分子生物学

Chapter6 基因组学与分子生物学实验技术江西农业大学生物工程系陈明辉江西农业大学生物工程系陈明辉6.1基因组学6.2分子生物学实验技术6.1基因组学1、产生背景及概念背景：1985年提出HGP，随着HGP的提出和实施，产生了基因组学。概念：以分子生物学技术、计算机技术和信息网络技术为研究手段，以生物体内全部基因为研究对象，在全基因背景下和整体水平上探索生命活动的内在规律及其内外环境影响机制的科学。2、基因组学分类根据研究对象分：肿瘤基因组学、植物基因组学、药物基因组学、环境基因组学等。根据研究的重点分：结构基因组学、功能基因组学 3、结构基因组学概念和目的 以全基因组测序为目标的基因结构研究，弄清基因组中全部基因的位置和结构，为基因功能的研究奠定基础。其目的是建立高分辨的遗传图谱、物理图谱、转录图谱和序列图谱。遗传图谱（连锁图谱）：指基因或DNA标志在染色体上的相对位置与遗传距离。CM表示（基因或DAN片段在染色体交换过程中分离的频率）。通过该图谱可分清各基因或DNA片段之间的相对距离与方向，如靠近着丝粒或端粒。物理图谱：指DNA序列上两点间的实际距离。用于确定各遗传标志间的物理距离有两种物理图谱：（1）以已定位的DNA序列标记位点（STS）为位标，以DNA实际长度为图谱距离的基因组图谱。（2）由YAC和/或细菌人工染色体（BAC）连续克隆重叠群组成的物理图谱。转录图谱（表达图谱）：以EST（表达序列标签肽）为位标，根据转录顺序的位置和距离绘制的图谱，它是染色体DNA某一区域内所有可转录序列的分布图，是基因图的雏形。技术：用已在染色体定位的YAC DNA或BAC DNA为探针，与所有可能相关的各组织cDNA文库杂交，寻找其同源克隆并做进一步分析。序列图谱（分子水平的物理图谱）：以某一染色体上所含的全部碱基顺序绘制的图谱。既包括可转录序列，也包括非转录序列，是转录序列、调节序列和功能未知序列的总和。4、功能基因组学与蛋白质组功能基因组学概念：利用结构基因组学提供的信息，以高通量，大规模实验方法及统计与计算机分析为特征，全面系统地分析全部基因的功能。研究角度包括：生物学功能、细胞学功能、发育学功能等。蛋白质组概念：某一物种基因组所能表达的全部蛋白质的组合即5、反向遗传学：在已知基因序列的基础上研究基因的生物学规律，通过功能丧失突变体研究其表型效应。通过同源重组，用突变的基因取代野生型基因，导致功能丧失突变体，进行反向遗传学研究。传统遗传学（正向遗传学）主要研究自发或诱发突变体中某一性状的遗传行为，如控制突变性状的基因数目及其在染色体上的位置、突变性状在后代中的传递规律等。反向遗传学筛选到的突变体有时无突变表型效应的原因：突变表型效应需在特定环境中才表现；基因家族中其他基因功能的代偿。6、现代基因组学的发展需要依赖于分子生物学技术的应用！DNA序列分析、DNA芯片技术cDNA药物基因组学克隆DNA序列的体外扩增与检测转基因技术、基因异体表达、基因敲除、基因沉默技术等eg:RNAi、micRNA、PNA技术、Ribozyme6.1基因组学6.2分子生物学实验技术Biomahui 觉得所有生命科学实验都是基于差异。在遗传学上我们必须找到所有生命科学实验都是基于差异。在遗传学上我们必须找到突变体，才能够知道一个基因到底有什么作用，到底多么重要；在突变体，才能够知道一个基因到底有什么作用，到底多么重要；在各种生化实验上，我们必须设置对照，看看目标根对照有什么差别。各种生化实验上，我们必须设置对照，看看目标根对照有什么差别。很难说你的几个题目有什么本质的区别。但是根据题意去解决问题是必要的。第一题，说“复制相关基因”；那么我们的目标在于：凭什么说它跟复制相关？复制有很多事要做，它作哪一部分（是合成引物，DNA聚合酶,helicase,ssb,topoisoase etc.）;你觉得这些蛋白之间有区别吗？人们是怎么把它们鉴定出来的；同样你现在未知的蛋白也可以这样鉴别出来。说明一个东西在那个过程中起作用，去掉它就行了。你可以用反义RNA,RNAi,抗体，基因敲除等等方法，关键是你的研究对象是什么，原核还是真核；in vivo or in vitro;因为有些东西必须in vivo研究，比方，如果你要观察一个细胞周期的变动。而原核没有RNAi等等。确信它起作用了，才可以用荧光什么的去观察它的动态，或者分布。因为荧光只告诉我们它在哪里，但是不是它在起作用，这无从知道。但它却可以提示哪些蛋白可能跟它相互作用。现在有什么FRET,就是研究相互作用的。http:/ 琼脂糖浓度：一般0.7%的agrose即可，但是如果有特殊需要（如所分离检测的DNA片段太大或太小，则浓度可作调整）电泳电压：60100V 指示剂（上样缓冲液）：含有溴酚兰，指示DNA迁移位置基本流程：制胶：称取适量的agrose，加入电泳缓冲液（TAE/TBE），加热至熔化备用倒胶：将胶槽洗净后晾干，摆好梳子，agrose冷却至65时倒入胶槽，注意不要产生气泡，胶槽放置应水平。上样：待凝胶冷却凝固后，拔取梳子，放入电泳槽，加入电泳缓冲液，并用移液枪赶走点样孔中的气泡，以移液枪将混有上样缓冲液的DNA样品注入点样孔，注意不要刺穿凝胶，同时点上ladder（或Marker，标准DNA）作为参照。电泳：60100V电泳40min左右（根据溴酚兰的迁移位置终止电泳）显色观察：将凝胶放入含有EB（溴化乙锭）（0.5g/ml左右）的工作液中显色5min，在紫外线下观察电泳结果12 3 M 1 2 3 M 1 2 3 1.未酶切质粒；2.EcoRI 单酶切；3.EcoR1+XhoI双酶切2.M.1kb DNA Marker.3、脉冲电场凝胶电泳（pulsed-field gel electropheresis，PFGE）由于电泳槽大小有限，对于分子量大、迁移率小的DNA分子的分离效率较低，如何实现这种DNA的分离？