意的是，抗原和抗体的反应有：特异性、可逆性和比例性。特异性在前文介绍抗原时已经指出，结合的抗原抗体只能一一对应。可逆性指的是当抗原与抗体结合后，还可以重新解离成为游离抗原和抗体的性质，当然这种解离需要与结合时要求不同的特定的条件。而比例性，就是抗原抗体要符合一定比例，合适的比例会使得它们相互之间结合最牢固。抗原抗体两者中任何一个浓度不合适对反应都会有影响。抗原抗体之间的反应受非常复杂的条件影响，有些条件促进结合，有些条件促进解离。精确掌握抗原抗体反映的特性条件，就可以利用免疫亲和的方法来分离并且纯化抗原。181.4 免疫亲和层析柱（IAC）1.4.1 简述及现状随着科研进程中实验的进行与经验的积累，涌现针对各式各样样品适用的预处理方法，在具有针对性强的优势的同时还存在一些不足。而IAC可以克服许多预处理中遇到的问题，从而使实验顺利进行。它利用的是抗原抗体“锁和钥匙”结合而又可逆的原理，因此制备的IAC柱就具有独特的选择性、专一性和良好的吸附净化性，日益成为了一种实用性强度的药品毒素残留检测的净化技术。IAC在食品安全检测中的应用非常广泛，涵盖粮油中的真菌霉素，农产品水产品中兽药的检测，以及一些毒性物质的净化检测。191.4.2 IAC 的原理 免疫亲和柱技术原理是：柱床内装有柱胶，这种柱胶是由特定的单克隆抗体与琼脂糖凝胶交联而成的悬浮物，20这样的抗体交联物，对某种特定抗原有特异性吸附的功能。 由于生物大分子（抗原）和配基（抗体）的结合是专一可逆的，此通过选择适当配基与生物大分子专一性地结合，然后调整洗脱液的组成，将目标物洗脱图1.2 免疫亲和层析原理使其流出亲和柱，最后能够同时达到萃取、纯化、分离，目标物质的成效，方便的进行下一步上机检测。1.4.3 IAC的优势(1) 简化许多繁琐的样品预处理的步骤； (2) 样品纯化回收率高的同时耗时短，达到高效的结果 (3) 经过IAC预处理的样品纯度可以达到很多方法和精密仪器检测的要求。(4) 即使样品复杂也能保证很高的灵敏度 (5) 由于抗原抗体的特异性，IAC具有定性的作用(6) 根据抗体交叉反应的性质，可以用于单组分或多组分分析。21第二章 氯霉素单组分免疫亲和色谱法的建立2.1 氯霉素检测方法的现状目前有关动物源性食品中氯霉素及其代谢物的测定方法主要为理化检测法，如用化学分析法测定虾肉中的氯霉素残留量，测定鱼肉中的氯霉素残留量。但这些方法仪器设备昂贵，操作复杂，灵敏度低，且不适用于大批量样品的检测22 。2.2 氯霉素图2.1氯霉素分子结构2.2.1 氯霉素分类 氯霉素还有其衍生物甲砜霉素，氟苯尼考都是抗生素。从免疫分析学科上来讲，三者具有相似的抗原表位。甲砜霉素的抗菌效果比氯霉素的效果差些，常常用于家禽和羊呼吸道疾病消化系统疾病的预防和治疗。氟苯尼考，是氯霉素的又一种替代品抗菌效果更佳。232.2.2氯霉素检测方法表2.1抗生素氯霉素检测方式242.3 本课题的研究意义及目的经济水平日益提升，民众对生活、对“食”有了进一步质的需求。本实验从氯霉素作半抗原制备的几株单克隆杂交瘤细胞株中遴选出一株细胞2D2，其诱生的单抗腹水样本具有高灵敏度、强特异性。24对所产腹水做了间接竞争的ELISA试验，结果表明该腹水中抗体对氯霉素有极高的检测灵敏度（IC50为0.45ppb）和效价（效价为1：140000），从交叉反应实验也证明了氯霉素单克隆抗体的特异性强（对氯霉素的交叉反应率为100%，对其他免疫交叉率均0.01%）。基于以上所述氯霉素单克隆抗体的有益效果，本实验提供了所述氯霉素免疫亲和层析色谱胶；前处理对象为氯霉素标准品掺入的标准缓冲液以及掺入氯霉素的标准空白虾肉作为模式基质的试样。本实验选用针对氯霉素具有高灵敏度和强特异性识别与结合的单抗，将其作为核心试剂应用于免疫亲和层析胶研制中，其产品对目标物同样具有高选择性、高亲和力等特性；以此作为新型机测样本前处理模式能有效去除待测样本的基质干扰，获得高回收率、高纯度目标物LC-MS/MS作确证和精确定量分析；2526与传统固相萃取前处理模式比较发现，这种新型前处理模式在操作便捷性、样本净化通量、目标物回收率、机测峰型27等指标优于传统理化前处理， 28拓展了HPLC-FLD/LC-MS/MS检测氯霉素残留样本的应用领域。 