动物细胞培养理论讲授课件

动物细胞培养实验动物细胞培养实验理论讲授理论讲授（I）指导教师：费晓方指导教师：费晓方20142014年年6 6月月动物细胞培养实验理论讲授（I）指导教师：费晓方2014年6122实验原理：实验原理：细胞培养细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。繁殖的方法。实验原理：细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人3实际应用实际应用：分裂繁殖、分裂繁殖、细胞的接触抑制、细胞的接触抑制、细胞的衰老，细胞的衰老，死亡等生命现象。死亡等生命现象。利用培养细胞制备染色体，利用培养细胞制备染色体，分析外界因素（如理化因素）对细胞的影响，分析外界因素（如理化因素）对细胞的影响，研究细胞癌变等等。研究细胞癌变等等。在细胞培养的基础上发展了细胞融合、细胞杂在细胞培养的基础上发展了细胞融合、细胞杂交等细胞工程技术及单克隆抗体技术。交等细胞工程技术及单克隆抗体技术。借助这种方法可以观察细胞的各种现象及细胞在生理、借助这种方法可以观察细胞的各种现象及细胞在生理、病理或药理状态下的分子机制。病理或药理状态下的分子机制。实际应用：分裂繁殖、借助这种方法可以观察细胞的各种现象及细胞4n动物细胞培养可分为动物细胞培养可分为原代培养原代培养和和传代培养传代培养。原原代培养：代培养：直接从有机体获取的细胞进行的培养。直接从有机体获取的细胞进行的培养。传代培养：传代培养：若将培养细胞洗脱后转移到另外的若将培养细胞洗脱后转移到另外的容器中进行在培养叫做。容器中进行在培养叫做。n目前，动物细胞培养技术已经达到一个新的阶段：目前，动物细胞培养技术已经达到一个新的阶段：从不同分化组织衍生得到的许多类型的细胞能够成从不同分化组织衍生得到的许多类型的细胞能够成功地在培养液中生长、反复传代。在维持一个独特功地在培养液中生长、反复传代。在维持一个独特细胞系长达数月的过程中，记录下细胞的倍增次数细胞系长达数月的过程中，记录下细胞的倍增次数和生长速率是很有用的，以便在合适的时间传代以和生长速率是很有用的，以便在合适的时间传代以及在体外培养中选取不同时间冻存细胞。及在体外培养中选取不同时间冻存细胞。细胞体外培养分类细胞体外培养分类动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。原代培养：直接从有机体5*早期细胞培养，依靠的是精湛的操作技术和尽可能的靠近火早期细胞培养，依靠的是精湛的操作技术和尽可能的靠近火焰一达到细胞的无菌化。焰一达到细胞的无菌化。*目前，目前，超净台超净台是使工作台无菌化最经济有效的手段。是使工作台无菌化最经济有效的手段。（1）超净台的选择，应选择层流超净台。不能选择平流超净）超净台的选择，应选择层流超净台。不能选择平流超净台。超净台应该尽可能的安装紫外灯。台。超净台应该尽可能的安装紫外灯。（2）超净台的维护，超净台的）超净台的维护，超净台的HEPA过滤层应该每一年或一年过滤层应该每一年或一年后由认可的机构进行维修。后由认可的机构进行维修。工作环境及超净台的使用工作环境及超净台的使用*早期细胞培养，依靠的是精湛的操作技术和尽可能的靠近火焰一6（3）使用超净台的方法，在每次使用前，应用紫外灯照）使用超净台的方法，在每次使用前，应用紫外灯照30分分钟。首先打开吹风的开关，在关掉紫外灯，打开日光灯。钟。