减小agrose的浓度增加样品的迁移距离（PFGE）基本原理：通过改变电场的方向，实现样品的迁移路径的改变，以此增加样品的迁移距离。4、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合交联形成根据丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺比例的不同，其交联程度也各不一样最小可将1个碱基差异的DNA片段区分出来（DNA测序的基础）立式电泳槽6.2分子生物学实验技术6.2.1DNA凝胶电泳6.2.2DNA的变性与杂交6.2.3DNA序列分析6.2.4PCR6.2.5DNA与蛋白质的互作研究6.2.6基因敲除技术与酵母双杂6.2.2DNA的变性与杂交1、DNA的变性与复性dsDNA的稳定因素疏水作用力/氢键/阳离子浓度等dsDNA的变性（denaturation）双链DNA在变性剂或物理因素的作用下解链产生单链的过程。nTm值：双链DNA变性中点时的温度。(midpoint of the temperature range over which DNA is denatured)n增色效应：dsDNA变性形成ssDNA后,其紫外吸收值增加。n变性因素：变性剂/温度/pH等Tm1 Tm21.01.1851.37ODG+C%不同Tm值也不同Evaluation GC%of DNA Tm=69.3+0.41 GC%Tm值受到下列因素的影响：nG+C%，G+C%越大，Tm值越大(相同长度的dsDNA)。nG/C分布，G/C分布越均匀，Tm值越大；G/C分布不均匀时，A/T-rich区域容易形成变形中心，出现增色效应的跳跃现象。n盐浓度，阳离子能有效屏蔽dsDNA内部的静电斥力。n如果DNA片断100bp，长度越长，Tm值越大。DNADNA的复性（的复性（renaturationrenaturation）n复性也称为退火（anneal），是单链DNA相互配对形成双链的过程。来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂交。这一过程决定于单链DNA分子的随机碰撞，符合二级反应动力学方程n影响复性速率因素 阳离子浓度：0.180.2M Na+可消除polydNt 间的静电斥力复性反应的温度：增加分子的扩散运动通常是Tm-25(60-65)，以消除S.S.DNA 分子内的部分二级结构S.S.DNA分子的长度和DNA的动力学复杂性（kinetic complexity,KC）动力学复杂性动力学复杂性：指DNA片段中最小的非重复序列长度，一般来说可把原核生物的染色体长度看作其KC。eg:ATATATAT/AAAAAAA/ATCGATCGATCG的KC分别为2、1、4DNA的初始浓度C0：C0越大，复性越快，分子容易发生随即碰撞S.S,DNA 的初始浓度 C0对复性速率的影响C0t曲线 V=dCt/dt=-KCt2 V：复性速率，即一定时间内单链DNA减少的速率dCt/dt Ct：即该时刻单链DNA的浓度 K：复性常数 若t0为初始时间，C0为初始浓度，对上式积分有：Ct/C0=1/（1+KC0t），据此可作出 C0t曲线 当Ct/C0=1/2时 K=1/Cot(1/2)Cot(1/2)可说明单链DNA复性常数K的大小，而在相同反应体系下各影响复性的因素（初始浓度、离子浓度、温度）都是一致的，复性常数K的大小与单链DNA的KC（动力学复杂程度）成反比！因此：E.coli Cot(1/2)/X Cot(1/2)=E.coli KC/X KC 由Cot(1/2)的比较可以推测未知DNA的长度另另:核酸分子复性也可核酸分子复性也可用于测定用于测定mRNAmRNA的丰度的丰度（Abundance）the average number of molecules per cell利用过量的mRNA与cDNA进行复性，测定其复性动力学曲线，可作出类似于Cot曲线的图，即Rot曲线Figure 3.9 Hybridization between excess mRNA and cDNA identifies several components in chick oviduct cells,each characterized by the Rot of reaction.2 2、核酸的分子杂交、核酸的分子杂交(Molecular Hybridization)(Molecular Hybridization)核酸分子杂交的概念核酸分子杂交的概念：用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。mex-3 RNA detection in embryos by in situ hybridizationA Neg.control:not stainedB:wt（Uninjected）C:wt+antisense RNAD:wt+ds RNA应用应用：可通过特定序列的探针检测样品中是否含有与之同源的核酸序列。基因克隆的筛选酶切图谱制作基因组中特定基因序列的定量和定性检测基因突变分析疾病的诊断、微生物病原体检测特点特点n灵敏度高（1pg互补序列）n速度快（24h）n简单易行核酸分子杂交示意图核酸分子杂交示意图染色体原位杂交分子杂交的类别：分子杂交的类别：根据杂交对象的不同可分为：DNA与DNA（Southern blot）RNA与DNA(Northern blot)另外：Western blot根据杂交对象位置的不同可分为：固相杂交 液相杂交 原位杂交（in situ Hybridization）固相分子杂交固相分子杂交 （1975 E.M.Southern1975 E.M.Southern）Southern blot（Southern印迹）和Northern blot（Northern印迹）技术实际上是分子杂交、DNA凝胶电泳等技术的综合。