2.4 实验材料2.4.1 实验试剂2.4.2 溶液配制2.4.3 实验仪器和设备2.5 实验部分2.5.1操作条件 2.5.1.1高效液相色谱条件色谱柱：MGC18，100mm2.0mm（i.d.），粒径5m；（CAPCELL PAK）柱温：40进样量：7.5L滤膜：0.22m水系滤膜流动相：流动相A：MeOH 流动相B: 水流动相梯度洗脱条件：时间A%B%流速（mL/min）0.0020800.31.0020800.33.0090100.34.0090100.35.0020800.3表2.2高效液相色谱梯度洗脱条件2.5.1.2 质谱条件离子源：ESI扫描方式：负离子扫描检测方式：多反应监测电离电压：4.0kV雾化温度：350摄氏度雾化气流速：30L/h碰撞气：氩气CAP定性离子对：320.9257.0或320.9152.0CAP定量离子对：320.9152.0去簇电压：114V碰撞能量：16或24eV2.5.2 抗体的获取与纯化2D2杂交瘤细胞株细胞悬液注射的小鼠的腹腔，一星期后采集腹水，1000 r/min离心10min去细胞去佐剂（浮在上层的免疫致敏剂），取含有抗体的上清后12000r/min 离心30min以去除腹水中细胞碎片，-20冻存备用。纯化前取腹水解冻备用。备塑料柱床，用纯水和PBS （pH=8.0）多次清洗柱床。Protein G对小鼠IgG亲和力强，加4ml 50% Protein G resin胶悬浊液，用PBS （pH=8.0）沉降。PBS （pH=8.0）淘洗50个柱胶体积后柱胶基本压实，取腹水，5000rpm离心去除固态杂质后取上清，用冷PBS （pH=8.0） 三倍稀释，取出20L做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度对照。放液，柱胶将干未干时第一次加腹水，少量多次以防止滴穿，冰浴过5次柱防止抗体失活。最后冷PBS （pH=8.0）再次洗涤50个柱胶体积，最后3次洗涤要求将干未干，防止后续收集时造成死腔。用预冷的Glycine（pH=2.5）将抗体洗脱，接收在预装有100LTris-HCl 8.5缓冲液的EP管中，共接12管。60mL冷Glycine （pH=2.5）洗涤柱，用PBS （pH=8.0）洗50柱胶体积。重复第四步将第二批腹水纯化，结束后用 PBS（pH=8.0）洗涤存放柱胶，并取奇数管20L纯化后抗体做BCA，筛选信号强的管合并置于7500-14000MW透析袋中用PBS （pH=7.4）透析冰箱中进行透析。取20L透析液做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳与原腹水对照，换交联缓冲液(CBS 8.3)继续透析。纯化单抗蛋白，于500mL 0.1M NaHCO3/0.5M NaCl (pH8.3)缓冲溶液中4透析过夜，每4-6h换液一次。图2.2抗体纯化2.5.3 抗体蛋白含量的测定Bicinchoninic acid，聚氰基丙烯酸正丁酯，而BCA试剂盒A液CuSO4与B液NaOH混合，配制一系列标准蛋白梯度孔，加混液200L。蛋白质将AB混和溶液中的Cu2+经双缩脲反应还原为Cu+，BCA 与生成的Cu+高度特异性结合，产生紫色的复合物，蛋白质的浓度越大BCA呈现的紫色越深。在562nm出测定吸光值绘制标准曲线并将样本吸光度带入。由于实验室酶标仪没有562nm光，故采用相近的490nm测定。定量方法还可采用公式：1.51OD280-0.73OD260。2.5.4抗体纯度测定十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） ，根据蛋白质分子量与电荷量的不同通过电泳形成不同运动速度的区带，加以标准质量蛋白质作为参照，可以得知待测蛋白质链的分子量。