第十三章--体外受精与动物克隆技术

第十三章第十三章-体外受精与动体外受精与动物克隆技术物克隆技术第一第一节胚胎工程胚胎工程 胚胎工程是在胚胎移植技术上发展起来的现代生物技术，在畜牧业生产胚胎工程是在胚胎移植技术上发展起来的现代生物技术，在畜牧业生产和临床上具有广泛的应用，它主要包括体外受精技术、胚胎移植技术、胚和临床上具有广泛的应用，它主要包括体外受精技术、胚胎移植技术、胚胎分割技术、胚胎冷冻保存技术和性别控制技术等。近胎分割技术、胚胎冷冻保存技术和性别控制技术等。近30年来，随着生物年来，随着生物技术的发展，胚胎工程技术也日新月异，在促进畜牧业发展及其相关领域技术的发展，胚胎工程技术也日新月异，在促进畜牧业发展及其相关领域研究中取得了令人瞩目的成就。研究中取得了令人瞩目的成就。一、一、体外受精体外受精 体外受精体外受精(In Vitro Fertilization，IVF)是指哺乳动物的精子和卵子在是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，它的基本原理是在人工模体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，它的基本原理是在人工模拟体内环境，包括营养、温度、湿度、气体、渗透压、拟体内环境，包括营养、温度、湿度、气体、渗透压、pH等），使卵丘等），使卵丘卵母细胞复合体中的初级卵母细胞成熟，同时使精子获能，完成受精。卵母细胞复合体中的初级卵母细胞成熟，同时使精子获能，完成受精。1959年，张明觉以家兔为实验材料，从一只交配后年，张明觉以家兔为实验材料，从一只交配后12h的母兔子宫中的母兔子宫中冲取精子冲取精子(即体内获能的精子即体内获能的精子)，从另外两只超数排卵处理母兔的输卵管中，从另外两只超数排卵处理母兔的输卵管中收集卵子，精子和卵子在体外人工配制的溶液中完成受精过程，然后，正收集卵子，精子和卵子在体外人工配制的溶液中完成受精过程，然后，正常卵裂的常卵裂的36枚胚胎被移植到枚胚胎被移植到6只受体兔的输卵管中，其中只受体兔的输卵管中，其中4只妊娠，并产下只妊娠，并产下15只健康仔兔，这是世界上首批试管动物，它们的正常发育标志着体外受只健康仔兔，这是世界上首批试管动物，它们的正常发育标志着体外受精技术的建立。精技术的建立。u试管小鼠试管小鼠(Whit-tingham，1968)u大鼠大鼠(Toyoda和和Chang，1974)u婴儿婴儿(Steptoe和和Edwards，1978)u牛牛(Brackett等，等，1982)u山羊山羊(Hamda，1985)u绵羊绵羊(Hanada，1985)u猪猪(Chang等，等，1986)u牛（牛（Parrish等，等，1986）体外受精技术主要包括以下几个主要方面：体外受精技术主要包括以下几个主要方面：精子的采集与获精子的采集与获能能、卵子的回收及成熟培养卵子的回收及成熟培养、体外受精体外受精、受精卵的体外发育受精卵的体外发育及试管胚胎的移植及试管胚胎的移植等。等。1.精子的获能处理精子的获能处理 张明觉张明觉Austin 1951年发现兔子和大白鼠直接排出的精子不能使卵受年发现兔子和大白鼠直接排出的精子不能使卵受精，必须在生殖道中停留一段时间后才具备受精能力，这一现象称为精精，必须在生殖道中停留一段时间后才具备受精能力，这一现象称为精子的获能（子的获能（capacitation）。）。精子的获能过程是多时期、多步骤的复杂变化过程，包括两个阶段，精子的获能过程是多时期、多步骤的复杂变化过程，包括两个阶段，获能的第一阶段是脱出精子表面的抗原物质和去能因子获能的第一阶段是脱出精子表面的抗原物质和去能因子（Decapacitation Factors，DF），增强了膜通透性。第二阶段是精子），增强了膜通透性。第二阶段是精子细胞膜蛋白变化，即发生顶体反应。细胞膜蛋白变化，即发生顶体反应。2.卵母细胞的采集和成熟培养卵母细胞的采集和成熟培养（1）卵母细胞的采集）卵母细胞的采集 超数排卵超数排卵 从活体卵巢中采集卵母细胞从活体卵巢中采集卵母细胞 从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞（2）卵母细胞的选择）卵母细胞的选择（3）卵母细胞的成熟培养）卵母细胞的成熟培养3.