待测待测RNARNA样品样品 单链单链DNADNA探针探针（M13M13体系合成）体系合成）液相杂交液相杂交 DNA-RNADNA-RNA杂交双链杂交双链 核酸酶核酸酶S1S1（专一降解未杂交的专一降解未杂交的DNADNA和和RNARNA单链）单链）酶解酶解 杂交体系纯化杂交体系纯化 脲脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 放射自显影放射自显影 核酸酶S1保护分析法测定RNA样品中是否含有特定的基因表达产物 待测待测RNARNA样品样品 单链单链RNARNA探针探针 液相杂交液相杂交 RNA-RNARNA-RNA杂交双链杂交双链 RNARNA酶酶（专一降解未杂交的专一降解未杂交的RNARNA单链）单链）酶解酶解 杂交体系纯化杂交体系纯化 脲脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 放射自显影放射自显影RNA酶保护分析法影响核酸分子杂交的因素：探针浓度、长度、复杂性：探针浓度越高，复性速度越快。但双链探针浓度过高会增加自我复性而影响杂交；浓度过高也会增加非特异结合，使杂交背景增强。探针越长扩散速度越慢；复杂性越高，配对难度也增大。离子强度：高离子强度溶液中，正离子可中和DNA链磷酸基团的负电荷，削除相互间的静电斥力，有利于杂交分子形成。温度：通常在低于Tm 20-25的温度下进行杂交。添加剂：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸等，因其表面可吸附DNA探针，使DNA接触面增大，而加速杂交反应。n杂交条件的严谨性：指杂交反应体系中，避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格程度。它主要与杂交反应的温度、离子强度和洗膜的温度有关。实际操作时，一般采用较低严谨性杂交以提高反应速率，以较高严谨性洗膜以尽量洗去非特异性结合和配对较差的探针，以提高特异性。基本流程（以southern blot为例）：分离样品（提取DNA）对样品进行凝胶电泳DNA转膜、固定制备标记探针（同位素标记、荧光标记等）经预杂交后用探针与尼龙膜上的单链DNA相互杂交洗膜，去除非特异性杂交显影（如果是同位素，需要自显影，如果是荧光标记，可直接观察）探针的制备：核酸探针是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段。一般而言，核酸探针带有特殊的标记物。探针的类别：cDNA探针/RNA探针/寡核苷酸探针/PCR扩增产物等探针所携带的标记物应具备的条件：标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同，绝不影响其碱基配对特异性，不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特性。标记探针的检测方法简便、省时、准确可靠、重复性好、灵敏度高。稳定性好、环境污染少、价廉。标记的类型：同位素标记 3H、32P、35S、125I等。非放射性同位素地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。常用的探针标记法：切口移位(平移)法 DNApolI酶等引物延伸法 Klenow酶等末端标记法 末端脱氧核苷酸转移酶；T4-PNP、CIAP Klenow酶等体外转录法 获得RNA探针预杂交：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸或支持介质（尼龙膜等）的非特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非特异位点封闭。在杂前的这些处理过程称为预杂交。常用于预杂交的封闭物变性的非特异性变性的非特异性DNADNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。高分子化合物高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用Denhardt溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。杂交反应炉凝胶成像系统显微图像处理系统6.2分子生物学实验技术6.2.1DNA凝胶电泳6.2.2DNA的变性与杂交6.2.3DNA序列分析6.2.4PCR6.2.5DNA与蛋白质的互作研究6.2.6基因敲除技术与酵母双杂6.2.3DNA序列分析DNA sequencing序列分析的两个基本技术：PAGE：其分辨率能达到1bp，制胶的要求严格（容易发生误差）复制产物的标记：底物（dNTP同位素标记）或引物标记1、Maxam-Gilbert化学修饰法1977年Maxam和Gilbert美首次应用此法测定SV40的基因组（5226），是唯一能直接应用于双链DNA测序的方法。1）基本原理 将末端标记的DNA用 专一性化学试剂在A，T，G，C处进行部分降解，由此得到含有各种长度的具放射性末端标记的四组片断（定点随机中断的DNA片断）；用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同长度的片断；从它的放射自显影图谱上可直接读出DNA的序列。nG系统：pH 8.0 硫酸二甲酯 G m7G C8N9断裂 脱GnA+G系统：pH 2.0 哌啶甲酸（pidine）嘌呤环 N质子化 脱嘌呤 nC系统：1.5 mol/L NaCl 肼（hydrazine）脱C nT+C系统：肼(hydrazine)打开嘧啶环 重新5C环化脱嘧啶2）四个反应体系3）基本流程n待测序DNA单链的末端标记n分别用四个系统处理得到定点随机打断的DNA片断n电泳将这些随机打断的片断分离(按片断长短依次在凝胶中排列开来)n读取数据2、Sanger双脱氧终止法1 1）基本原理）基本原理：以待测序的DNA作为模板，在DNApol的作用下可进行DNA复制，如果在反应体系中添加双脱氧底物，则DNA复制可能发生定点随机终止，即在确定的位点（双脱氧底物与模板配对的位置）随机（在这些位置可能因正常底物的竞争而顺利复制）终止复制，对这些复制的产物进行电泳可根据片断大小与末端的碱基依次排列最终得到模板DNA的序列。