取样品20L，加等体积的溴酚蓝染料染色，沸水煮10min后，12000r/min离心10min，在聚丙烯酰胺网状凝胶中进行电泳，首先加压200V，30min后用80V继续电泳3h，蛋白质分子的电荷及其分子量差异使其迁移率不同形成不同区带。2.5.5 氯霉素免疫亲和柱的制备根据文献以及经验值，树脂微球和抗体交联的比例关系：1mL胶=0.3g Sepharose 4B 冻干粉=5-8mg单抗。但为保证抗体不浪费，一般多取一些冻干粉。1.将CNBr-activated Sepharose 4B进行溶胀、淘洗，具体操作为：称取CNBr-activated Sepharose 4B冻干粉0.92g，加入溶胀微球的稀HCl 40mL，离心弃上清，加入稀HCl离心洗涤以去除CNBr-activated SepharoseTM 4B胶中其他小分子化学试剂后，再用NaHCO3/NaCl缓冲溶液40mL离心洗涤一次，备用。2.预处理的纯化单抗蛋白中加入至含步骤1所述处理胶的50ml离心管中，盖好并用parafilm膜封口，置于摆床中室温摆动孵育1h，2000r/min离心10min弃上清。稍高的温度可以使树脂微球与抗体结合效率增大。离心管中加入30ml的0.1M NaHCO3/0.5M NaCl缓冲溶液，置于摆床中室温摆动10min，再用与之前相同的条件反复离心洗涤5-6次，由此尽量完全去除未交联的蛋白和一些杂质，即获得抗体-蛋白交联胶。取上清液再做一次BCA蛋白测定，若无紫色则确保交联成功。取步骤2抗体-蛋白交联胶，离心管加入40ml 0.1M Tris-HCl置于摆床中室温摆动孵育2h以充分封闭抗体蛋白交联胶中未与蛋白交联的活化基团，用2000r/min转速离心10min后弃去上清液，装有交联胶的离心管分别用40ml 0.1M HAC-NaAC/0.5M NaCl和40ml 0.1M Tris-HCl/0.5M NaCl两种缓冲液交替进行洗涤离心三个循环，这一步的目的是除去非共价形式的交联，比如弱离子键交联。将交联胶重悬于十倍胶体积0.1M Tris-HCl/0.5M NaCl缓冲液并，如长期不用，要补加防腐抗菌剂0.02% NaN3，于0保存备用，即获得所述免疫亲和层析色谱胶。252.5.6 氯霉素免疫亲和柱的表征2.5.6.1氯霉素免疫亲和柱指标测定氯霉素结合性能指标测定的方法，包括：取纯水配制的1mg/m氯霉素储存液，用纯水将每种药物分别稀释成：0、0.1、0.3、1、5、10、20、30、50、200、400ng/ml十一个浓度点和空白对照点于5ml EP 管中（4ml/管）（经抗体与氯霉素质量比率计算柱容量理论值远小于500ng）。另取11支1.5ml EP管，每管均加入500l免疫亲和层析胶悬液（层析胶实际压积为50l），用0.01M PBS（pH 7.4）离心洗涤二次尽量吸干PBS后，分别将每种药物各浓度点的稀释管液一一对应移入含免疫层析胶EP 管中。将各浓度点结合胶轻轻悬浮后，于摆床室温摆动孵育1h，1000r/min 离心10min弃上清，用0.01M PBS（pH 7.4）离心洗涤3-5次，再用纯水离心洗涤2次，尽量吸干胶中残液。低的pH可以使交联胶结合能力下降，而有机溶剂促进氯霉素洗脱溶解，洗脱液具有挥发性物质可以减少HPLC进样缓冲的步骤，因此选用1ml 0.1% 甲酸 (pH2.2)重悬结合胶，并于摆床室温摆动15min，1000r/min 离心10min。为维护HPLC-MS/MS仪器，将样品均稀释在最终浓度10ng/ml以下，最后分别用1ml一次性注射器抽取每个处理上清800L一一对应用0.22m水系滤膜过滤至进样管，进LC-MS/MS作确证和精确定量测定。进样机测后，判读各浓度点的机测信号：以信号峰：基线峰比值3的对应浓度为检出限；以二者比值10的对应浓度为定量限；以添加标准品各浓度的值作横坐标，以机测信号峰面积作为纵坐标计算每一个浓度样品所对应的回收率；以机测信号换算浓度不再上升对应最小浓度点为最大吸附量。 2.5.6.2 样品处理方法为保证样品中不含有氯霉素残留，基质虾肉为市场采购太湖野生虾。