基因突变重组与检测技术ppt课件

基因突变重组基因突变重组与检测技术与检测技术 卫生部北京医院肖飞临床基因扩增实验室检测临床基因扩增实验室检测培训课程培训课程 基因突变重组临床基因扩增实验室检测培训课程目目 录录内容介绍内容介绍二、基因重组技术二、基因重组技术三、基因突变的检测方法三、基因突变的检测方法1.分子杂交技术分子杂交技术3.高通量基因测序技术高通量基因测序技术一、基因突变的产生与后果一、基因突变的产生与后果2.基因测序技术基因测序技术内容介绍二、基因重组技术三、基因突变的检测方法1.分子杂交目目 录录遗传中心法则回顾遗传中心法则回顾转 录翻 译逆转录复 制遗传中心法则回顾转 录翻 译逆转录DNARNA蛋白质复 制目目 录录第一节第一节 基因突变的产生与后果基因突变的产生与后果 u 点突变点突变 u 基因缺失基因缺失u 插入插入u 基因异位或重排基因异位或重排 u 表观遗传学表观遗传学基因突变的种类第一节 基因突变的产生与后果 点突变 基目目 录录DNA分子中发生碱基对的分子中发生碱基对的 替换替换、增添和、增添和 缺失，而引起的基因序列的改变缺失，而引起的基因序列的改变一、基因突变的定义一、基因突变的定义增增添添缺缺失失替替换换DNA分子中发生碱基对的 替换、增添和 一、基因突变的定义目目 录录基因突变的原因和类型基因突变的原因和类型外界因素物理因素化学因素生物因素内部因素 DNA修复功能减弱类型类型原因原因自然突变人工诱变基因突变的原因和类型外界因素物理因素化学因素生物因素内部因素目目 录录基因突变的特点和意义基因突变的特点和意义意义：意义：新基因产生的途径，是生物变异的根本来源，是生物进化的途径。特点特点普遍性:生物界中普遍存在随机性:可发生在生物个体发育任何时期不定向性：突变无明显偏倚低频性:自然状态下突变频率很低105-10-8多害少利性：多数有害,少数有利基因突变的特点和意义意义：新基因产生的途径，是生物变异的根本目目 录录点突变的实例：点突变的实例：镰刀型细胞贫血症的形成镰刀型细胞贫血症的形成病人的血红蛋白的一条多肽链发生了什么变化？脯氨酸谷氨酸谷氨酸脯氨酸缬氨酸谷氨酸正常异常点突变的实例：病人的血红蛋白的一条多肽链发生了什么变化？目目 录录CTTCTTGAAGAA谷氨酸谷氨酸缬氨酸缬氨酸DNADNAmRNAmRNA氨基酸氨基酸蛋白质蛋白质正常正常异常异常GUAGUACATCATGTAGTA突变突变GAAGAA_原因原因_原因原因根本直接点突变的实例：点突变的实例：镰刀型细胞贫血症镰刀型细胞贫血症CTTGAA谷氨酸缬氨酸DNAmRNA氨基酸蛋白质正常异常G目目 录录与肿瘤相关的常见点突变与肿瘤相关的常见点突变类型基因生长因子Sis,-TGF,生长因子受体 Erb(EGFR),HER2/neu,细胞信号传导因子 H-,K-,N-ras,src,raf,转录因子 N-,c-,L-myc,c-jun,fos细胞周期因子PRAD1(cyclin D)凋亡相关基因bcl-2,bcl-X与肿瘤相关的常见点突变类型基因生长因子Sis,-TGF,目目 录录肿瘤突变肿瘤突变取样的特殊性取样的特殊性注意事项：必须从肿瘤组织中取样Sample Selection byLaser Capture Microdissection肿瘤突变取样的特殊性注意事项：必须从肿瘤组织中取样Samp目目 录录基因缺失基因缺失基因缺失可以是1-2个碱基，也可以是一个片段甚或一个外显子的缺失。基因片段的缺失可使该基因激活，转录异常，使基因正常的生物学功能丧失。在肿瘤发生中，多为抑癌基因的缺失。常见的抑癌基因缺失包括：RB-the retinoblastoma gen p53 gene p16-INK4a 基因缺失基因缺失可以是1-2个碱基，也可以是一个片段甚或一个目目 录录基因插入基因插入基因插入多由病毒感染造成。病病 毒毒肿肿 瘤瘤人类T-淋巴细胞白血病病毒I型白血病人类巨细胞病毒（CMV）血液系统恶性肿瘤嗜肝DNA病毒肝癌人类乳头状瘤病毒（HPV）宫颈癌EB病毒（EBV）鼻咽癌基因插入基因插入多由病毒感染造成。病 毒肿 瘤人类T目目 录录基因异位与重排基因异位与重排指细胞基因组中DNA顺序重新排列组合的现象淋巴细胞白血病淋巴细胞白血病t(9;22):BCR-ABLt(12;21):TEL-AML1t(1;19):E2A-PBX1t(4;11):MLL-AF4髓细胞白血病髓细胞白血病Inv(16):CBF-MYH11t(8;22):AML-ETOt(9;22):BCR-ABL5 partnerClass3 partnerTMPRSS2IERGTMPRSS2IETV1TMPRSS2IETV4HERV-K_22q11.23IIETV1SLC45A3IIETV1C15orf21IIIETV1HNRPA2B1IVETV1KLK2IIETV4CANT1IIETV4ACSL3IIETV1SLC45A3IIERGFLJ35294IIETV1DDX5IVETV1TMPRSS2IETV5SLC45A3IIETV5EST14IIETV1HERVK17IIETV1ETVETV家族常见融合基因家族常见融合基因基因异位与重排指细胞基因组中DNA顺序重新排列组合的现象 淋目目 录录表观遗传学表观遗传学1.