O碱基碱基CPOHH12345脱脱氧氧核核苷苷酸酸的的连连接接O碱基碱基CPOHH12345OHH2ODNA的复制是dNTP的5磷酸基团与DNA的3羟基基团发生脱水反应双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸?XO碱基碱基CPHH12345O碱基碱基CPOHH12345OHDNA的复制时若掺入了双脱氧底物，则其3不存在羟基，无法与dNTP发生脱水继续复制ATGCGGTACCAT53测序模板5 TA5TACGCCA5TACGCCATGGTA第一套反应CCC第二套反应四四套套反反应应体体系系1 1-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddATPddATP+ssss模板模板+引物引物2-2-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddCTPddCTP +ssss模板模板+引物引物3-3-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddGTPddGTP +ssss模板模板+引物引物4-4-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddTTPddTTP +ssss模板模板+引物引物双脱氧底物造成复制时的定点随机中断反应电泳(将定点随机中断的复制产物按片断长短依次在凝胶中排列开来)读取数据2）基本流程：思考：思考：对一段ssDNA进行序列分析（双脱氧末端终止法），电泳并自显影，得到图a的图谱（从左向右依次使用的双脱氧底物为ddGTP、ddATP、ddTTP、ddCTP），则该ssDNA的序列为 。A、5-CTGA-3B、5-AGTC-3C、5-GTCA-3D、5-TCAG-3+-ddGTPddATPddTTP ddCTPDNA 自动测序：3、DNA杂交测序法（Squencing by hyheridization,SBH）1）基本原理：基于数学上的推测对于一个确定长度（如12nt）的单链DNA，它与一组随机排列的八核苷酸探针（88）完全杂交的可能组合是12+1-8=5，根据杂交的情况可推测其序列。是一种基于DNA-chip的测序技术。问题在于如何确保这种杂交的准确性！2）DNA芯片DNA chip/micro-array美国“Fortune”杂志预测：2005年仅在美国用于基因组研究的芯片销售额可达到50亿美元。2010年此项销售额将达到400亿美元。鉴于DNA芯片技术领域的飞速发展，美国科学促进会将DNA芯片评为1998年的十大科技突破之一，认为生物芯片技术将是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。1998年6月29日美国宣布正式启动基因芯片计划。n什么是DNA芯片？基因芯片是将大量靶基因（或DNA片段）有序地、高密度地点在玻璃片或硅片或塑料片上等载体上所形成的矩阵。将待侧样品用荧光染料标记制备成探针与芯片杂交，杂交信号用激光扫描仪检测，计算机分析检测结果，可获得类似与传统的点杂交的杂交数据，以达到快速、高效、高通量及平行性的分析生物信息的目的。实际上DNA芯片就是以杂交为基础，应用现代高科技将包含特定信息（特定序列）的DNA集成到一块小的支持介质上，这些固定的DNA能与标记的样品特异性结合，通过一定的手段进行信号检测，这样就可以在这一介质上实现常规杂交检测的目的。目前技术：1.6cm2；40万个点；20个核苷酸；n基因芯片技术流程：芯片制备芯片制备目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。样品制备样品制备生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。杂交反应杂交反应杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。信号检测和结果分析信号检测和结果分析杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。试样处理点阵固定反应或杂交芯片制作标记洗涤检测扫描光刻合成微量点样喷墨纯化、标记光化学检测电化学检测计算处理nDNA芯片的用途：只要是杂交能做到的，DNA芯片就能做到，而DNA杂交做不到的，DNA芯片也能做到n应用举例：应用举例：表达谱芯片在疾病研究中的应用应用表达谱芯片检测人正常肝细胞与肝癌细胞中差别表达的基因将4096条人cDNA制备成表达芯片。（1500条为已知基因，2548未知，16个阴性 对照基因，32个空白点。）提取人正常肝和肝癌组织mRNA.逆转录成cDNA。将Cy3和Cy5荧光分别标记到两条cDNA。与芯片杂交、扫描。计算机数据处理，判断差别表达的基因。结果：筛选出差别表达的基因共有结果：筛选出差别表达的基因共有903903条。条。线粒体相关基因过氧化物酶体相关基因谷胱甘肽代谢相关基因纤粘连蛋白基因某些锌指蛋白基因一些其他代谢相关基因肝癌细胞肝癌细胞/正常肝细胞正常肝细胞核糖体蛋白基因翻译相关基因细胞骨架基因某些锌指蛋白基因酪氨酸磷酸酶基因酪氨酸激酶基因6.2分子生物学实验技术6.2.1DNA凝胶电泳6.2.2DNA的变性与杂交6.2.3DNA序列分析6.2.4PCR6.2.5DNA与蛋白质的互作研究6.2.6基因敲除技术与酵母双杂6.2.4聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）1 1）PCRPCR基本原理基本原理 在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。