疫苗制造基本程序新ppt课件

一、细菌性灭活疫苗制造一、细菌性灭活疫苗制造 细菌性灭活疫苗简称灭活菌苗，种类、苗型甚多，但制造的基本程序差别不大。（一）菌种与种子（一）菌种与种子 1.1.菌种菌种 制苗用菌种多数为毒力强、免疫原性优良的菌株，通常使用1-3个品系，均由中国兽药监察所传代、鉴定、冻干保存和供应。各种用于制造菌苗的菌种应按规定定期复壮，并进行形态、培养特性、菌型、抗原性和免疫原性鉴定，合格菌种准许用于制苗。2.2.种子培养种子培养 将经鉴定符合标准的菌种接种于菌苗生产规程中所规定的培养基进行增殖培养，经纯粹检查、活菌计数达到标准后即为种子液，用于菌苗生产。种子液通常保存于2-8C冷暗处，不得超过规程规定的使用期限。一、细菌性灭活疫苗制造 细菌性灭活疫苗简称灭活（二）菌液培养（二）菌液培养 大量生产的细菌培养方法甚多，既有手工式的，也有机械化或自动化的培养方式。机械化或自动化的培养方式通称为反应缸培养法，可供选择的菌液培养法有：液体静置培养法、液体深层通气培养法、透析培养法及连续培养法等。菌液培养也可采用固体培养法，该方法易获得高浓度的细菌悬液，易稀释成不同浓度，且含培养基的成分较少，所以比较适用于制备诊断用的抗原。（二）菌液培养 大量生产的细菌培养方法甚多，（三）灭（三）灭 活活 灭活菌苗通常根据细菌的特性加入最有效的灭活剂，采取最适当的灭活条件进行，几种灭活菌苗的灭活方法如表6-1所示。菌菌 苗苗菌或毒素菌或毒素灭 活活 方方 法法猪丹毒猪丹毒氢氧化氧化铝菌苗菌苗猪丹毒杆菌猪丹毒杆菌菌液加入甲菌液加入甲醛至至0.2%-0.5%0.2%-0.5%，3737 C C杀菌菌18-24h18-24h。气气肿疽甲疽甲醛菌苗菌苗气气肿疽梭菌疽梭菌菌液加甲菌液加甲醛至至0.5%0.5%，37-3837-38 C C杀菌菌72-96h72-96h。破破伤风类毒素毒素破破伤风梭菌梭菌菌液上清加甲菌液上清加甲醛至至0.4%0.4%，37-3837-38 C C脱毒脱毒21-30d21-30d。肉毒梭菌肉毒梭菌C C型菌苗型菌苗（菌体毒素苗）（菌体毒素苗）C C型肉毒梭菌型肉毒梭菌菌液加加入甲菌液加加入甲醛至至0.8%0.8%，3737 C C杀菌脱毒菌脱毒18d18d。表表6-1 几种灭活菌苗的灭活方法几种灭活菌苗的灭活方法（三）灭 活 灭活菌苗通常根据细菌的特性加入（四）浓（四）浓 缩缩 为提高某些灭活菌苗的免疫力，在培养过程中采取提高菌数的基础上，再通过浓缩方法达到目的。常用的浓缩方法：氧化铝胶吸附沉淀法 离心沉降法 羧甲基纤维沉淀法 以上方法可使菌液浓缩一倍以上。此外，有些细菌在生长过程中产生分子量小的可溶性抗原（如猪丹毒杆菌产生的糖蛋白）也可经氢氧化铝吸附浓缩；将破伤风脱毒液按盐酸食盐法处理，以作进一步精制成提纯破伤风类毒素。（四）浓 缩 为提高某些灭活菌苗的免疫力，在（五）配苗与分装（五）配苗与分装 由于灭活菌苗所用的佐剂不同，所以配苗方法也不相同。猪肺疫氢氧化铝菌苗：可在加入甲醛灭活的同时，按比例加入氢氧化铝胶配制；也可在菌液经甲醛灭活后再按比例加入氢氧化铝胶配苗。有的厂家禽霍乱油佐剂菌苗的配制程序为：于灭菌的油乳剂135m110号白油、11.4m1Span-85、3.6ml Tween80混合液中，在边搅拌下加入等量甲醛灭活菌液配制。配苗和分装：应充分混匀，及时塞塞、贴签或印字。（五）配苗与分装 由于灭活菌苗所用的佐剂不二、细菌性活疫苗制造二、细菌性活疫苗制造 弱毒菌种多系冻干品，由中国兽药监察所传代、鉴定、保存与分发，少数由国家指定单位鉴定、保存与供给。菌种使用前应按规程规定进行复壮、挑选，并作形态、特性、抗原性和免疫原性鉴定，符合标准后方可用于制苗。