体外受精体外受精（1）常规体外受精技术）常规体外受精技术 将获能精子与成熟卵子置于受精液中共同培养，使之完成受精过程。通常情况下，受精液与获能液为同一种液体。（2）与分离精子相结合的体外受精技术）与分离精子相结合的体外受精技术 将精子分离技术与体外受精技术结合起来生产预选性别的优良胚胎,对加速家畜品种改良和畜牧业生产具有重要的应用价值。（3）显微受精技术）显微受精技术 为了提高体外受精的成功率，借助显微操作仪将精子直接注入卵母细胞质或透明带下，完成受精过程。显微受精技术避免了由透明带或卵质膜所形成的受精障碍，使受精率和准确率大大提高。4.受精卵的体外培养受精卵的体外培养 受精卵需要在培养液或输卵管中发育到桑葚胚或囊胚阶段，移植到受受精卵需要在培养液或输卵管中发育到桑葚胚或囊胚阶段，移植到受体后才能获得较高的妊娠率。但体外受精的早期胚胎在体外发育过程中，体后才能获得较高的妊娠率。但体外受精的早期胚胎在体外发育过程中，往往会停滞在某一阶段不再发育，此现象称之为往往会停滞在某一阶段不再发育，此现象称之为“发育阻滞发育阻滞”。不同动。不同动物体外发育阻滞出现的时期不同，小鼠为物体外发育阻滞出现的时期不同，小鼠为2细胞期，大鼠为细胞期，大鼠为8细胞期，牛细胞期，牛和绵羊为和绵羊为816细胞，猪为细胞，猪为4细胞期。细胞期。目前，克服阻滞现象主要采用以下两个方法：目前，克服阻滞现象主要采用以下两个方法：目前，克服阻滞现象主要采用以下两个方法：目前，克服阻滞现象主要采用以下两个方法：一是改进培养液成分，改善培养条件，尽量满足早期胚胎发育所需物一是改进培养液成分，改善培养条件，尽量满足早期胚胎发育所需物质，确定并减除对其发育不利的成分；质，确定并减除对其发育不利的成分；二是利用体细胞共同培养体系，以提供发育所需的物质条件，目前广二是利用体细胞共同培养体系，以提供发育所需的物质条件，目前广泛采用的有输卵管上皮细胞共培养体和颗粒细胞单层共培养体系。泛采用的有输卵管上皮细胞共培养体和颗粒细胞单层共培养体系。5.体外受精的意义体外受精的意义 家畜体外受精技术经过近家畜体外受精技术经过近20年的发展，已取得很大进步，为实现动物年的发展，已取得很大进步，为实现动物胚胎的工厂化生产提供了可能，对充分发挥良种母畜的繁殖潜力，加快家胚胎的工厂化生产提供了可能，对充分发挥良种母畜的繁殖潜力，加快家畜品种改良和优良品种遗传资源的开发与利用畜品种改良和优良品种遗传资源的开发与利用,加速畜牧业的发展具有重要加速畜牧业的发展具有重要的科学意义和实用价值。的科学意义和实用价值。二、胚胎移植技术二、胚胎移植技术 所谓胚胎移植（所谓胚胎移植（所谓胚胎移植（所谓胚胎移植（embryo transferembryo transfer）也称受精卵移植，是指将良种）也称受精卵移植，是指将良种）也称受精卵移植，是指将良种）也称受精卵移植，是指将良种母畜配种后，从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或早期胚胎，母畜配种后，从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或早期胚胎，母畜配种后，从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或早期胚胎，母畜配种后，从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或早期胚胎，移植到同种生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体技术，移植到同种生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体技术，移植到同种生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体技术，移植到同种生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体技术，所以也称为所以也称为所以也称为所以也称为“借腹怀胎借腹怀胎借腹怀胎借腹怀胎”。1供体、受体的选择供体、受体的选择 胚胎移植的供体一般是选择需要加速繁殖的有较大生产应用价值的健康的优良畜种，受体则是繁殖能力较强的健康本地品种。