Kari B.Mullis 1985年年提出体外实现提出体外实现DNA复制的设想复制的设想1988年通年通过热稳定性定性DNApol实现这一一设想想1993年，诺贝尔化学奖年，诺贝尔化学奖Saiki,R.K.,D.H.Gelfand,S.Stoffel,S.J.Scharf,R.Higuchi,G.T.Horn,K.B.Mullis and H.A.Erlich.1988.Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.Science 239:487-491.2 2）历史回顾：）历史回顾：Dr.Mullis received a Nobel Prize in chemistry in 1993,for his invention of the polymerase chain reaction(PCR).The process,which Dr.Mullis conceptualized in 1985,is hailed as one of the greatest scientific accomplishments of the twentieth century,one that revolutionized genetic science and engineering.Mullis developed PCR in 1985.Earlier methods for obtaining a specific sequence of DNA in quantities sufficient for study were difficult,time-consuming,and expensive.Thomas Brock identifies the thermophile bacterium Thermus aquaticus from which heat stable DNA polymerase is later isolated and used in the polymerase chain reaction.n变性变性：加热使双链DNA变为单链n退火退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链 n延伸延伸：耐热DNA聚合酶按53方向催化以引物为起始点的延伸反应n以以上三步为单元循环进行DNA扩增3 3）基本步骤：）基本步骤：模板：对其纯度要求不高，但要求去除干净核酸酶、蛋白酶及有机溶剂引物：根椐待扩增的DNA片段，设计其特异的上、下游引物。耐热DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶，无校正功能（0.1%0.25%）,扩增片断不宜过长，一般3Kb。此外 TaqDNA聚合酶具有类似未端转移酶的功能，能催化dNTP加到DNA的3-OH端(其中对dATP的亲和力较大)，因此PCR产物的末端总是带有两个A。10PCR缓冲液：500mmol/L KClKCl能促进引物与模板的退火 100mmol/L Tris-HCl(pH 8.4，20)维持碱性条件 150mmol/L MgCl2 活化Taq DNA聚合酶 加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。2mmol/L dNTP贮备液：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP 4种脱氧核苷酸。4）相关的组分：5）PCR反应体系：10PCR buffer 10l dNTPmix 各200mol/L 引物1 1mol/L 引物2 1mol/L DNA模板 50ng-1g Taq 酶 2U 加双蒸水至总体积为100l（举例）（举例）（举例）（举例）6）PCR扩增条件 94,300S 94,60S 30cycles 55,60S 72,60S 72,7min（举例）（举例）（举例）（举例）变性复性扩增注意：复性温度和扩增一般应考虑引物的构成；扩增时间应考虑扩增片断的长度：1kb，1min；34kb,34min7 7）PCRPCR产物的积累规律产物的积累规律反应初期，目的反应初期，目的DNADNA片段呈指片段呈指数扩增。数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增扩增DNADNA片段的增加减慢进入片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现相对稳定状态，即出现“停停滞效应滞效应”，又称，又称“平台期平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数，PCR扩增效率以及DNA聚合酶种类和活性，以及非特异产物的竞争等因素。到达平台到达平台期前，期前，TaqDNATaqDNA聚合酶一般要聚合酶一般要进行进行2525次以上次以上PCRPCR循环循环。PCR仪仪nPCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。nPCR反应中有两条引物，即5引物和3引物。设计引物时，通常以信息链为基准，5引物与位于待扩增片段5上游的一小段DNA序列相同，以信息链的互补链为模板，引导信息链的合成，3引物与扩增片段3端的一小段DNA序列互补，引导互补链的合成。PCR反应扩增的就是这一对引物之间的DNA片段。