首先打开吹风的开关，在关掉紫外灯，打开日光灯。点燃酒精灯，开始操作。点燃酒精灯，开始操作。（4）超净台表面的处理。）超净台表面的处理。a.应做到每日清洁，以使操作中溅出的培养液或其它液体及时应做到每日清洁，以使操作中溅出的培养液或其它液体及时被清除而不蓄积，达到杜绝细菌和真菌繁殖的目的。被清除而不蓄积，达到杜绝细菌和真菌繁殖的目的。b.工作台中只限放置每日工作所必需的物品，其他非必须物应工作台中只限放置每日工作所必需的物品，其他非必须物应当除去。当除去。c.日常的清洁工作包括：用日常的清洁工作包括：用70%的酒精或的酒精或10%的新洁而灭擦洗的新洁而灭擦洗工作台。用固定的容器装废弃液。工作台。用固定的容器装废弃液。工作环境及超净台的使用工作环境及超净台的使用（3）使用超净台的方法，在每次使用前，应用紫外灯照30分钟。7细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理用于细胞培养的器材包括：细胞培养瓶，细胞培用于细胞培养的器材包括：细胞培养瓶，细胞培养板，吸管，各种瓶子等。养板，吸管，各种瓶子等。目前，上述器材均可以从商家买到无菌一次性的目前，上述器材均可以从商家买到无菌一次性的用品。但是，成本太高。用品。但是，成本太高。玻璃器材，经过湿热或者干热灭菌后可以反复使玻璃器材，经过湿热或者干热灭菌后可以反复使用。用。不宜进行高温高压灭菌的器材，可以浸泡在不宜进行高温高压灭菌的器材，可以浸泡在70%乙醇中进行消毒，并在超净台上吹干。乙醇中进行消毒，并在超净台上吹干。细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理用于细胞培养的器材包括：细胞8实验者的操作技术实验者的操作技术无菌操作的原则：无菌操作的原则：保证细胞培养板，细胞培养皿，保证细胞培养板，细胞培养皿，细胞培养瓶内部以及吸管包裹层等内部的无菌状态。细胞培养瓶内部以及吸管包裹层等内部的无菌状态。细胞培养应在超净工作台或有空气滤过装置的工作细胞培养应在超净工作台或有空气滤过装置的工作间里进行。间里进行。培养液或其它溶液不应该在工作区以外打开。培养液或其它溶液不应该在工作区以外打开。装吸管或吸头的容器也不应该在工作区以外打开。装吸管或吸头的容器也不应该在工作区以外打开。细胞培养中液体的吸取，均需机械移液装置移取。细胞培养中液体的吸取，均需机械移液装置移取。切勿采用口吸的方法。口吸是最大的微生物污染源，切勿采用口吸的方法。口吸是最大的微生物污染源，更重要的是细胞培养液及成分通过食入或吸入的方更重要的是细胞培养液及成分通过食入或吸入的方式及入人体，可能对研究人员造成伤害。式及入人体，可能对研究人员造成伤害。细胞培养瓶在超净台中打开后，瓶盖应盖顶超下放细胞培养瓶在超净台中打开后，瓶盖应盖顶超下放置与工作台中。置与工作台中。实验者的操作技术无菌操作的原则：保证细胞培养板，细胞培养皿，9细胞的处理以及维持细胞生长所需培养细胞的处理以及维持细胞生长所需培养液的无菌处理液的无菌处理基本培养液基本培养液由必须氨基酸、维生素、无机盐、葡萄由必须氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖和作为生长因子、激素和贴壁因子来源的血清组糖和作为生长因子、激素和贴壁因子来源的血清组成。一般用碳酸氢钠（成。一般用碳酸氢钠（NaHCONaHCO3 3)体系进行缓冲。体系进行缓冲。