概念：基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。2.特征:(1)可遗传；(2)可逆性；(3)DNA不变3.表观遗传学的现象：l(1)DNA甲基化l(2)组蛋白修饰l(3)MicroRNAl(4)Genomic imprintingl(5)端粒酶表观遗传学1.概念：基因的DNA序列不发生改变的情况下，基目目 录录表观遗传学表观遗传学甲基化甲基化表观遗传学甲基化目目 录录表观遗传学表观遗传学组蛋白修饰组蛋白修饰组蛋白（去）乙酰化 De/Acetylation组蛋白甲基化 Methylation组蛋白磷酸化 Phosphorylation组蛋白泛素化 Ubiquitination组蛋白糖基化 ADP-Rybosilation组蛋白与Swi/Snf复合体的结合 Swi/Snf complex,which,in vitro,uses the energy of ATP hydrolysis to disrupt histone-DNA interactions多数化学修饰的化学基团可以减少组蛋白的正电性，从而使其与DNA结合变疏松，使染色质结构发生变化。表观遗传学组蛋白修饰组蛋白（去）乙酰化 De/Acety目目 录录表观遗传学表观遗传学microRNA细胞核内转录后长片段的miRNA（Pri-miRNA)Drosha酶处理70100个nt的发夹结构的RNA（pre-miRNA）运输到胞质Dicer剪切1923个nt组成的成熟的miRNA结合到由RNA介导的RISC或类似相同的复合物中，参与RNA干扰，由miRNA 和 靶基因mRNA的碱基配对引导RISC降解目的片段或是阻碍其翻译过程 表观遗传学microRNA细胞核内转录后长片段的miRN目目 录录表观遗传学表观遗传学microRNAn50的miRNAs位于或靠近肿瘤中易发生改变的染色体区域内.n常见的断裂位点，靠近或在可能的癌基因或抑癌基因范围内n最小扩增区域，可能包含癌基因n最小杂合子缺失区域，通常认为抑癌基因定位在这些区域中n脆性位点（FRA),FRA是容易发生姐妹染色质交换，易位，缺失，扩增的位点，或者质粒DNA和肿瘤相关病毒易插入位点表观遗传学microRNA50的miRNAs位于或靠近目目 录录第二节第二节 基因重组技基因重组技术术 整合整合 基因重组基因重组 转化转化 （自然）（自然）转导转导 转座转座 质粒质粒 基因工程基因工程 BAC （人工）（人工）YAC 基因重组基因重组第二节 基因重组技术 基因重组目目 录录基因重组基因重组整合整合n整合：整合：噬菌体感染大肠杆菌的第一步噬菌体感染大肠杆菌的第一步 噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的 DNA注入菌体中。注入菌体中。此此 DNA可可与细菌染与细菌染色体重组，成为细菌染色体的一部分。色体重组，成为细菌染色体的一部分。n溶原菌：溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。整合了噬菌体基因组的细菌。n裂解：裂解：噬菌体感染大肠杆菌的第二步噬菌体感染大肠杆菌的第二步 DNA利用菌体的酶系统，复制自身及利用菌体的酶系统，复制自身及外壳蛋白，组装成大量新外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并将噬菌体，并将细菌涨破。细菌涨破。基因重组整合整合：噬菌体感染大肠杆菌的第一步目目 录录基因重组基因重组转化转化n转化转化：由外来由外来DNA引引起生物起生物类型改类型改变的过变的过程称为程称为转化。转化。细菌的转化细菌的转化基因重组转化转化：由外来DNA引起生物类型改变的过程称为目目 录录基因重组基因重组转化转化n病毒癌基因病毒癌基因感染宿主细感染宿主细胞后，可整胞后，可整合到宿主染合到宿主染色体上，从色体上，从而使宿主细而使宿主细胞癌变。胞癌变。转染：转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体内的过程。内的过程。基因重组转化病毒癌基因感染宿主细胞后，可整合到宿主染色体上目目 录录基因重组基因重组转导转导n溶原菌中溶原菌中 DNA可以原样地切离出来，可以原样地切离出来，也可以也可以把邻近的宿主把邻近的宿主DNA在切离时带走在切离时带走一部分。后者称一部分。后者称转导转导。n带有宿主带有宿主DNA的噬菌体称的噬菌体称转导噬菌体转导噬菌体。n来源于宿主的基因称来源于宿主的基因称转导基因转导基因。基因重组转导溶原菌中 DNA可以原样地切离出来，也可以把目目 录录基因重组基因重组转位转位n转位转位：一个或：一个或一组基因从一一组基因从一处转到基因组处转到基因组的另一个位置。的另一个位置。n这些游动的基这些游动的基因称为因称为转位子转位子(transposon)。基因重组转位转位：一个或一组基因从一处转到基因组的另一个位目目 录录基因工程技术基因工程技术酶目的基因载体基因宿主基本要素基因工程基因工程(genetic engineering)实现基实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称又称重组重组DNA工艺学工艺学。