8）PCR引物设计（有专门的引物设计软件）n引物设计的原则：引物设计的原则：引物长度一般为1530个核苷酸。引物过短会使PCR的特异性降低，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度74,亦会影响产物的生成，且合成引物的成本增加。引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。尤其是引物的3端不应有连续3个G和C。否则会使 引物在模板的G+C富集序列区错误配对。引物中G+C的含量 在4555%左右。设计引物时要考虑使3端和5端引物具有相似的Tm值。引物长度要确保解链温度不低于54C引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。按经验，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过3bp。两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3端的互补重叠。n引物设计的原则：引物设计的原则：引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。引物3端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA严格配对。引物3端的最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。引物的5端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子等。在PCR的起始反应中，引物5端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以如此引物参与的PCR产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。9）PCR实验中应注意的事项实验中应注意的事项nPCR实验室的设置样品制备区：这个区域专门用于制备模板，要求：PCR产物和带有待扩增序列的DNA克隆不能在这个区域操作，用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用于操作靶序列。在提取DNA样品和RNA样品时要带手套，并要经常更换。PCR操作区：PCR仪应单独放在另一间实验室。另外，在PCR反应前应注意保持PCR成分不受污染。所用的所有溶液应该没有核酸和核酸酶；所用PCR试剂中的水都是高质量的新鲜蒸馏水；所用试剂都应大体积容器配制，按一次PCR的用量分装保存（保证前后试验的一致性）；所用移液枪头和试管均为灭菌并一次性使用。所用器皿和塑料制品都要严格消毒。n 设置严格对照阳性对照：阳性DNA模板阴性对照：阴性DNA模板试剂对照：无DNA模板n阴性结果应采取的措施用第一次扩增的产物作模板进行第二次扩增增加TaqDNA聚合酶的浓度增加模板量纯化模板增加扩增循环次数适当降低退火温度n出现非特异性产物时应采取的措施增加退火温度减少TaqDNA聚合酶的浓度减少退火及延伸时间减少引物浓度减少扩增循环次数PCR扩增扩增NGF基因（大鼠）基因（大鼠）rat beta-nerve growth factor sequence5-301 gttctacact ctgatcacag cgtttttgat cggcgtacag gcagaaccgt acacagagat361 caatgtccca gagggagact ctgtccctga agaccactgg actaaacttc agcattccct421 ctgacacagcc ctacgcagag cccgcagtgc ccctgctgaa ccaatagctg cccgtgtgac481 agggacgacc cgcaacatca ctgtggaccc caaactgttt aagaaacgga gactccgttc541 accccgcgtg ctgtttagca cccagcctcc caaactgttt aagaaacgga gactccgttc -3Perim 1:(5)gat cgg cgt aca ggc aga ac(3)328-347Perim 2:(3)cgc ggg gtg aac gga gtc tc(5)529-548 预期扩增长度：预期扩增长度：220bpDNA Marker NGF2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp220bp10）PCR的种类nDDRT-PCR（差异显示PCR，differential display PCR）n反向PCR（inverted PCR）n差示差示PCR（DD-PCR）原理：利用特殊设计的随机引物，在RT 的基础上进行PCR，以研究不同基因的表达状况。肿肿瘤瘤组组织织正正常常组组织织n反向反向PCR（inverted PCR)用限制酶消化基因组用限制酶消化基因组DNA，用连接酶将各片段连用连接酶将各片段连接成环状。用限制酶切割已知序列，根据已知序接成环状。用限制酶切割已知序列，根据已知序列设计列设计3端引物和端引物和5 端引物，扩增未知序列。端引物，扩增未知序列。11）PCR的应用n定点诱变：设计引物时对引物进行修改，使其在某些位点上与扩增模板不相配对，但是又不影响引物与模板的退火，这种引物扩增后的到的产物就是在这些不配对区发生了定点突变n分子标记的鉴别：RAPD（random amplified polymorphism DNA，随机扩增多态性DNA）扩增的片断是引物之间的区域，不同个体引物之间的序列长度不同，可以作为物种或个体的一种标记，这是分子水平的标记，也称分子标记n基因克隆：反向PCRnPCR定点诱变Molecular markerMolecular marker（分子标记）（分子标记）显示个体差异的外在表现：显示个体差异的外在表现：形态标记、细胞学标记、生化标记数十种技术问世。