2超数排卵超数排卵 用前面所述的超数排卵技术，在母牛发情期（发情期当天为零天）的用前面所述的超数排卵技术，在母牛发情期（发情期当天为零天）的第九天开始肌肉注射第九天开始肌肉注射FSH，以递减剂量连续注射，以递减剂量连续注射4天，每天注射两次（间天，每天注射两次（间隔隔12h），总剂量为），总剂量为300400U；第三天的上下午，在注射；第三天的上下午，在注射FSH的同时肌的同时肌肉注射氯前列烯醇（肉注射氯前列烯醇（PGF2的类似物）各两支（的类似物）各两支（0.2mg/支）。支）。3同步发情同步发情 同期发情又称同步发情，就是利用某些激素制剂人为地控制并调整一同期发情又称同步发情，就是利用某些激素制剂人为地控制并调整一群母畜发情周期的进程，使之在预定时间内集中发情。群母畜发情周期的进程，使之在预定时间内集中发情。4人工受精人工受精 激素注射结束后，观察到发情后小时，开始第一次输精，时隔小时激素注射结束后，观察到发情后小时，开始第一次输精，时隔小时进行第二次输精，输精量是常规量的两倍进行第二次输精，输精量是常规量的两倍。5胚胎采集胚胎采集（1）手术法）手术法（2）非手术法）非手术法 6胚胎的检查与鉴定胚胎的检查与鉴定1）检卵）检卵将收集的冲卵液于37温箱内静置10一15分钟。胚胎沉底后，移去上层液。取底部少量液体移至平皿内，静置后，在实体显微镜下先在低倍(10一20倍)下检查胚胎数量，然后在较大倍数(50100倍)下观察胚胎质量。2）吸卵）吸卵吸卵是为了移取、清洗、处理胚胎，要求目标准确，速度快，带液量少，无丢失。吸卵可用1毫升的注射器装上特别的吸头进行，也可使用自制的吸卵管。3）胚胎质量鉴定）胚胎质量鉴定正常发育的胚胎，其中细胞(卵裂球)外形整齐，大小一致，分布均匀，外膜完整。无卵裂现象(未受精)和异常卵(外膜破裂、卵裂球破裂等)都不能用于移植。7胚胎移植胚胎移植1）手术移植）手术移植 先将受体母牛作好术前准备。已配种母牛，在右肋部切口，找到非排卵侧子宫角，再把吸有胚胎的注射器或移卵管刺入子宫角前端，注人胚胎；未配母牛在每侧子宫角各注入一个胚胎；然后将子宫复位，缝合切口。2）非手术移植）非手术移植 非手术移植一般在发情后第六至第九天(即胚泡阶段)进行，过早移植会影响受胎率。在非手术移植中采用胚胎移植枪和025毫升细管移植的效果较好。将细管截去适量，吸入少许保存液，吸一个气泡，然后吸人含胚胎的少许保存液，吸人一个气泡，最后再吸取少许保存液。将装有胚胎的吸管装入移植枪内，通过子宫颈插入子宫角深部，注入胚胎。非手术移植要严格遵守无菌操作规程，以防生殖道感染。8 胚胎移植的意义胚胎移植的意义发挥优良母畜的繁殖力，迅速扩大优良畜种数量，加速优良畜种的推广发挥优良母畜的繁殖力，迅速扩大优良畜种数量，加速优良畜种的推广应用；应用；缩短世代间隔、增加选择强度，促进家畜改良速度；缩短世代间隔、增加选择强度，促进家畜改良速度；长期保存长期保存冷冻胚胎，便于优良品种的种质运输和保存；冷冻胚胎，便于优良品种的种质运输和保存；是胚胎分割、胚胎嵌合、是胚胎分割、胚胎嵌合、性别鉴定和核移植等其它胚胎生物技术的基础，也是基础生命科学研究的性别鉴定和核移植等其它胚胎生物技术的基础，也是基础生命科学研究的重要手段。重要手段。三、胚胎分割技术三、胚胎分割技术 所谓胚胎分割（embryo splitting）即是将一枚胚胎用显微手术的方法分割成二分、四分甚至八分胚，经体内或体外培养，然后移植入受体中，以得到同卵双生或同卵多生后代的技术，也是胚胎克隆的一种方法。1.胚胎分割的方法胚胎分割的方法2.（1）显微针分割法）显微针分割法 该法适用于卵裂球阶段的胚胎。操作时在显微操作仪下将胚胎固定，用玻璃针在透明带上作一切口，将卵裂球从透明带中移出，并吹吸卵裂球使之离散，将其装入2个预先准备好的空透明带内，进行移植。该方法具有较高的同卵双生率，但操作程序复杂。（2）显微刀分割法）显微刀分割法 该法适用于对桑葚胚和早期囊胚进行分割。在显微操作仪下固定胚胎，用特制显微刀片将胚胎均匀一分为二，分别装入空透明带中，进行移植。（3）酶软化透明带后显微分割法）酶软化透明带后显微分割法 用0.5%的链霉蛋白酶软化胚胎透明带,若是紧密化胚胎(如桑椹胚),则需在无钙、镁的平衡盐溶液中处理20 分钟,使胚胎去紧密化，将胚胎固定，把将针置于欲分割的胚胎上面,使其与胚胎呈30 度角,对准胚胎的正中平分线徐徐下压，即可将一个胚胎分割成两半。