首先要将虾肉进行初步处理：将虾肉样品充分剪碎再加入适量水匀浆，称取每份 2 g 的虾肉泥于 50 m L 离心管中，作为阴性对照的空白样品不加氯霉素，其余分别加入梯度浓度10、20、30、40、50ng/g的标准工作液的氯霉素标准溶液，涡旋混匀。加入3g无水硫酸钠除水，12mL乙酸乙酯萃取CAP，涡旋震荡使得CAP充分被乙酸乙酯萃取出来。6000r/min离心4min除杂，吸取上清液9mL（EA添加量的3/4）于15mL离心管中，50水浴用氮吹仪吹干，加入3mL水复溶，涡旋混匀。加入3mL正己烷除脂，5000r/min离心4min，然后静置 15 min。将正己烷吸出，余下液体取1mL用于上样IAC和SPE柱。这一步进行完后原加标的浓度相当于两倍稀释了。备用过柱。对于奶粉和饲料样品，进行同样的加标处理方法，但不需要除脂除水。2.5.6.3 样品的测定每管均加入500l免疫亲和层析胶悬液（层析胶实际压积为50l），用0.01M PBS（pH 7.4）离心洗涤二次尽量吸干PBS后，分别将加标处理复溶好的样品加入含免疫层析胶EP 管中。将各浓度结合胶轻轻悬浮后，于摆床室温摆动孵育1h，1000r/min 离心10min弃上清，用0.01M PBS（pH 7.4）离心洗涤3-5次，再用纯水离心洗涤2次，尽量吸干胶中残液。选用1ml 0.1% 甲酸 (pH2.2)重悬结合胶，并于摆床室温摆动15min，1000r/min 离心10min。为维护HPLC-MS/MS仪器，将样品均稀释在最终浓度10ng/ml以下，最后分别用1ml一次性注射器抽取每个处理上清800L一一对应用0.22m水系滤膜过滤至进样管，进LC-MS/MS作确证和精确定量测定，最后计算加标回收率。2.5.6.4与国标传统SPE柱净化方法对比根据GB/T18932.19-2003提到的方法：26样品提取同2.5.6.2中所述。净化具体操作为：将Waters HLB小柱用甲醇活化后再用共10mL水清洗3次，此时提前将流速控制在3mL/min。上样过柱，缓慢添加防止CAP大量吸附在柱壁上。待溶液完全流出后，用3mL乙腈+水（10mL乙腈与70mL水混合）洗涤柱。27乙腈水尽量流干，为促进可用洗耳球吹，静置一段时间。最后用3mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液与10mL具塞试管中，与50水浴中用氮气吹干仪吹干，用1-5mL水复溶稀释，涡旋混匀后用加滤膜的注射器分别收集在进样瓶中待上机测定。每管均加入500l免疫亲和层析胶悬液（层析胶实际压积为50l），用0.01M PBS（pH 7.4）离心洗涤二次尽量吸干PBS后，分别将每种药物各浓度点的稀释管液一一对应移入含免疫层析胶EP 管中。将各浓度点结合胶轻轻悬浮后，于摆床室温摆动孵育1h，1000r/min 离心10min弃上清，用0.01M PBS（pH 7.4）离心洗涤3-5次，再用纯水离心洗涤2次，尽量吸干胶中残液。低的pH可以使交联胶结合能力下降，而有机溶剂促进氯霉素洗脱溶解，洗脱液具有挥发性物质可以减少HPLC进样缓冲的步骤，因此选用1ml 0.1% 甲酸 (pH2.2)重悬结合胶，并于摆床室温摆动15min，1000r/min 离心10min。为维护HPLC-MS/MS仪器，将样品均稀释在最终浓度10ng/ml以下，最后分别用1ml一次性注射器抽取每个处理上清800L一一对应用0.22m水系滤膜过滤至进样管，进LC-MS/MS作确证和精确定量测定。2.7 结果与讨论2.7.1 氯霉素抗体浓度的测定 图2.3 BCA标准曲线此为BCA标准蛋白的浓度-吸光度绘制标准曲线，将待测样本两个平行样的吸光度取均值带入曲线，得到抗体的量：3月15日第一批纯化蛋白浓度1.33mg/mL，共10mL，13.3mg；4月1日第二批纯化蛋白浓度1.05mg/mL，共15mL，15.8mg。