万变不离其宗：分子杂交、PCR扩增n电泳、分子杂交为核心 代表：RFLP、DNA指纹n电泳、PCR为核心 代表：RAPD、SSR、AFLPnDNA序列为核心 代表：ITS测序分析Applications of molecular marker种质资源研究品质纯度鉴定（包括DNA指纹鉴定）构建遗传连锁图基因定位（QTL）标记辅助选择比较基因组研究基因克隆（图位克隆）生物起源、进化、医学及法医学nRFLP(RRFLP(Restriction estriction F Fragment ragment L Length ength P Polymorphism)olymorphism)by Botstein(1980)基本原理：物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱。优点:共显性，非常稳定缺点：检测步骤多，周期长，费时、费钱；用作探针的DNA克隆制备、保存不方便；使用放射性同位素，较危险自从人的RFLP图谱构建后，又分别构建了果蝇、牛、大豆、小麦、水稻等多种生物的RFLP图谱。已知一对夫妻的第二个孩子死于一种遗传病，该病由常染色体上的隐性基因控制。该基因区域已发现有几个限制性位点的多态性（A、B、C）该夫妇的RFLP图谱如图：病孩在该基因区的限制性位点如何？病孩的RFLP图谱如何？（填在右图中）1 A 2 B 4 C 5 （单位：kb）+/-+/-+/-+该夫妇可能的限制性位点分别为：AC/ABC：AB/AC F：AC/AC（纯合致死）电泳方向1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112（单位：kb）Ladder F+A +C+A +B +C母亲的RFLP图谱n随机PCR(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)随机扩增多态性DNA基本原理：以短片断(10nt)随机引物扩增DNA，由于不同个体或物种与随机引物结合后，引物之间的区段长度各不相同，其PCR产物大小不同，经电泳可显示出“条形码”，RAPD可用来鉴别个体，常规遗传学分析，群体遗传的研究。多用于植物基因组作图。nAFLPAFLP(Amplified Restriction fragment polymorphism)瑞士Zabeau等1992年发明结合了RFLP和PCR技术的特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术高效性。基本原理：对基因组DNA进行酶切，连上双链人工接头，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行选择性扩增。它将RAPD随机性和专一性扩增巧妙结合，再选用内切酶以达选择的目的。优点：不需要进行分子杂交，通过扩增可直接观察nSSRSSR（Simple sequence Repeat Simple sequence Repeat）=(microsatellitemicrosatellite)=(Short Tandem Repeat,STR)=(Short Tandem Repeat,STR)Satellite DNASatellite DNA：真核生物基因组酶切、离心后，在 主带附近会出现（AT）含量很高的简单高度重复序列,由于没有编码序列,不存在进化压力,变异性高。MicrosatelliteMicrosatellite DNA(DNA(微卫星微卫星DNA)DNA)：一类由几个核苷酸（一般1-5个，基序很短）为重复单位串联而成的DNA序列。继RFLP之后的第二代分子标记多态性好、重复好、共显性标记(人们首先在人类基因组内发现了一些简单重复序列，如（AT）n/（TA）n、（ATT）n/（TAA）n等，这些重复序列的变异极高，在其他动植物也有类似现象，人们称其为微卫星（mirosattelite）。SSR就是指微卫星DNA由于重复次数不同以及重复程度的不完全而造成的每个座位的多态性。SSR标记系统前期工作较为复杂，涉及到DNA序列分析及引物合成，工作量大、费用高。不过，一旦得到引物，应用起来与RAPD一样简单，而且该标记属于单位点标记系统。)遗传标记的特点：多态性；孟德尔遗传。亲子鉴定 位点I 位点II 位点III 位点IV 位点V 父：30/15 100/100 60/20 45/60 20/40母：45/60 100/60 30/75 15/45 30/30子I:45/15 60/100 75/60 60/45 30/40子II:60/45 100/100 30/40 15/60 30/30微卫星DNA已在小鼠中发现了6000多个位点。n单个核苷酸的多态性SNP(single nucleotide polymirphism)在不同个体之的基因组之间某一位点的单个碱基不同，在群体中形成了多态性。人类基因组中：1 SNP/1kbDNA 大豆：34 SNP/kb人类 基因组中约330百万个SNPSNP的分布:基因的DNA：1SNP/2kb 非基因的DNA：1SNP/500bp在编码区和非编码区SNP的分布差异给作图提供了 标记。由于特殊的SNP和某些疾病风险增加成正相关，因此这些多态性可作为该疾病相关的SNP。6.2分子生物学实验技术6.2.1DNA凝胶电泳6.2.2DNA的变性与杂交6.2.3DNA序列分析6.2.4PCR6.2.5DNA与蛋白质的互作研究6.2.6基因敲除技术与酵母双杂6.2.5DNA与蛋白质的互作研究1、凝胶阻滞检测蛋白质是否能与DNA结合，将DNA片断分离后，一份直接跑电泳、另一份与相应蛋白质混合后电泳，如果处向迁移率的改变则说明存在某些蛋白质的结合位点！