细胞的生长不仅产生细胞的生长不仅产生COCO2 2，也需要也需要COCO2 2才能生存。所以，才能生存。所以，细胞的培养需要子在细胞的培养需要子在COCO2 2培养箱中培养箱中COCO2 2培养箱中培养箱中COCO2 2的浓度应与培养液中碳酸氢钠平衡。的浓度应与培养液中碳酸氢钠平衡。如果如果COCO2 2的浓度为的浓度为5%5%，则配培养液中应加入，则配培养液中应加入1.97g/L1.97g/L的的碳酸氢钠。碳酸氢钠。培养瓶盖应轻轻的拧上，不要完全拧死，以保证气培养瓶盖应轻轻的拧上，不要完全拧死，以保证气体的交换。体的交换。培养液的培养液的pHpH值应为值应为7.27.2至至7.47.4。细胞的处理以及维持细胞生长所需培养液的无菌处理基本培养液由必10n如果培养的细胞已经被如果培养的细胞已经被污染污染，切勿直接倒掉，应高压灭菌，切勿直接倒掉，应高压灭菌后倒掉处理。后倒掉处理。n湿润的培养箱是常见的污染源。通常由充满液体的托盘提湿润的培养箱是常见的污染源。通常由充满液体的托盘提供培养箱合适的湿度，然而托盘本身及可导致各种细菌和真供培养箱合适的湿度，然而托盘本身及可导致各种细菌和真菌的污染，这种污染还可能存在与培养箱壁上和提供气体的菌的污染，这种污染还可能存在与培养箱壁上和提供气体的管道上。应该定期对培养箱进行加热处理。也可以采用管道上。应该定期对培养箱进行加热处理。也可以采用70%乙醇擦洗表面，并定期更换输送乙醇擦洗表面，并定期更换输送CO2管道，并将该管子浸泡管道，并将该管子浸泡与与20%的含氯漂白剂中消毒。的含氯漂白剂中消毒。n为了防止交叉污染，超净台中每次应进行一种细胞系的操为了防止交叉污染，超净台中每次应进行一种细胞系的操作。作。n不应用的细胞应及时丢弃处理，不应继续放置于培养箱中不应用的细胞应及时丢弃处理，不应继续放置于培养箱中不予理睬。不予理睬。实验者的操作技术实验者的操作技术如果培养的细胞已经被污染，切勿直接倒掉，应高压灭菌后倒掉处理11培养液的培养液的pHpH值应为值应为7.27.2至至7.47.4。高密度细胞使细胞培养液中葡萄糖耗竭并产生高密度细胞使细胞培养液中葡萄糖耗竭并产生COCO2 2和乳和乳酸，在含酚红作为指示的培养液中，培养液将从红色酸，在含酚红作为指示的培养液中，培养液将从红色变为橙色。细胞培养液长时间贮藏在变为橙色。细胞培养液长时间贮藏在4 4CC冰箱中，会冰箱中，会使培养液的使培养液的pHpH值产生变化，变碱，是培养液的颜色呈值产生变化，变碱，是培养液的颜色呈深品红紫色。应用时可用深品红紫色。应用时可用HepesHepes（N-2-N-2-羟乙基哌嗪羟乙基哌嗪-N N-2-2-乙磺酸）调整。乙磺酸）调整。可以向培养液中加入抗生素，比如青霉素，链霉素，可以向培养液中加入抗生素，比如青霉素，链霉素，庆大霉素等，抑制由于操作中的微小失误而导致的低庆大霉素等，抑制由于操作中的微小失误而导致的低水平的感染。但是，有时由于抗生素的加入，也会使水平的感染。但是，有时由于抗生素的加入，也会使感染不易被迅速发现感染不易被迅速发现。细胞的处理以及维持细胞生长所需培养细胞的处理以及维持细胞生长所需培养液的无菌处理液的无菌处理培养液的pH值应为7.2至7.4。细胞的处理以及维持细胞生长12培养液的配制：培养液的配制：商家一般以三种形式提供培养液：商家一般以三种形式提供培养液：1.1.粉末粉末剂剂 （需要实验着配制）（需要实验着配制）2.2.