（4）酶消化去透明带后分割法）酶消化去透明带后分割法 用0.25%0.5%的链霉蛋白酶去掉胚胎透明带,然后用显微玻璃针或微手术刀将裸胚一分为二。（5）徒手分割法）徒手分割法 徒手分割法主要适用于分割体积较大的胚胎，其优势在于可以不用显微操作仪。在立体显微镜下，用止血钳夹住切割刀片，将透明带切开一部分，再用直径略小于胚胎的毛细管吹吸几次，胚胎从透明带中脱出。手持玻璃针自上而下对称切割裸胚。这种方法多用于分割桑椹胚和囊胚。该方法操作简便、快速，便于生产应用，但要求要有较为灵巧的操作技能。尽管胚胎分割技术已在多种动物包括人类取得成功，但是仍然存在很多问题须作深入研究。（1）胚胎分割产生的后代初生体重低，在牛切割胚胎移植实践中发现，有些分割胚即使培养到囊胚阶段与正常胚胎相比，细胞数明显减少，移植后代的体重也相应降低。这可能与早期胚胎细胞的分化和定位有关，但发育机理还有待深入研究。（2）还有遗传一致性问题，同一胚胎切割后获得的后代，在理论上，遗传性状应该完全一致，但事实并不这样。人们发现67日龄牛胚胎分割后，同卵双生犊牛的毛色和斑纹并不完全相同，而在2-细胞阶段分割，却表现出遗传一致性。这种现象与胚胎细胞的分化有密切关系，但目前对不同阶段胚胎细胞的分化时间和发育潜力了解很少；（3）最后还存在同卵多胎的局限性，从目前的研究来看，由一枚胚胎通过胚胎分割方式获得的后代数量有限。迄今，最好的结果是由一枚牛胚胎获得3个牛犊，这说明孪生胚胎的发育潜力很有限。因此，通过胚胎分割技术生产大量克隆动物目前难以取得进展。2.胚胎分割目前存在的问题和发展前景胚胎分割目前存在的问题和发展前景第二节 核移植与动物克隆一、什么是动物克隆？一、什么是动物克隆？动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体细胞，经显微手术移植到去掉细胞核的卵母细胞中之后，在适当的条件下，可以重新发育成正常胚胎。这种胚胎被移植到生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的经过核移植而产生的动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。这种不这种不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆。隆。核移植技术：核移植技术：所谓核移植技术就是利用显微操作技所谓核移植技术就是利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术。无性杂交生物新品种的一项技术。胚胚胎胎克克隆：隆：使用的核供体细胞如果来自多细胞阶段使用的核供体细胞如果来自多细胞阶段的胚胎，叫做的胚胎，叫做胚胎克隆胚胎克隆。体细胞克隆：体细胞克隆：使用的核供体细胞来自动物体，叫做使用的核供体细胞来自动物体，叫做体细胞克隆体细胞克隆。二、两栖类细胞核移植1938年Spemann最先提出将多细胞胚胎的每一个细胞核移植到去掉核的卵母细胞中，使它们重新发育成胚胎的设想。1952年，Briggs和King沿用Spemann的思路和实验技术，首次获得两栖动物美洲豹蛙胚胎细胞核移植的后代核供体为囊胚期的胚胎细胞实验成功核供体为原肠胚期的中胚层和内胚层细胞实验失败n1958年到年到1962年，英国剑桥大学的年，英国剑桥大学的JohnGurdon和和Machineer利用爪利用爪蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾n1970年年JohnGurdon以同样的方法，用青蛙脚蹼角质化细胞进行移核以同样的方法，用青蛙脚蹼角质化细胞进行移核试验，蛙卵发育成了蝌蚪。试验，蛙卵发育成了蝌蚪。三、鱼类的核移植从1961年开始，童第周等以金鱼和鳑鮍鱼为材料，进行鱼类不同亚科间的细胞核移植获得成功，用以研究杂交细胞核与纯种细胞核在发育功能上的差异，以及细胞质对细胞核的影响 1979年，中国科学院武汉水生物研究所利用鲫鱼做移核试验。他们把鲫鱼囊胚期细胞经过385天59代连续传代培养后，再将此种培养细胞的细胞核移植到同种鲫鱼的未受精卵中。到1980年4月，他们成功地培育了两尾无性繁殖的幼鱼，其中一条发育正常。