细胞分离和细胞培养课件

细胞分离和细胞培养细胞分离和细胞培养1.细胞分离（cell separation）(1)(1)制备单一细胞悬液制备单一细胞悬液 组织组织 EDTA EDTA 细胞间连接细胞间连接 消化消化 胰酶胰酶 细胞外基质细胞外基质 多细胞悬液多细胞悬液1.细胞分离（cell separation）(1)制备(2)分离不同类型细胞A.A.离心离心 （centrifugationcentrifugation）大小大小 密度密度 形状形状 小小 轻轻 不规则不规则 大大 重重 圆形圆形(2)分离不同类型细胞A.离心（centrifugatB.细胞的黏附性C.C.亲和性表面亲和性表面 轻微震荡轻微震荡 消化基质消化基质B.细胞的黏附性C.亲和性表面 轻微震荡D.流式细胞仪(flowcytometer,FCM)荧光激活细胞分选仪（FACS）原理：原理：用带有荧光的特异抗体标记待用带有荧光的特异抗体标记待分离的细胞，然后在流式细胞仪中分离的细胞，然后在流式细胞仪中选出标记细胞。选出标记细胞。D.流式细胞仪(flowcytometer,FCM)应用：应用：细胞分选细胞分选:1cell in 1cell in 10001000 5000 5000 cells/seccells/sec应用：细胞分离和细胞培养课件E.激光捕捉显微切割技术(Laser capture microdissection,LCM)原理：原理：应用：从组织切片中获取单一细胞应用：从组织切片中获取单一细胞E.激光捕捉显微切割技术(Laser capture m2.细胞培养（Cell culture）从活体组织分离出特定细胞从活体组织分离出特定细胞,在一定在一定的条件下进行培养的条件下进行培养,使之能够继续生使之能够继续生存、生长以至增殖的一种方法。存、生长以至增殖的一种方法。in vivo：用动物做实验用动物做实验 in vitro：用培养细胞做实验用培养细胞做实验 2.细胞培养（Cell culture）细胞分离和细胞培养课件(1)细胞培养的条件A.A.固体表面固体表面B.B.培养基、血清培养基、血清C.C.无菌、抗生素无菌、抗生素D.D.3737、5 5COCO2 2 、9595100100湿度湿度 (1)细胞培养的条件A.固体表面(2)细胞培养的不同阶段 原代培养原代培养原代培养原代培养(primary culture)(primary culture)(primary culture)(primary culture)传代培养传代培养传代培养传代培养(secondary culture)(secondary culture)(secondary culture)(secondary culture)传代传代传代传代细胞系（细胞系（Cell Cell lineline）成功成功成功成功筛选筛选细胞株（细胞株（cell straincell strain）(2)细胞培养的不同阶段传代细胞系（Cell line）成功原代培养原代培养(primary culture):(primary culture):(primary culture):(primary culture):直接从生物体获取细胞进行培直接从生物体获取细胞进行培直接从生物体获取细胞进行培直接从生物体获取细胞进行培养。养。养。养。传代培养传代培养(secondary culture)(secondary culture)(secondary culture)(secondary culture)：将原代培养的细胞连续以一：将原代培养的细胞连续以一：将原代培养的细胞连续以一：将原代培养的细胞连续以一定定定定 比例比例比例比例扩大培养。扩大培养。扩大培养。扩大培养。细胞系细胞系(cell line)(cell line)：原代培养细胞成功传代即为细胞系。原代培养细胞成功传代即为细胞系。细胞株（细胞株（cell straincell strain）：从培养细胞中筛选出的具有特定：从培养细胞中筛选出的具有特定性性 质或标志的细质或标志的细胞群。