将检定合格的菌种接种子于规定的培养基，按规定的条件增殖培养，经纯粹检查及有关的检查合格者即可作为种子液。种子液通常在04C可保存2个月，在保存期内可作为菌苗生产的批量种子使用。细菌性活疫苗多指弱毒菌苗，尽管种类与苗型甚多，但基本制造程序相同。（一）菌种与种子（一）菌种与种子二、细菌性活疫苗制造 弱毒菌种多系冻干品，由中 按1%3%量将种子液接种于培养基，然后依不同菌苗要求进行培养。如猪丹毒弱毒菌须在在深层通气培养中加入适当植物油作消泡剂，通入过滤除菌的热空气进行培养制造菌液；又加布氏杆菌猪2号与羊5号弱毒菌经固体表面培养完成后须按规定要求将菌苔洗下制成菌液。菌液于04C暗处保存，待抽样经纯粹、活菌数等检查合格后使用。（二）菌液培养二）菌液培养 为提高某些弱毒菌苗的免疫效果，可进行浓缩，以提高单位活菌数，常用的依缩方法有吸附剂吸附沉降法、离心沉降法等，如于猪丹毒菌液内加入0.2%0.25%羧甲基纤维素(CMC)进行浓缩，也可用离心沉淀浓缩。浓缩菌液应抽样作纯粹、活菌数等检查。（三）浓缩（三）浓缩 按1%3%量将种子液接种于培养基，然后依 经检验合格的菌液，按规定比例加入保护剂配苗，充分摇匀后随即进行分装，分装量必须准确。分装好的菌苗迅速送入冻干柜进行预冻、真空干燥，冻于完毕后立即加塞、抽空、封口，移入冷库保存，并由质检部门抽样检验。（四）配苗与冻干（四）配苗与冻干 经检验合格的菌液，按规定比例加入保护剂配苗，流程图流程图1细菌疫苗和类毒素制造工艺流程细菌疫苗和类毒素制造工艺流程蛋白质、肉浸液等原料蛋白质、肉浸液等原料培养基培养基细菌分离细菌分离菌菌 种种弱毒菌种弱毒菌种配置、灭菌鉴定减毒滤过脱毒纯化加吸附剂吸附检验配制灭菌检验检验配制灭菌原原 料料佐佐 剂剂灭活菌液灭活菌液配苗、乳化配苗、乳化灭活疫苗灭活疫苗培培 养养菌苗原液菌苗原液配配 苗苗活疫苗活疫苗保护剂保护剂类毒素类毒素毒毒 素素纯化类毒素纯化类毒素菌菌 液液分装、冻干分装、冻干分分 装装灭活原原 料料精制类毒素精制类毒素活化活化种子种子流程图1细菌疫苗和类毒素制造工艺流程蛋白质、肉浸液等原料三、病毒性动物组织疫苗制造三、病毒性动物组织疫苗制造 病毒在易感动物体内可大量增殖，但在各器官组织、部位中增殖病毒的量却有很大的差异，利用病毒增殖迅速、含毒量高的组织制造的疫苗称为组织疫苗(tissue vaccine)。动物组织疫苗包括动物组织灭活疫苗和动物组织弱毒活苗两类，前者多数由强毒株制造，如猪瘟结晶紫疫苗、狂犬病羊脑组织疫苗；后者均以弱毒株生产，如猪瘟兔化弱毒乳兔组织疫苗、牛瘟兔化弱毒组织疫苗等。动物质量直接影响到组织疫苗的质量，特别是对疫苗的安全性和效力有着决定性的作用，动物必须符合下列标准：(1)应该是清洁级(二级)以上的等级实验动物，即无规定的人兽共患性病原体动物；(2)应是对所接种病毒易感性高的动物，即在品种、年龄和体重方面合乎要求的实验动物。（一）动物选择（一）动物选择三、病毒性动物组织疫苗制造 病毒在易感动物 种毒既可用抗原性优良、致死力强的自然毒株脏器组织毒或强毒株增殖培养物，也可用弱毒株组织毒种。无论何种种毒都须经纯粹、抗原性和免疫原性检查合格后使用。接种途径依病毒性质和目的而异，例如猪瘟结晶紫苗，采取猪肌肉注射血液毒种；牛瘟兔化弱毒疫苗，以兔耳静脉注射脾淋毒种；狂犬病疫苗，用兔脑毒种接种绵羊脑内途径感染。几种动物常用的接种途径如下：1.脑内注射：颅前后中线5mm平行线与瞳孔横线交叉处。2.静脉注射：家兔由耳静脉注入；鸡自翅下肢静脉注入。3.肌肉注射：选择腿部、胸部、臀部等肌肉丰满处注射。4.皮下注射：家兔和豚鼠可选择在腹部或后腿内注射。5.腹腔注射：家兔与豚鼠可选腹股沟处刺入腹腔。