1989年，童第周、牛满江又将鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼去核的未受精卵中，实现了不同种间的核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼”新品种。四、哺乳类的细胞核移植 1977年，美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室用“亚无性繁殖”的方式，培育出7只单亲小鼠。u将卵细胞受精，在精、卵核融合之前，把精核去掉，然后放入加有适量细胞松驰B的溶液中。u经此番处理的卵细胞的染色体复制后出现了两个核，将此双核细胞放入正常培养液中培养。u卵中的双核细胞自动融合，并且细胞开始分裂。u将此种胚胎移入母鼠子宫培育。u生产出7只单亲小鼠。1981年，瑞士日内瓦大学和美国杰克逊实验室合作，首次对小鼠卵进行移核试验获得成功。他们将囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵中，经培养移核卵发育至囊胚期，再将此胚胎移入同步孕鼠子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发育成了可育的个体。五、核移植技术的一般操作程序五、核移植技术的一般操作程序 核移植克隆哺乳动物的技术操作过程主要包括核受体和核供体的处理和制备、核移植、重组胚的体外或体内培养、核移植胚胎移入代孕母畜（寄母）等步骤。1 1核受体细胞的准备核受体细胞的准备 去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞。这是因为在卵母细胞的细胞质含有某种特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表达程序发生重新排列，使已经分化了的细胞重新回到发育过程的原点，同受精卵一样开始个体发育过程。卵母细胞的来源有两种方式：一是用激素对雌体进行超排处理，从输卵管冲出体内成熟的M卵母细胞。二是从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘卵母细胞复合体(COCs)，在体外培养成熟后作为受体。2核供体细胞的准备核供体细胞的准备在核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整的二倍在核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整的二倍在核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整的二倍在核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整的二倍体，该细胞必须保持有供体动物完整的基因组；体，该细胞必须保持有供体动物完整的基因组；体，该细胞必须保持有供体动物完整的基因组；体，该细胞必须保持有供体动物完整的基因组；其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能重新细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能重新细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能重新细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外，核供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外，核供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外，核供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外，核供体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。供体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。供体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。