胞群。原代培养(primary culture):直接从生物体获取功能：功能：保持原分化特性保持原分化特性形态：多不保持原有细胞形态形态：多不保持原有细胞形态 成纤维样细胞成纤维样细胞 上皮样细胞上皮样细胞培养细胞的特点：培养细胞的特点：功能：保持原分化特性培养细胞的特点：（）变异细胞（）变异细胞 可无限增殖、传代可无限增殖、传代 细胞系细胞系（NIH3T3:NIH3T3:19631963年由小鼠成纤维细胞建立）年由小鼠成纤维细胞建立）年由小鼠成纤维细胞建立）年由小鼠成纤维细胞建立）接触抑制接触抑制接触抑制接触抑制:细胞系在固体表面生长繁殖细胞系在固体表面生长繁殖细胞系在固体表面生长繁殖细胞系在固体表面生长繁殖,在互相接触在互相接触在互相接触在互相接触后后后后,即培养皿长满一单层细胞后停止分裂、增殖。即培养皿长满一单层细胞后停止分裂、增殖。即培养皿长满一单层细胞后停止分裂、增殖。即培养皿长满一单层细胞后停止分裂、增殖。细胞系的来源：细胞系的来源：（）变异细胞细胞系的来源：（）由癌细胞建立的（）由癌细胞建立的“癌细胞系癌细胞系”特点特点:可在培养皿中以极高的密度增殖，可在培养皿中以极高的密度增殖，没有扩展的余地时没有扩展的余地时,可向空间生长。可向空间生长。（）正常细胞经诱导建立的（）正常细胞经诱导建立的“转化细胞系转化细胞系”肿瘤病毒肿瘤病毒 放射线放射线 化学致癌物化学致癌物 用癌基因转染正常细胞用癌基因转染正常细胞（）由癌细胞建立的“癌细胞系”(3)细胞克隆（Cell cloning）克克隆隆（cloneclone）：指指由由同同一一个个祖祖先先细细胞胞通通过过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。群体培养（群体培养（mass culture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶 中，让细胞贴壁生长，汇合中，让细胞贴壁生长，汇合(confluence)后形成均匀的单细胞层；后形成均匀的单细胞层；克隆培养（克隆培养（clonal culture）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁 生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。(3)细胞克隆（Cell cloning）克隆（clone）(4)细胞融合(4)细胞融合定义在自然或人工条件下，使二个或二个以在自然或人工条件下，使二个或二个以上细胞合并形成一个细胞的过程。上细胞合并形成一个细胞的过程。定义在自然或人工条件下，使二个或二个以 生物学方法：仙台病毒生物学方法：仙台病毒 化学方法：化学方法：PEG(PEG(聚乙二聚乙二醇醇)物理方法：电脉冲打孔物理方法：电脉冲打孔仪仪促融方法促融方法 促融方法应用A.A.细胞核和细胞质间的相互作用细胞核和细胞质间的相互作用 鸡红细胞鸡红细胞 组织培养组织培养细胞细胞 融合融合红细胞开始合成红细胞开始合成RNA,RNA,并进行并进行DNADNA复制复制应用A.细胞核和细胞质间的相互作用细胞周期相关因子的发现细胞周期相关因子的发现细胞周期相关因子的发现B.膜蛋白流动性C.C.基因定位基因定位B.膜蛋白流动性C.基因定位D.单克隆抗体制备（monoclonal antibody）单一的抗原单一的抗原 一个一个B B淋巴细胞淋巴细胞 特异性抗特异性抗体体 单克隆抗体定义单克隆抗体定义:从单个从单个B B淋巴细胞繁殖淋巴细胞繁殖的细胞克隆可以得到均质的抗体叫的细胞克隆可以得到均质的抗体叫单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体。D.