2、DNaseI足迹法：确认蛋白质结合位点的大小、位置等DNA被蛋白质结合后，由于蛋白质的构象保护，DNaseI不能降解这一结合位点，如果对该DNA进行一端的末端标记，并控制好DNaseI的酶量和作用时间，可将该DNA切割成大小不等的DNA片断而蛋白质保护区域不被酶解，这段区域到标记末端的片断是缺失的，对其电泳，可找出蛋白质结合位点的精确位置如Sextama Box等位置的确定另外，可用硫酸二甲酯代替DNaseI，可以判断蛋白质的紧密结合位点6.2分子生物学实验技术6.2.1DNA凝胶电泳6.2.2DNA的变性与杂交6.2.3DNA序列分析6.2.4PCR6.2.5DNA与蛋白质的互作研究6.2.6基因敲除技术与酵母双杂6.2.6基因敲除技术与酵母双杂nGene knock-out基于同源重组的一种功能基因研究技术，以无功能的同源片段通过重组将正常胚胎细胞（ES-Cell）中的基因取代，将这种发生基因缺失的胚胎细胞培养成个体，观察该个体在某基因缺失时的表型差异以推断该基因的功能。通常会在无功能的同源片段中添加一段抗性基因，以便于筛选！n酵母双杂合体系（Yeast Two Hybrid System）由于转录因子是由DNA结合结构域和转录激活结构域共同构成的，将这两个结构域的编码基因拆分，分别与其他蛋白质ORF融合，这种融合基因的产物中未知蛋白质能相互作用，则转录因子能正常行使功能，最终是报告基因表达。本系统就是用于研究蛋白质之间的相互作用。Indirect detection of protein expression and interactionslacZ reporter genelacZ reporter geneyeast two-hybridyeast two-hybridu如果都是已知蛋白质，且能相互作用，根据报告基因的表达情况能推断这些蛋白质的表达与否u如果一个是已知蛋白质，一个是未知蛋白质，在该系统中同时表达，此时报告基因也表达则说明未知蛋白质能与该蛋白质相互作用使用的转录因子是GAL4（半乳糖代谢基因转录因子）思考：1、名词解释：RFLP、RAPD、AFLP、SNP、变性、复性、Tm值、分子杂交、反向遗传学2、DNA复性时的影响因素有哪些？3、Tm值的影响因素有哪些？4、试说明DNA chip的基本原理及其应用5、核酸分子杂交的应用及其种类有哪些？6、Southern blot的基本流程如何？应注意些什么？7、PCR反应体系有哪些组分？其功能如何？8、PCR的基本原理是什么？其基本流程如何？9、PCR有哪些应用？10、DNaseI足迹法的基本原理如何？其作用是什么？11、试说明酵母双杂合体系的基本原理及其应用。12、DNA Sequencing 的基本方法有哪些，其基本原理如何？Measuring gene expression gene fusionsUsing reverse transcriptase PCR to monitor gene expressionProcedure:Treat extracted cellular nucleic acid with nucleaseUse RT to make a DNA copy of the mRNAUse PCR to amplify the DNA copyVisualize amplified DNA fragment on a gelQualitative measureReal time RT-PCR uses fluorescent nucleotides to detect the amplified DNA early in the amplification processMicroarray-Measuring gene expression for many genes at a time(三)噬菌体展示 酵母双杂交适合于鉴别蛋白之间的相互作用，但很多重要分子间相互作用是发生在蛋白质(如细胞表面受体)和和一种扩散性小分子(如配基)之间,酵母双杂交显得无能为力，对这一类受体蛋白cDNA文库的筛选George Smith等发展了一种方法，用M13来表达噬菌体衣壳融合蛋白,这种蛋白可以共价连接的方式附着在塑料盘子的底部。由于融合蛋白是在噬菌体的外侧表达的，是否能结合到塑料盘子上就可将噬菌体分开。方法：(1)将随机的多肽DNA弹夹(random peptide DNA cassette)插入到基因III的编码序列中，使在噬菌体颗粒的表面出现各种不同的蛋白质和多肽，此即是通常所说的多肽文库。(2)然后通过免疫吸附或亲和层析分离出特定的目标噬菌体。(3)扩增阳性噬菌体。(4)用ELISAs 进行分析鉴定。六.不同表达基因的筛选和扩增(一)差异展示反转录PCR(differential display reverse transcriptase PCR，DDRT-PCR)Liang P.(1992)建立此法，用来分离变异细胞中的特异RNA，它可用来由少量mRNA产生cDNA,以鉴别细胞间的表达差异。DDRT-PCR的关键是采用经修饰的寡聚dT引物用于反转录，即polyA+mRNA 在引物的3端的双核苷酸的差异退火。Achilles heel cleavage(AHC)阿奇里斯踵部剪切阿奇里斯踵部剪切:一种在特定位点剪切DNA分子的技术。阿奇里斯(Achilles)是荷马史诗中的希腊英雄，传说他除踵部外其全身刀枪不入。阿奇里斯的母亲在冥河里(希腊神话中说死者经此河被载渡至冥府)舀到他，他母亲抓着他的脚后跟，除此以外，其他部位都是由水制成的，使他无懈可击。在ACH程序中一个序列特异的DNA-结合分子与被研究的DNA形成复合体，除隐藏在序列特异DNA-结合分子下面的以外，由甲基转移酶将甲基加到所有的CpG序列上。下一步除去此分子和甲基转移酶，而加入限制性内切酶，这样仅在DNA的非甲基化区域即阿奇里斯踵部剪切。