供体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。3 3细胞核移植细胞核移植 常用的核移植方法有两种，即常用的核移植方法有两种，即常用的核移植方法有两种，即常用的核移植方法有两种，即胞质内注射胞质内注射胞质内注射胞质内注射和和和和透明带透明带透明带透明带下注射下注射下注射下注射。胞质内注射是用一个外径。胞质内注射是用一个外径。胞质内注射是用一个外径。胞质内注射是用一个外径5 5 5 58m 8m 8m 8m 的注核针吸取供体的注核针吸取供体的注核针吸取供体的注核针吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。透明带下注射则是把核后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。透明带下注射则是把核后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。透明带下注射则是把核后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。透明带下注射则是把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合。后用电刺激进行细胞融合。后用电刺激进行细胞融合。后用电刺激进行细胞融合。4激活激活 卵母细胞的激活涉及的因素很多，无论是受精引起卵母细胞的激活涉及的因素很多，无论是受精引起的卵母细胞激活还是人工的激活，都会引起卵母细胞发生一的卵母细胞激活还是人工的激活，都会引起卵母细胞发生一系列的反应，这些反应是胚胎发育所必需的。其激活原理是系列的反应，这些反应是胚胎发育所必需的。其激活原理是通过电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从通过电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从MIIMII期中解放期中解放出来，并转到出来，并转到“受精受精”的状态。的状态。5重组胚的体内或体外培养重组胚的体内或体外培养 经融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体外培养，经融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体外培养，观察重组胚的发育率。羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养观察重组胚的发育率。羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养方法获得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重组胚用琼脂包埋后移入方法获得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重组胚用琼脂包埋后移入休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养4-7d4-7d，发育至桑椹胚和，发育至桑椹胚和囊胚。猪的核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内作体内囊胚。猪的核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内作体内培养培养7d7d，发育为囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作体外培，发育为囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作体外培养，发育至桑椹胚或囊胚。养，发育至桑椹胚或囊胚。6.胚胎移植前性别的控制 对对于于较较高等的高等的动动物，如家畜等，可以利用物，如家畜等，可以利用X X、Y Y精子分离精子分离和和胚胎性胚胎性别别鉴鉴定技定技术术来来实现实现性性别别控制。控制。依依赖赖X X和和Y Y型精子不同的特性，人型精子不同的特性，人们试图们试图分离精子。早在分离精子。