单克隆抗体制备（monoclonal antibody制备过程：1984年Nobel奖 B B淋巴细胞淋巴细胞“不死的不死的”小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞 杂交细胞（杂交瘤）杂交细胞（杂交瘤）B B B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞(产生特异性抗体产生特异性抗体产生特异性抗体产生特异性抗体)肿瘤细胞肿瘤细胞肿瘤细胞肿瘤细胞(在体外无限增殖在体外无限增殖在体外无限增殖在体外无限增殖)将每个杂交瘤细胞分别增殖，就得到很多单一细胞将每个杂交瘤细胞分别增殖，就得到很多单一细胞将每个杂交瘤细胞分别增殖，就得到很多单一细胞将每个杂交瘤细胞分别增殖，就得到很多单一细胞的克隆，一个克隆可以产生一种特异性单克隆抗体。的克隆，一个克隆可以产生一种特异性单克隆抗体。的克隆，一个克隆可以产生一种特异性单克隆抗体。的克隆，一个克隆可以产生一种特异性单克隆抗体。制备过程：1984年Nobel奖 B淋巴细胞“不死的”细胞分离和细胞培养课件三、细胞组分的分级分离三、细胞组分的分级分离1.超速离心 细胞器、大分子 1.超速离心 细胞器、大分子制备细胞匀浆细胞细胞匀浆液匀浆液膜膜细胞器细胞器大分子大分子 方法：方法：低渗透压低渗透压 超声振荡超声振荡 在细胞膜上打孔在细胞膜上打孔 强制通过微孔强制通过微孔 机械破碎或研磨机械破碎或研磨制备细胞匀浆细胞膜方法：低渗透压细胞分离和细胞培养课件.差速离心法:用于分离大小、形状显著不同 的组分，根据颗粒沉降速度不同得以分离.差速离心法:用于分离大小、形状显著不同 的组分.速度沉降用途用途:分离密度相近而分离密度相近而分离密度相近而分离密度相近而大小形状略有差异大小形状略有差异大小形状略有差异大小形状略有差异的组分的组分的组分的组分原理：制备梯度离心介质原理：制备梯度离心介质,分离物按各自的沉降分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。系数以不同的速度沉降而达到分离。梯度梯度特点特点:梯度平缓梯度平缓，密度较密度较低低(5%-20%)(5%-20%)，介，介质的质的 最大密度应小于被分离生物最大密度应小于被分离生物颗粒的最小颗粒的最小 密度。密度。分离效率分离效率:取决于沉降系数间的差异。取决于沉降系数间的差异。.速度沉降用途:分离密度相近而大小形状略有差异的组分细胞分离和细胞培养课件细胞分离和细胞培养课件.平衡沉降用途：分离用途：分离大小、形态相似而大小、形态相似而大小、形态相似而大小、形态相似而密度不同密度不同密度不同密度不同的组分。的组分。的组分。的组分。原理：原理：制备梯度离心介质，制备梯度离心介质，样品各成分在梯度介质中样品各成分在梯度介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。将不同密度的成分分离。特点：介质密度高，陡度大特点：介质密度高，陡度大(20%-70%20%-70%）介质最低密介质最低密 度大于被分离组分的最大密度。度大于被分离组分的最大密度。分离效率分离效率:取决于浮力密度间的差异。取决于浮力密度间的差异。.平衡沉降用途：分离大小、形态相似而密度不同的组分。细胞分离和细胞培养课件细胞分离和细胞培养课件2.非细胞体系由分级分离得到的具有生物功能由分级分离得到的具有生物功能的细胞抽提物。的细胞抽提物。举例：举例：1.1.线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体 2.2.内质网内质网 3.3.蛋白质合成体系蛋白质合成体系2.非细胞体系由分级分离得到的具有生物功能3.层析 分离蛋白质(1)(1)分配层析分配层析 纸层析纸层析 薄层层析薄层层析3.层析 分离蛋白质(1)分配层析 柱层析 分离蛋白质柱层析 分离蛋白质A.离子交换层析 B.凝胶过滤层析 电荷 大小A.离子交换层析 B.凝胶过滤C.亲和层析 D.疏水性层析 亲和 疏水性 基质抗体 基质疏水基团C.亲和层析 D.疏高压液相层析(HPLC）基质粒度小基质粒度小分辨率高分辨率高分离速度快分离速度快高压液相层析(HPLC）基质粒度小4.