（二）种毒与接种（二）种毒与接种 种毒既可用抗原性优良、致死力强的自然毒株脏器 动物在接种感染后应每天观察和检查规定的各项指标，指标或项目因不同病毒而异。常规观察、检查的项目如食欲、精神和活动状态、体温、粪便、尿和血液变化等。根据观察的征象和检查的结果选出符合要求的发病动物按规定方式剖杀，采取收集含毒量高的器官组织。如猪瘟结晶紫疫苗采取发病猪的血液制备；兔出血症组织灭活疫苗采集病兔肝脏生产；狂犬病疫苗利用发病羊的羊脑组织制造。（三）观察与收获（三）观察与收获 动物在接种感染后应每天观察和检查规定的各项指1 1组织灭活疫苗组织灭活疫苗 采取收获的组织经无菌检验及毒价测定合格后，按规定比例加入平衡液和灭活剂（甲醛、酚、结晶紫等）制成匀浆，然后按不同病毒的灭活温度、时间进行灭活。如狂犬病疫苗配制按脑组织1:4加入含有甘油及1%酚蒸馏水，于360.5C灭活7天制成；猪瘟结晶紫疫苗配制，按血毒4份，结晶紫甘油溶液1份混合，于37C38C灭活68天。2.2.弱毒组织疫苗弱毒组织疫苗 在无菌操作下剔除脏器上的脂肪与结缔组织等，称重后剪碎，加入适最保护剂制成匀浆，然后滤过扣除残渣量，再按滤液中的实际组织量计算稀释倍数，加入余量保护剂和青链霉素5001000U(g/ml)，充分摇匀后置04C冷暗处处理一定时间后作无菌检验与毒价测定。合格者进行分装，冷冻真空干燥制成冻干疫苗。（四）制（四）制 苗苗1组织灭活疫苗（四）制 苗流程图流程图2病毒性组织疫苗制造工艺流程病毒性组织疫苗制造工艺流程动动 物物感染动物感染动物毒毒 株株种种 毒毒灭活病毒液灭活病毒液鉴定培育检验检验配制原原 料料佐佐 剂剂配苗、乳化配苗、乳化灭活疫苗灭活疫苗含病毒组织含病毒组织含病毒悬液含病毒悬液配配 苗苗活疫苗活疫苗保护剂保护剂分装、冻干分装、冻干分分 装装灭活原原 料料种种 子子扩增收获配制纯化病毒悬液纯化病毒悬液接种流程图2病毒性组织疫苗制造工艺流程动 物感染动物毒 株四、病毒性禽胚培养疫苗制造四、病毒性禽胚培养疫苗制造 受精卵必须来自SPF鸡群，至少源于未用抗生素药物的非免疫鸡群，以免受母源抗体的干扰和残留抗生素的影响。从受精卵入孵开始至培养全过程都应保持无菌，要求一定的温度和湿度，且需不断翻动，然后选择。选择一定日龄、发育正常的胚用于接毒培养，58日龄胚适用于卵黄囊接种；911日龄胚用于尿囊腔接种；1012日龄胚适于羊膜腔接种；1112日龄胚用于绒毛尿囊膜接种。痘病毒、正粘病毒、副粘病毒和疱疹病毒等一类生物制品，目前仍然利用禽胚特别是鸡胚制备，如鸡新城疫苗、鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗、犬瘟热鸡胚弱毒疫苗等。禽胚疫苗生产的原材料来源方便、质量比较容易控制，制造程序简单，不需要过高的设备条件，生产的疫苗质量可靠。（一）鸡胚选择（一）鸡胚选择四、病毒性禽胚培养疫苗制造 受精卵必须来自S（二）种毒与毒种继代（二）种毒与毒种继代 目前适应于鸡胚的种毒多系弱毒，包括自然弱毒与人工培育的弱毒两类。各种制苗用的种毒多数由国家菌毒种保藏部门或指定单位保存，保存的种毒多为冻干毒。冻干毒种需按规定要求在鸡胚继代复壮，通常继代3代以上，经检定符合标准后方可作力生产疫苗的毒种，毒种检定内容包括无菌检验、毒价测定和其他项目的检定等。（二）种毒与毒种继代 目前适应于鸡胚的种毒多（三）接毒与收获（三）接毒与收获 鸡胚接毒涉及接毒途径和接毒量两方面。根据不同的病毒与不同疫苗生产程序，选择最佳接种途径和接种量。接种途径：绒毛尿囊膜接种 尿囊腔接种 羊膜腔接种 卵黄囊接种 如鸡新城疫I系和II系毒采取尿囊腔接毒，前者接种103稀释毒种0.1ml，后者接种104稀释毒种0.1ml。鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗采用绒毛尿囊膜接种50-100倍稀释毒0.2ml。1.1.接毒接毒（三）接毒与收获 鸡胚接毒涉及接毒途径和接毒 鸡胚接毒后培养增殖的时间和温度、湿度以及收获的标准与内容物依不同的病毒和不同的疫苗而异。如鸡新城疫I系疫苗，接毒后于38.539C、相对湿度60%70%条件培养增殖，收集接毒后2448h内死亡胚，置010C冷却424h，收获胚液，进行无菌检验，供制备湿苗用。也可收获胚液、胎儿及绒毛尿囊膜混合制成乳剂制备冻干苗。鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗，则收集接毒后48120h内死亡的鸡胚，冷却后采取绒毛尿囊膜、尿囊液、胎儿制造冻干苗用。2.2.培养收获培养收获 鸡胚接毒后培养增殖的时间和温度、湿度以及收获 按规定收获的胚液、胎儿和绒毛尿囊膜乳剂经无菌检验合格后即可进行配苗。1.1.湿苗湿苗 通常于鸡胚液内，按每毫升加入青霉素和链霉素5001000U，放置010C 冷暗处处理后分装。2.2.冻干苗冻干苗 经无菌检验后合格的胚液或胚液、胎儿、绒毛尿囊膜乳剂，按比例加入保护剂，充分混合后滤过，于滤液内按每毫升加入青、链霉素5001000U，混合后分装冻干。3.3.灭活苗灭活苗 收获鸡胚液经无菌检验及毒价测定合格后，按规定比例加入平衡液，按不同病毒的灭活温度、时间进行灭活，加入相应的佐剂，制备成灭活疫苗，放置4-10C保存。（四）配（四）配 苗苗 按规定收获的胚液、胎儿和绒毛尿囊膜乳剂经无菌检流程图流程图2病毒性组织疫苗制造工艺流程病毒性组织疫苗制造工艺流程受精卵受精卵禽禽 胚胚毒毒 株株种种 毒毒灭活病毒液灭活病毒液鉴定培育检验检验配制原原 料料佐佐 剂剂配苗、乳化配苗、乳化灭活疫苗灭活疫苗含病毒尿囊液或禽胚组织含病毒尿囊液或禽胚组织含病毒悬液含病毒悬液配配 苗苗活疫苗活疫苗保护剂保护剂分装、冻干分装、冻干分分 装装灭活原原 料料种种 子子扩增收获配制纯化病毒悬液纯化病毒悬液接种流程图2病毒性组织疫苗制造工艺流程受精卵禽 胚毒 株种五、病毒性细胞培养疫苗制造五、病毒性细胞培养疫苗制造 用于制苗用的种毒应经毒力、最小免疫量、安全性、无菌检定合格，通常为冻干品，由国家指定的苗毒种保藏部门检定分发。领取的种毒应按规定在细胞继代培养适应后用作毒种，制苗用毒种应按规定控制在一定代数以内，或为湿毒毒种，或为冻干毒种。细胞培养疫苗有细胞培养灭活疫苗和细胞培养活疫苗两类，前者多以强毒毒株培养增殖制造，后者则用弱毒毒株增殖生产，两者的制造程序既有相同之处，又有区别。由于病毒不同与疫苗性质不同，所采用的细胞及细胞培养方法也有所不同（一）种毒与毒种继代（一）种毒与毒种继代五、病毒性细胞培养疫苗制造 用于制苗用的种毒应 19071907年年美美国国生生物物学学家家HarrisonHarrison，在在无无菌菌条条件件下下以以淋淋巴巴液液为为培培养养基基成成功功地地在在试试管管中中培培养养了了蛙蛙胚胚神神经经组组织织达达数数周周，创创立立了了体体外外组组织织培培养养法法。在在随随后后的的近近一一个个世世纪纪里里，随随着着细细胞胞生生物物学学、培培养养系系统统及及培培养养方方法法等等领领城城的不断丰富和完善，动物细胞培养技术得到了很大的发展。的不断丰富和完善，动物细胞培养技术得到了很大的发展。发发展展至至今今已已成成为为生生物物、医医学学研研究究和和应应用用中中广广泛泛采采用用的的技技术术方方法法，利利用用动动物物细细胞胞培培养养生生产产具具有有重重要要医医用用价价值值的的酶酶、生生长长因因子子、疫疫苗苗和和单单抗抗等等，已已成成为为医医药药生生物物高高技技术术产产业业的的重重要要部部分分。