浓缩装（用无菌浓缩装（用无菌水稀释即可）水稀释即可）3.3.无需进一步处理的工作液无需进一步处理的工作液形式。由于粉末剂是其中最便宜的一种，形式。由于粉末剂是其中最便宜的一种，一般实验室较多采用。一般实验室较多采用。配制培养液需要滤菌装置：除菌器、真空配制培养液需要滤菌装置：除菌器、真空泵以及泵以及0.45m0.45m或或0.22 m0.22 m的滤膜。的滤膜。培养液应贮藏在培养液应贮藏在4C4C冰箱中。冰箱中。配好的培养液应在无抗菌素的无菌条件下配好的培养液应在无抗菌素的无菌条件下进行放置，每次配好后留样，培养进行放置，每次配好后留样，培养7272小时，小时，观察培养液确实没有污染后使用。观察培养液确实没有污染后使用。培养液的配制：商家一般以三种形式提供培养液：1.粉末剂（需13细胞计数：细胞计数：1.按上述方法，用胰蛋白酶处理细胞，细胞重悬于按上述方法，用胰蛋白酶处理细胞，细胞重悬于细胞培养液中。细胞培养液中。2.用沾有用沾有70%酒精的棉球擦净细胞计数板和盖玻片，酒精的棉球擦净细胞计数板和盖玻片，盖玻片放好在细胞计数板上。盖玻片放好在细胞计数板上。3.用移液器吸取细胞标本用移液器吸取细胞标本10l，加入，加入10l台盼氏兰台盼氏兰溶液混匀，吸取溶液混匀，吸取10l混合液从盖玻片的一侧将混混合液从盖玻片的一侧将混合液打入盖玻片与计数板之间。合液打入盖玻片与计数板之间。4.在显微镜下，计数或细胞。在显微镜下，计数或细胞。5.计数细胞计数板每一小室中，上下左右角和中间计数细胞计数板每一小室中，上下左右角和中间的大方格中（的大方格中（5个格）的细胞数。个格）的细胞数。细胞计数：1.按上述方法，用胰蛋白酶处理细胞，细胞重悬于细胞14细胞计数：细胞计数：6.在取一细胞样品，同上在细胞板的另一小室计在取一细胞样品，同上在细胞板的另一小室计细胞数。细胞数。7.合计合计10个大方格中的细胞。算出个大方格中的细胞。算出1 10-3ml的的细胞数。（每个大方格胞数。（每个大方格1 10-4ml 10个大方格个大方格 10-3ml溶溶剂）细胞胞总数乘以数乘以1000即得每毫升即得每毫升计数数细胞胞悬液的液的细胞数。胞数。8.计数完数完毕，用双蒸水清洗，用双蒸水清洗细胞胞计数板和盖玻片。数板和盖玻片。用擦用擦净纸擦干。擦干。细胞计数：6.在取一细胞样品，同上在细胞板的另一小室计细胞数15动物细胞培养理论讲授课件16细胞计数：细胞计数：每毫升细胞总数每毫升细胞总数=(A1+B1+C1+D1+E1)+(A2+B2+C2+D2+E2)103 2第一小室的细胞总数第一小室的细胞总数第二小室的细胞总数稀释倍数稀释倍数细胞计数：每毫升细胞总数=第一小室的细胞总数第二小室的细17活力染色：活力染色：*台盼兰染料排斥实验。台盼兰染料排斥实验。*台盼兰配成台盼兰配成0.4%w/v浓度。浓度。*加入细胞后，染料的停留不少于加入细胞后，染料的停留不少于3分钟，不超过分钟，不超过10分钟。分钟。*由于健康细胞能排斥台盼兰染料，但是细胞膜的由于健康细胞能排斥台盼兰染料，但是细胞膜的完整性丧失后，染料可以进入细胞，细胞被染成完整性丧失后，染料可以进入细胞，细胞被染成蓝色。所以，健康的细胞不能染上染色，而死亡蓝色。所以，健康的细胞不能染上染色，而死亡的细胞被染成蓝色。的细胞被染成蓝色。*台盼兰染色方法是一种粗略的活力测定方法，无台盼兰染色方法是一种粗略的活力测定方法，无法区别法区别10%-20%的活力差异。的活力差异。活力染色：*台盼兰染料排斥实验。18