电泳 分析蛋白质、核酸 (1)1)原理原理 氨基酸带有正、负电荷，因此蛋白质往氨基酸带有正、负电荷，因此蛋白质往往带有净正电荷或负电荷。将含有蛋白质往带有净正电荷或负电荷。将含有蛋白质的溶液加上电场，蛋白质分子就会按照它的溶液加上电场，蛋白质分子就会按照它们的净电荷的多少、大小及形状的不同在们的净电荷的多少、大小及形状的不同在电场中移动，这一技术称为电泳。电场中移动，这一技术称为电泳。4.电泳 分析蛋白质、核酸(1)原理大小大小 电荷电荷 形状形状(2)SDS-PAGE 根据蛋白质分子量、亚单位组成*样品处理样品处理:SDS(SDS(SDS(SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠)2-2-2-2-巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇(2-ME)/(2-ME)/(2-ME)/(2-ME)/二硫苏糖醇二硫苏糖醇二硫苏糖醇二硫苏糖醇(DTT)(DTT)(DTT)(DTT)*支持体支持体:单体丙稀酰胺单体丙稀酰胺 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶凝胶*染染 色色:考马斯亮蓝考马斯亮蓝 特异性蛋白特异性蛋白 (western(western blotting)blotting)大小 电荷 形状(2)SDS-PA细胞分离和细胞培养课件细胞分离和细胞培养课件 Western Western 印迹技术印迹技术 将经聚丙稀酰胺凝胶分离的蛋白带转移至硝酸纤维素将经聚丙稀酰胺凝胶分离的蛋白带转移至硝酸纤维素膜膜,然后将膜与特异性抗体作用然后将膜与特异性抗体作用,膜上特定蛋白条带将与抗体膜上特定蛋白条带将与抗体结合结合,并进一步与酶标记二抗反应并进一步与酶标记二抗反应,最终以发色底物显色最终以发色底物显色而而被检测被检测.基本步骤基本步骤:(1)SDS-PAGE:(1)SDS-PAGE (2)(2)转膜转膜 (3)(3)抗体反应抗体反应 一抗孵育一抗孵育 标记二抗孵育标记二抗孵育 (4)(4)显色显色 Western 印迹技术等电聚焦电泳等电聚焦电泳.双向电泳蛋白质分子量、等电点原理：原理：等电聚焦等电聚焦:等电点等电点 SDS-PAGE:SDS-PAGE:分子量分子量.双向电泳蛋白质分子量、等电点原理：等电聚焦:等电点细胞分离和细胞培养课件5.质谱技术原理：原理：通过测定样品离子的质通过测定样品离子的质/荷比荷比 来进行成分和结构分析的方来进行成分和结构分析的方法。法。应用：应用：蛋白质鉴定蛋白质鉴定（2002年诺贝尔化学奖获得者）年诺贝尔化学奖获得者）5.质谱技术原理：通过测定样品离子的质/荷比（2002年诺贝四.细胞内分子的示踪技术四.细胞内分子的示踪技术1.同位素示踪技术放射自显影术 (autoradiography)将放射性前体物质掺入细胞，使放将放射性前体物质掺入细胞，使放射性分子和细胞内原有的未标记分射性分子和细胞内原有的未标记分子混和，因它们的化学性质相同子混和，因它们的化学性质相同,细细胞就会不加分辨地利用。胞就会不加分辨地利用。1.同位素示踪技术放射自显影术 放射性化合物渗入活细胞放射性化合物渗入活细胞 培养后取样、固定培养后取样、固定,进行光镜或电镜切片进行光镜或电镜切片在暗处把感光乳胶覆盖于切片上，存放在在暗处把感光乳胶覆盖于切片上，存放在暗处暗处在此期间在此期间,放射性同位素衰变使乳胶曝光后放射性同位素衰变使乳胶曝光后显影及定影。根据银粒所在部位，就可知显影及定影。根据银粒所在部位，就可知道细胞中放射性物质的分布。道细胞中放射性物质的分布。具体操作过具体操作过 程程放射性化合物渗入活细胞 具体操作过 程A.细胞内生物大分子的定性、定位 与半定量 蛋白质蛋白质放射性同位素标记的放射性同位素标记的 氨基酸氨基酸 核核 酸酸放射性同位素标记的放射性同位素标记的 碱基碱基A.