大大规规模模动动物物细细胞胞培培养养在在生生物技术产业化进程中显示出强大的潜力。物技术产业化进程中显示出强大的潜力。(二二)细胞培养技术细胞培养技术 1907年美国生物学家Harrison，在无动物细胞培养技术的发展动物细胞培养技术的发展动物细胞培养技术的发展细胞培养技术的主要优点细胞培养技术的主要优点 研究的条件可以人为的控制 研究的对象简单 研究的样本较均一性 研究的内容便于观察、检测和记录 研究的范围比较广泛 研究的费用相对较经济细胞培养技术的主要优点 研究的条件可以人为的控制 研究的 细细胞胞培培养养是是指指从从体体内内取取出出组组织织、细细胞胞在在体体外外模模拟拟体体内内生生理理环环境境，在在无无菌菌、适适当当温温度度和和一一定定的的营营养养条条件件下下，使之生存和生长，并维持其结构和功能特性。使之生存和生长，并维持其结构和功能特性。动物细胞培养条件渗透压渗透压水的质量水的质量营养条件营养条件气体条件气体条件温度条件温度条件酸碱度酸碱度无菌条件无菌条件细胞培养细胞培养 细胞培养是指从体内取出组织、细胞在体外模拟 目前合成培养基的种类已有数十种，大多数培养基都是为适应某种组织细胞的生长而在某种合成培养基的基础上改良而来的。目前较为常用的有199培养液、Eagle(MEM、DMEM)培养液、RPMI1640培养液、HAM培养液等。合成培养基的主要成份有：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐，其它辅助物质。基础成分基础成分添加成分添加成分血清、抗生素、碳酸氢钠、缓冲剂等(二二)培养基培养基生长液和维持液生长液和维持液 目前合成培养基的种类已有数十种，大多数培养基(三三)细胞细胞 原代培养物经首次传代成功后即为细胞系,由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代，或传代次数有限,可称为有限细胞系(finite cell line)，如可以连续培养50代以上，则称为连续细胞系(continious cell line)。1.1.原代细胞原代细胞 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代细胞。传代细胞：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中培养获得的细胞。(三)细胞 原代培养物经首次传代成功后即为细胞原代细胞的获取：用直接从机体获得的细胞进行的培养称为原代培养，这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。原代细胞的培养和传代：原代细胞初代培养后，可以传代，但代数有限，细胞特性有一定的变化。原代培养是建立各种细胞系的第一步。原代细胞的获取：传代细胞是指能在体外连续培养的细胞或细胞系，大都数来源于癌变细胞。传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传代法或离心法传代。2.2.传代细胞及培养传代细胞及培养 传代细胞是指能在体外连续培养的细胞或细胞系，动物细胞大规模培养与实验室培养相比，培养条件更严格，控制难度更大，其培养方法可概括为：静止培养法悬浮培养法 转瓶培养法细胞培养方法细胞培养方法固定化培养法 动物细胞大规模培养与实验室培养相比，培养条件单层贴壁培养法 接种后，细胞经过吸附、接触而贴附于基质表面，然后进行生长、分裂繁殖，很快进入对数期。一般数天就长满整个表面，形成致密的单层细胞。