2.7.2 氯霉素抗体纯度的测定腹水样本通过protein G resin 一步法来纯化单抗蛋白，SDS-PAGE 电泳鉴定结果显示：腹水纯化物仅有含50Kd（抗体重链）和25Kd（抗体轻链）二条明显蛋白条带，无其他杂蛋白带，表明通过该杂交瘤细胞株诱生腹水原料经处理可获得高浓度、高纯度单抗蛋白，可以满足制备免疫亲和层析胶中检测抗体的量和纯度需求。图2.4抗体纯化结果2.7.3 IAC交联程度测定取交联结束后的胶500rpm离心，取上清液再做一次BCA蛋白测定，BCA结果呈现绿色（BCA试剂本身颜色），残余溶液中不存在蛋白质，证明交联成功，吸光度测定显示交联程度大于95%。2.7.4 氯霉素免疫亲和柱特性表征试验浓度（ng/ml）检出限（ng/ml）定量限（ng/ml）结合容量（ng/L）回收率（%）00.10.110.80.30.378.91129.9592.31079.52073.13095.15098.7100106.120020020067.540012.3表2.3氯霉素IAC表征指标由上表可以看出，IAC净化氯霉素用LC-MS/MS检测的灵敏度在0.1ng/mL以下，从0.3 ng/mL到100ng/mL呈现出较好的线性关系，一直到100ng/mL回收率仍维持在较高的范围内。浓度大于200ng/mL时回收率开始有了大幅度下降。故本方法的定量限0.3，有效检测范围0.3-100ng/mL。我们还可以得知结合容量（最大柱容量）落在回收率仍未大幅度下降的范围内，每50L柱胶抗体可以结合200ng氯霉素。 回归方程：y = 118.86 x + -59.84 (r = 0.9938)图2.5 氯霉素标准品IAC标准曲线2.7.5 对比SPE柱净化结果讨论表2.4免疫亲和层析法与固相萃取法对氯霉素掺入虾肉净化后的LC-MS/MS定量对比分析掺入虾肉中浓度(ng/ml)免疫亲和层析法净化固相萃取净化（国标）回收率(%)回收率(%)01083.262.52069.255.53080.760.84077.636.15079.651.2掺入奶粉中浓度(ng/ml)免疫亲和层析法净化固相萃取净化（国标）回收率(%)回收率(%)01106.986.91090.577.15091.873.8经LC-MS/MS测定结果显示：针对系列浓度氯霉素掺入空白虾肉模式待测样本，试样经LC-MS/MS精确定量分析：与固相萃取净化组相比，免疫亲和层析净化组在有效检测浓度域内，免疫亲和层析净化组的回收率显著高于固相萃取净化组的回收率，上述定量指标表明免疫亲和层析作为新型处理模式其处理效果优于传统前处理模式。总结昔年本科生涯匆匆而过，氯霉素单组分免疫亲和色谱法的研究不仅是我的毕业设计，同时它也是我真正科研生活的开端。本课题的确定是基于目前国内对食品安全的日益关注以及实验室的研究背景。该课题具有很大的实际应用价值，研究方法可靠。实验氯霉素单组分免疫亲和色谱法的研究。实验主要是基于实验室成功合成的氯霉素单克隆抗体而制备的免疫亲和柱。预处理方法主要包括免疫亲和柱部分：抗体的纯化、免疫亲和柱的制备、免疫亲和柱的检测限，灵敏度、柱容量等性质测定、与传统SPE柱净化效果的对比、真实样品虾肉的测定。实验的过程并非一帆风顺，纯化好的抗体交联时曾加错了溶液导致前功尽弃，上机测定时标准曲线因为浓度设计的不好结果不好，好在一切磕磕绊绊都得以解决，因为科研人每一步不缺从头再来的勇气。 结果是成功制备了能够在基质中有效提取氯霉素的的免疫亲和柱，进而用 HPLC-MS/MS 进行定性定量检测的分析方法，首先测定了免疫亲和柱自身柱特性，用此种方法处理过的样品检出限在0.1ng/mL以下，定量限是0.3ng/mL，有效检测范围是0.3-100ng/mL，结合容量为每50L胶可以吸附200ng样品。将此种方法应用于实际样品（虾肉）的处理中，回收率为平均值超过了80%，且传统SPE柱回收率平均值在60%以下，数据证明了我们建立的氯霉素免疫亲和预处理方法可靠而准确，对于实际样品的分析实验具有广阔的前景和价值。参考文献1Ireneusz Sowa,Magdalena 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