基因工程技术 酶基本要素基因目目 录录质粒质粒(plasmid)特点特点 能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某些些遗遗传传信信息息,会会赋赋予予宿宿主主细细胞胞一一些些遗遗传传性状。性状。质粒(plasmid)特点目目 录录克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列可可转转录录翻翻译译成成多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。载体载体克隆载体(cloning vector)载体目目 录录目的基因目的基因1.化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列氨基酸序列。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3.cDNA文库文库(cDNA library)4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)（见第（见第22章）章）目的基因1.化学合成法目目 录录重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶-限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶定义定义限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶(restriction endonuclease,RE)是是识识别别DNA的的特特异异序序列列,并并在在识识别别位位点点或或其其周周围切割双链围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H重组DNA技术中常用的工具酶-限制性核酸内切酶定义GGATC目目 录录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；命名Hin d 目目 录录类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGG类酶识别序列特点 回文结构(palindrome)目目 录录Bam HGATCTAGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGEcoRVGATATCCTATAGATCTAG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口Bam HGATGGATCC+GGATCCEcoRVGAT目目 录录不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+EcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco R切割位点Bg重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源目目 录录大肠杆菌大肠杆菌表达系统表达系统酵母酵母表达系统表达系统哺乳细胞哺乳细胞表达系统表达系统几种不同的蛋白表达系统几种不同的蛋白表达系统大肠杆菌表达系统酵母哺乳细胞表达系统几种不同的蛋白表达系统 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO,酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱目目 录录 重组DNA医药产品产 品功 能组织胞浆素原激目目 录录酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他其他酵母人工染色体其他目目 录录人工染色体人工染色体n染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必须要能够自我复制和向子细胞中平均分配。须要能够自我复制和向子细胞中平均分配。它需要它需要3个关键序列，包括个关键序列，包括n自主复制自主复制DNA序列序列（autonomously replicating sequenceautonomously replicating sequence，ARSARS）n着丝粒着丝粒DNA序列（序列（centromere DNA sequencecentromere DNA sequence，CENCEN)n端粒端粒DNA序列（序列（telomere DNA sequence,TELtelomere DNA sequence,TEL）人工染色体染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必须要能够自我复目目 录录人工染色体人工染色体 将将3个关键序列用分子生物学方法拼接起来就得到人造微小染色体个关键序列用分子生物学方法拼接起来就得到人造微小染色体（artificial minichromosome），在大片段），在大片段DNA分子的克隆、基因分子的克隆、基因组分析、基因功能鉴定、基因治疗以及研究染色体结构与功能关系等组分析、基因功能鉴定、基因治疗以及研究染色体结构与功能关系等研究中得到了广泛的应用，具有极为重要的价值。