最后，贴壁培养的细胞会形成二种形态，成纤维样型细 胞(fibroblast-like cell type)和 上 皮 样 型 细 胞(epithilium-like cell type)。单 层 贴 壁 培 养(monolayer anchoraged-dependent culture)是指把细胞贴附于一定的固体支持表面上进行的单层培养方法，这是是动物细胞培养的一种重要方法。单层贴壁培养法 接种后，细胞经过吸附、接触而 旋转培养是较期培养采用的细胞培养方法，目前仍用于疫苗等生产。转瓶培养主要优点是：旋转培养简单，投资少，经济，可做成支架，大量培养，收获细胞或培养液方便，重复性好，容易放大。表面积增加，处于衡态转动，增加气体交换。旋转培养（转瓶培养）旋转培养（转瓶培养）旋转培养是较期培养采用的细胞培养方法，目前仍 悬浮培养（Suspension culture）是指细胞在反应器内游离悬浮生长的培养过程，主要对于非贴壁依赖性细胞，如杂交瘤细胞等。动物细胞悬浮培养是在微生物发酵的基础上发展而来的，经常借鉴发酵理论和经验，但有自身的特点，由于动物细胞没有细胞壁，不能耐受剧烈的搅拌和通气剪切，对环境适应性差，在悬浮培养中要注意发挥动物细胞的特性。常用的反应器有通气式搅拌混合气升式生物反应器。方法的优点是操作简单，培养条件相对均一，传质和传氧较好，容易放大培养。悬浮培养法悬浮培养法 悬浮培养（Suspension cultur疫苗制造基本程序新ppt课件固定化培养法固定化培养法 固定化培养（immobilization culture）是将动物细胞附着微载体或包埋胶囊内，即细胞固定化后，进行悬浮培养。适宜于贴壁依赖性和非贴壁依赖性细胞的培养。具有细胞密度高、提高了抗剪切力和污染能力等优点，是生产首选方法。吸附法(adsorption method)是通过物理吸附使细胞贴附在固体载体表面的一种固定化方法，如微载体培养和中空纤维培养等。虽然吸附法的操作过程简单，但由于相互作用弱，细胞容易从载体上脱落。包埋法(entrapment method)是将细胞包埋在载体内部的一种固定化方法，分为网格型和微囊型两种。网格型的载体为高分子凝胶细网格，而微囊型的载体为高分子半透膜，直径为几至几百微米，比网格载体小得多。包埋细胞的高分子材料有人工合成的聚合物、琼脂糖凝胶和血纤维蛋白等，最常使用的是海藻酸盐包埋非贴壁细胞和胶原包埋贴壁细胞。包埋的机理是通过物理作用而实现的，如12.5琼脂糖在高温加热下融化，低于4537凝固，与细胞混合，分散在石蜡油中，降低至10，得到0.10.3 mm微球。固定化培养法 固定化培养（immobili（四）接毒与收获（四）接毒与收获 病毒接种培养有同步与异步之分，前者在细胞分装同时或不久接种毒种，进行培养，如猫、犬传染性肠炎疫苗(细小病毒)；后者在细胞形成单层后接种毒种，如猪水疱病弱毒细胞培养疫苗。通常在细胞形成单层后倾去培养液，按1%-2%量接种毒种，经吸附后加入维持液继续进行培养，待出现70%-85%以上细胞病变时即可收获。病毒培养液收获时间和方法依疫苗性质而定，可将培养瓶冻融数次后收集；或加入EDTA-胰蛋白酶液消化分散收取；或在病毒增殖培养过程中可收获5-7次毒液，细胞毒液经无菌检验、毒价测定合格后供配苗用。（四）接毒与收获 病毒接种培养有同步与异步（五）配（五）配 苗苗 1 1灭活疫苗灭活疫苗 不同灭活剂对不同病毒的作用也不同。向细胞毒液内按规定加入灭活剂，在一定的温度下作用一定的时间，有的灭活剂还需加入阻断剂中止灭活。灭活疫苗配置通常都需加入佐剂，充分混合、分装，制成灭活疫苗。2 2冻干苗冻干苗 细胞毒液内按比例加入保护剂或稳定剂，充分混合、分装，进行冷冻真空干燥制成冻于疫苗。（五）配 苗 1灭活疫苗