早在19251925年，年，LushLush就通就通过过离心法分离兔子的离心法分离兔子的X X与与Y Y精子，但没精子，但没有成功。有成功。后来，人后来，人们试图们试图通通过过受精前阴道受精前阴道输输入精氨酸，入精氨酸，改改变变生殖道生殖道pHpH的方式的方式选择选择性利用精子来控制性性利用精子来控制性别别比率比率为为目的。目的。pHpH值值碱性，雌兔比例高，但碱性，雌兔比例高，但结结果不果不稳稳定。定。利用利用免疫免疫亲亲和柱和柱层层析析技技术术的方法，可以将表达的方法，可以将表达H-YH-Y抗原的抗原的Y Y精子于不表达的精子于不表达的X X精子分开。精子分开。利用流式细胞仪鉴定精子DNA的含量，可以将X与Y精子分开。这类方法目前对精子分离的准确率为79，对Y精子分离的准确率为70。其主要缺点是分离速度慢，一台分类器1小时仅能分离40万个精子，不够一次子宫颈内输精应用，只能通过手术进行输卵管输精。温度对某些生物而言，是一条控制性别发育的途径。例如:鳄鱼的性别完全由胚胎发育的温度所决定，受精卵在30度发育起来的全是雌性，34度以上，孵化起来的全是雄性。另外，在牡蛎、蛙、和鳖等动物中也存在这样的现象。性激素也可以控制性别，这甚至在鸟类和其它一些高等哺乳动物中也有体现，只是不同的动物受影响的程度有所不同罢了，这在鱼类性别控制中有广泛的应用。利用甲基睾丸素、雄性激素等可以实现性反转得到全部雄性个体，但指数表现型改变，不能遗传。如果调整阴道酸碱度，也可以达到性别筛选的目的。当阴道液偏酸时，Y型精子移动慢，而X型精子速度快，因而受精卵是XX的概率高；反之，易形成XY的雄性合子。该法的成功率为80。如在精液中加入睾丸，胎血、脑垂体等生物制剂或激素，也可控制生物性别，该法的成功率也有6070。在低等动物中，通过人工雌雄核发育，三倍体激素等实现性别控制。性别鉴定雌性胚胎中存在的X染色体相关酶的活性、雄性胚胎存在的H-Y抗原以及SRY基因可以对植前胚进行性别鉴定。胚胎性别鉴定研究注意采用四种方法：细胞遗传学方法、生物化学方法、免疫学方法、分子生物学方法 细胞遗传学方法：指通过核型分析对胚胎进行性别鉴定。其准确率为100，但获得高质量的中期染色体分散相难度很大。生物化学微量分析法：指通过测定与X染色体相关联的酶活性来鉴定雌性胚胎的一种方法。其原理是早期雌性胚胎的两条X染色体中必有一条失活，在胚胎基因组的激活与X染色体失活之间的短暂时期内，雌性的两条X染色体都可以被转移，这反映在雌性胚胎中与X染色体相关连的细胞内浓度及活性是雄性胚胎的两倍。此点可作为进行胚胎性鉴的依据免疫学方法：利用H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体检测胚胎上是否存在雄性特异性H-Y抗原，从而进行胚胎性别鉴定的一种方法。对胚胎的H-Y抗原检测有三种方法：即细胞毒性分析法、间接免疫荧光分析法和囊胚形成抑制法。细胞毒性分析法:将H-Y抗血清与补体（豚鼠血清）加入培养液中对胚胎进行培养，将在培养过程中继续发展发育胚胎分类微H-Y（雌性），将出现个别卵裂球溶解以及不能发育到囊胚期者分类为H-Y（雄性），用这种方法鉴定的H-Y胚胎移植后所生仔鼠有86为雌性。但该方法是以破坏一部分胚胎为代价。间接免疫荧光法:将胚胎先用H-Y抗体处理30分钟，再用异硫氰酸盐荧光素（FITC）标记的二抗处理，根据特异荧光判断，有荧光者为雄胚，无荧光者为雌胚，将两类胚胎移植后，判为雄胚者有78发育成雄鼠，判微雌胚者有81发育为雌鼠。此方法的主要优点是不损害胚胎，亦具有适当的性别鉴定准确率，但对荧光强度的估价则具有高度的主观性。此外,胚胎质量似乎也与荧光强度和类型有关，第二抗体有时发生非特异性结合，如与同卵周隙的细胞碎片结合等。囊胚形成抑制法:利用H-Y抗体对雄性桑椹胚向囊胚发育具有可逆性抑制的原理发展起的一种胚胎性别鉴定法。这种方法是一种简单而有效的胚胎性别鉴定方法。不足之处是容易将一部分发育迟缓的雄性胚胎误判为雌性胚胎 分子生物学方法:指从胚胎取下少量细胞，将其DNA与Y染色体特异标记的DNA序列（探针）杂交。在类似的研究中，用生物素标记的Y特异性探针进行原位杂交，准确率达100。此法的优点是不用放射性标记、设备简单、技术难度低，且可在24小时之内得到结果.缺点是可鉴定的胚胎较少。通过聚合酶连式反应扩增Y染色体DNA可大大增加灵敏度，改善准确度。