目前，正在研究或研究中得到了广泛的应用，具有极为重要的价值。目前，正在研究或应用的有：应用的有：n n酵母人工染色体酵母人工染色体酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)(yeast artificial chromosome,YAC)n n细菌人工染色体（细菌人工染色体（细菌人工染色体（细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BACbacterial artificial chromosome,BAC）n n哺乳动物人工染色体哺乳动物人工染色体哺乳动物人工染色体哺乳动物人工染色体(mammalian artificial chromosome)(mammalian artificial chromosome)。人工染色体 将3个关键序列用分子生物学方法拼接起来就目目 录录酵母人工染色体酵母人工染色体(Yeast Artificial Chromosome,YAC)酵母人工染色体(Yeast Artificial Chrom目目 录录第三节第三节 基因突变的检测方法基因突变的检测方法 1.分子杂交技术分子杂交技术FISHSouthern blotNorthern blot芯片杂交芯片杂交3.高通量基因测序技术高通量基因测序技术2.基因测序技术基因测序技术化学降解测序化学降解测序Sanger测序测序第三节 基因突变的检测方法 分子杂交技术3.目目 录录前列腺癌细胞中TMPRSS2-ERG融合基因检测（FISH法）荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISH）前列腺癌细胞中TMPRSS2-ERG融合基因检测（FISH目目 录录Southern和和Northern blot原理和应用原理和应用Southern和Northern blot原理和应用目目 录录Southern和和Northern blot原理和应用原理和应用Southern和Northern blot原理和应用目目 录录基因芯片原理基因芯片原理基因芯片原理目目 录录基因芯片原理基因芯片原理 Gene probes（cDNA、DNA）substrate Ready-to-usemicroarrayOligo probesAGCTorarrayer基因芯片原理 Gene probessubstrate R目目 录录基因芯片原理基因芯片原理基因芯片原理目目 录录基因芯片原理基因芯片原理基因芯片原理目目 录录基因芯片原理基因芯片原理基因芯片原理目目 录录基因芯片原理基因芯片原理基因芯片原理目目 录录基因芯片原理基因芯片原理基因芯片原理目目 录录基因测序技术简介基因测序技术简介 他们给他们给DNA 的测序带来了一场革命，分享了的测序带来了一场革命，分享了1980年的诺贝年的诺贝尔化学奖。后来尔化学奖。后来Sanger法发展为自动化测序法，并为人类法发展为自动化测序法，并为人类基因组测序做出了卓越贡献。基因组测序做出了卓越贡献。Fred Sanger 发明的发明的末端合成终止法末端合成终止法(sanger法法)Walter Gilbert发明的发明的化学裂解法化学裂解法 Maxam-Gillbert法法基因测序技术简介 他们给DNA 的测序带来了一场革目目 录录Maxam-Gilbert化学裂解法化学裂解法一个末端标记的一个末端标记的DNADNA片段在几组互相独立的的化学反应片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记的一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNADNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNADNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。标记的分子。Maxam-Gilbert化学裂解法一个末端标记的DNA片段目目 录录基因测序技术简介基因测序技术简介 nG反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。nG+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。nT+C反应：肼（低盐）nC反应：肼（高盐）测定DNA长度250bp。碱基特异性化学切割反应：n硫酸二甲酯（DMS）：使DNA分子中鸟嘌呤（G）上的N7原子甲基化。n肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应。n哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。基因测序技术简介 G反应：DMS使G在中性和高温条目目 录录Maxam-Gilbert化学裂解法化学裂解法Maxam-Gilbert化学裂解法目目 录录末端合成终止法末端合成终止法(sanger法法)原理原理2,3-双脱氧核苷三磷酸（双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）与普通）与普通dNTP不同不同之处在于其脱氧核糖的之处在于其脱氧核糖的3位置少一个羟基，可在位置少一个羟基，可在DNA聚聚合酶作用下通过其合酶作用下通过其5三磷酸基团掺入到正在增长的三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但链中，但ddNTP因缺乏因缺乏3羟基而不能同后续的羟基而不能同后续的dNTP形成形成磷酸二酯键，因此，当正在增长的磷酸二酯键，因此，当正在增长的DNA链末端碱基为链末端碱基为ddNTP时，则链延伸反应终止，不可能继续延伸。这样，时，则链延伸反应终止，不可能继续延伸。这样，在在DNA合成反应混合物的合成反应混合物的4种普通种普通dNTP中加入少量的一中加入少量的一种种ddNTP后，链延伸将与偶然发生却十分特异的链终止后，链延伸将与偶然发生却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始于从用以起始DNA合成引物末端到出现过早链终止的位合成引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离，结果将产生置之间的距离，结果将产生4类寡核苷酸，它们分别终止类寡核苷酸，它们分别终止于模板链的每一个于模板链的每一个A、C、G或或T的位置上。的位置上。末端合成终止法(sanger法)原理2,3-双脱氧核苷目目 录录末端合成终止法末端合成终止法(sanger法法)原理原理双脱氧链终止法的双脱氧链终止法的测序基础测序基础是以是以双脱氧苷三磷酸双脱氧苷三磷酸为循环测序反应的链终止剂。为循环测序反应的链终止剂。末端合成终止法(sanger法)原理双脱氧链终止法的测序基目目 录录末端合成终止法末端合成终止法(sanger法法)原理原理 POHdNTPddNTP POHOH P P P POH末端合成终止法(sanger法)原理 POHdNTPddN目目 录录末端合成终止法末端合成终止法(sanger法法)原理原理5353引物引物模板模板DNAdNTPDNA聚聚合酶合酶ddATPddTTPddGTPddCTP末端合成终止法(sanger法)原理5353引物模目目 录录末端合成终止法末端合成终止法(sanger法法)原理原理末端合成终止法(sanger法)原理目目 录录末端合成终止法末端合成终止法(sanger法法)原理原理末端合成终止法(sanger法)原理目目 录录末端合成终止法末端合成终止法(sanger法法)原理原理末端合成终止法(sanger法)原理目目 录录DNA甲基化的检测DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后,DNA双链中的C转化为U，通过随后的PCR，将U转化为T，但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的 DNA的C发生上述转化，PCR后仍保持为CDNA甲基化的检测DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后,DNA双链目目 录录融合基因的检测融合基因的检测淋巴细胞白血病淋巴细胞白血病t(9;22):BCR-ABLt(12;21):TEL-AML1t(1;19):E2A-PBX1t(4;11):MLL-AF4髓细胞白血病髓细胞白血病Inv(16):CBF-MYH11t(8;22):AML-ETOt(9;22):BCR-ABL融合基因的检测淋巴细胞白血病目目 录录融合基因的测序结果融合基因的测序结果前列腺癌细胞中TMPRSS2-ERG融合基因检测（测序法）融合基因的测序结果前列腺癌细胞中TMPRSS2-ERG融合基目目 录录纯合子和杂合子的测序结果纯合子和杂合子的测序结果纯合子和杂合子的测序结果目目 录录异常测序结果的解读异常测序结果的解读含有插入或含有插入或缺失突变缺失突变模板不纯模板不纯异常测序结果的解读含有插入或模板不纯目目 录录传统测序方法存在长度限制传统测序方法存在长度限制传统测序方法存在长度限制目目 录录高通量测序介绍高通量测序介绍高通量测序介绍目目 录录高通量测序的海量数据分析高通量测序的海量数据分析n基因组学研究n大大降低了测序成本，同时提高了测序效率；n每个flow cell有8个通道n一次单通道的测序可以获取至少500万个读数n每次运行实验可读取10亿个碱基/flowcell n可精确读取重复序列 n样本使用效率极高，所以对少量样本也可以极灵敏精确地检测 n每次测序长度为200 bp左右高通量测序的海量数据分析基因组学研究目目 录录谢 谢谢 谢