细胞内生物大分子的定性、定位 与半定量 蛋白质举例：分泌蛋白在细胞内定位分泌蛋白在细胞内定位 将胰岛将胰岛细胞与细胞与3H-亮氨酸亮氨酸共同孵育共同孵育5分钟，分钟，用未标记的亮氨酸冲洗。用未标记的亮氨酸冲洗。在暗处把感光乳胶覆盖在在暗处把感光乳胶覆盖在切片上存放数日。切片上存放数日。放射性同位素衰变使乳胶放射性同位素衰变使乳胶感光，经过显影和定影，感光，经过显影和定影，根据感光乳胶黑色银颗粒根据感光乳胶黑色银颗粒所在位置即可知道细胞中所在位置即可知道细胞中放射物质的分布情况放射物质的分布情况。举例：分泌蛋白在细胞内定位 将胰岛细胞与3H-亮氨酸共举例：大肠杆菌DNA结构的证明举例：大肠杆菌DNA结构的证明B.示踪细胞中几乎所有的过程对放射性分子在细胞内存在部位和化学对放射性分子在细胞内存在部位和化学形式进行追踪，就可测定放射性分子进形式进行追踪，就可测定放射性分子进入细胞后不同时间所在的位置和化学变入细胞后不同时间所在的位置和化学变化（光合作用）。化（光合作用）。B.示踪细胞中几乎所有的过程对放射性分子在细胞内存在部位和化举例：分泌蛋白在细胞内合成、运输及分泌分泌蛋白在细胞内合成、运输及分泌举例：分泌蛋白在细胞内合成、运输及分泌举例：DNA和RNA在细胞内合成过程用用3 3H-H-胸苷、胸苷、3 3H-H-尿苷渗入细胞尿苷渗入细胞 DNADNA在细胞核中合成在细胞核中合成 RNARNA在细胞核中合成在细胞核中合成 并保留在核内并保留在核内 很快累积于细胞质中很快累积于细胞质中举例：DNA和RNA在细胞内合成过程用3H-胸苷、3H-尿2.抗体示踪技术A.A.抗体抗体 +荧光素荧光素 LM(LM(免疫荧光显微镜免疫荧光显微镜)2.抗体示踪技术A.抗体+荧光素 LM(免疫B.抗体+胶体金 EM(免疫电镜)B.抗体+胶体金 EM(免疫电镜)C.ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)抗体酶酶酶酶酶底物底物显色显色C.ELISA(enzyme-linked immunos五、分子生物学技术五、分子生物学技术1.聚合酶链式反应克隆DNA片断 (polymerase chain reaction，PCR)（1 1）反应体系：模板链）反应体系：模板链 DNA DNA 聚合酶聚合酶 dNTPdNTP 引物引物 （primerprimer）（2 2）反应步骤：）反应步骤：变性变性 95 95 退火退火 45456565 延伸延伸 72 72 1.聚合酶链式反应克隆DNA片断 (polymera2.2.核酸电泳核酸电泳2.核酸电泳3.核酸分子杂交精确检测特定核苷酸序列 原理：原理：碱基互补配对碱基互补配对 探针（探针（probeprobe）：）：酶酶 标记物标记物 荧光荧光 放射性同位素放射性同位素3.核酸分子杂交精确检测特定核苷酸序列 原理：碱基互补 Southern blotting DNA细胞中的细胞中的DNADNAprobe Southern blotting DNA细胞中的D细胞分离和细胞培养课件 Northern blotting RNA 细胞中的细胞中的DNADNAprobe Northern blotting RNA .原位杂交技术（in situ hybridization）原理原理 用核苷酸探针对特殊的核苷酸用核苷酸探针对特殊的核苷酸 序列在其原位进行杂交。序列在其原位进行杂交。.原位杂交技术（in situ hybridizati荧光原位杂交（FISH）人类染色体端人类染色体端人类染色体端人类染色体端粒粒粒粒DNADNA的荧光的荧光的荧光的荧光原位杂交照片原位杂交照片原位杂交照片原位杂交照片荧光原位杂交（FISH）人类染色体端3.基因转移技术蛋白质大量表达外源基因外源基因 原核细胞原核细胞 转化转化 真核细真核细胞胞 转染转染 基因扩增基因扩增 蛋白质表达蛋白质表达 胰岛素胰岛素促红细胞生成素促红细胞生成素3.基因转移技术蛋白质大量表达外源基因 原细胞分离和细胞培养课件