这种方法分析的灵敏度之高，甚至单个精子细胞的性别也可在3小时之内鉴定出来。当前用PCR进行胚胎性别鉴定的最大问题是污染，在采胚细胞时采到粘在胚胎上的精子、或切割刀粘上另一个胚胎的细胞、空气中的污染、PCR、试剂的污染以及培养液中的BSA、FCS都可能成为污染源、引致假阳性结果。这就对操作过程提出了更严格的要求7 7胚胎移植胚胎移植 重组克隆胚胎移植的受体母畜要选择皮毛颜色与供体品种不同、繁殖性能强、体格稍大的当地品种，进行同期发情处理，按常规方法移植代孕母畜（寄母）的子宫中，待其发育到产仔。六、六、核移植技术的应用核移植技术的应用1制备转基因克隆动物，制备转基因克隆动物，进行生物药物生产；进行生物药物生产；2培育优良畜种，扩大良种种群培育优良畜种，扩大良种种群；3开展异种动物克隆，拯救濒危动物；开展异种动物克隆，拯救濒危动物；4与干细胞技术结合，开展治疗性克隆与干细胞技术结合，开展治疗性克隆5利用核移植技术，研究生物学的基本问题利用核移植技术，研究生物学的基本问题。七、克隆羊与体细胞核移植a.胚胎細胞株胚胎細胞株,b.胚胎纖維母細胞胚胎纖維母細胞c.乳腺上皮細胞乳腺上皮細胞,d.PCRmicrosatellite第一步第一步 取妊娠期的6岁母绵羊（Finn Dorset白品种母羊）的乳腺细胞作核供体细胞，用饥饿法使其进入休眠状态而使全部基因具有活性。第二步第二步注射促性腺激素，促使母羊（Sottish Blackface黑面母绵羊）排卵，2833小时取其未受精卵，快速去核，放入10%FCS、1%FCS和0.5%FCS连续5天，使其进入G0期做受体细胞。第三步第三步乳腺细胞与无核卵放入同一培养皿中，在微电流的作用下，将乳腺细胞融入卵中，形成一个含有新的遗传物质的卵细胞。第四步第四步新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内，新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内，6 6天天后发育为桑椹胚或囊胚（后发育为桑椹胚或囊胚（816816个细胞）。个细胞）。第五步第五步将此早期胚胎移入假孕母羊子宫中，产下多利即为6岁母羊的复制品，也为白色。为何是突破性的工作：为何是突破性的工作：第一，解决了使供体细胞与核受体细胞（去核卵细胞）同步的方法。第二，解决了用体细胞做核供体与转基因的问题。这一成果的重要生物学意义：这一成果的重要生物学意义：第一，它证明了一个已经完全分化了的动物体细胞仍然保持着当初胚胎细胞的全部遗传信息，并且经此技术处理后，体细胞恢复了失去的全能性形成完整个体。第二，多利是世界上首例利用成年哺乳动物体细胞作为供体细胞繁殖的克隆羊，即成体母羊的复制品。它的成功提示我们可以进一步做到，在培育体细胞成为核供体之前，利用“基因靶”技术精确地诱发核基因的遗传改变或精确地植入目的基因，再用选择技术准确地挑选那些产生了令人满意变化的细胞作为核供体，从而生产出基因克隆体。也就是说，我们可以按照人的意志去改选、生产物种。第三，在现代生物学领域中，沿有任何一项研究成果能够比通过对基因进行有规律地控制而解决更多的问题的先例。多利羊的诞生及生长表明，利用克隆技术复制哺乳类动物的最后技术障碍已被突破，在理论上已成为可能。八、克隆技术存在的问题 理论问题理论问题分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。克隆动物的连续后代是否会累积突变基因。克隆动物的连续后代是否会累积突变基因。在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。实践问题实践问题克隆动物的成功率还很低克隆动物的成功率还很低生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。即使是正常发育的即使是正常发育的“多莉多莉”，也被发现有早衰迹象，也被发现有早衰迹象除了以上的理论和技术障碍外，克隆技术（尤除了以上的理论和技术障碍外，克隆技术（尤其是在人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击其是在人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。用。