EBV抗体酶联免疫诊断试剂

EB病毒IgA抗体酶联免疫吸附法诊断试剂盒（受理号：X0407269）中山大学中山医学院朱振宇教授、医学博士、博士生导师中山大学达安基因股份首席科学家一、鼻咽癌与EB病毒感染的关系 l鼻咽癌（NPC）是来源于鼻咽粘膜上皮细胞的低分化或未分化癌。本病可见于世界各地，但NPC有明显的种族倾向，大部分患者是中国人及其后裔，在爱斯基摩人、北非洲人和马来人中也较常见。l 病人的肿瘤细胞中有规律地隐匿着潜伏状 态 的 EB病 毒（Epstein-Barr Virus，EBV）。1、病人的肿瘤细胞中隐匿着EB病毒l 发现l EB病毒是1964年Epstein与Barr在非洲儿童恶性淋巴瘤的瘤细胞中观察到的一种疱疹病毒。l 1966年Old等采用免疫扩散法发现鼻咽癌病人的血清能与非洲儿童淋巴细胞的抽提液起反应。1、病人的肿瘤细胞中隐匿着EB病毒l 证据（1）：l 1969年de-the从鼻咽癌活检培养的类淋巴细胞中分离出EB病毒。l 国内也已经从鼻咽癌组织培养所建立的类淋巴母细胞株中证明带有EB病毒壳抗原（VCA）和早期抗原（EA），并在电镜下找到了典型的疱疹病毒颗粒，其形态与EB病毒相同。1、病人的肿瘤细胞中隐匿着EB病毒 证据（2）：Kottaridis SD等（1996年）认为鼻咽癌患者血清中抗EBNA的水平反映肿瘤的大小。Anticancer Res,1996,16(2):785-789 Vera-Sempere FJ等（1996年）采用巢式PCR和免疫组化分析说明了不论组织学类型，鼻咽癌中均有EB病毒感染。Eur J Cancer B Oral Oncol,1996,32B(3):163-168 2、几乎100%鼻咽非角化性癌均有EBV感染。l 在我国，几乎所有四岁以上的人群均已感染过EBV，80%以上的健康成人是EBV携带者。特别在珠江三角洲及香港地区，是世界上NPC的高发区。l 根据中山市的肿瘤统计资料（流行病学），NPC的年龄和性别的校正发病率为18.12/10万(男：25.60/10万；女：11.05/10万)。97%的NPC为非角化性癌。经EBER1原位杂交（所谓“金标准”）证实癌细胞中有EBV感染。EBERs原位杂交3、NPC病人血清中的EBV抗体水平普遍升高 NPC的显著特征是病人血清中对EB病毒各种抗原的抗体（尤其是IgA亚型）水平普遍升高，借此可区分NPC与健康携带者。（Werner Henle et al.,1976.）中国医学科学院等单位采用间接免疫荧光法，发现鼻咽癌患者血清中IgA/VCA的阳性率为90.14，几何平均滴度为1:15.3,而其它癌瘤和健康携带者血清中IgA/VCA的阳性率为2.61%-3.30%，几何平均滴度为1:1.3。同时还发现鼻咽癌病人放疗后，其IgA抗体水平随存活时间的延长而逐渐下降，在放疗后 422年者仅39.29为阳性；但当病者出现肿瘤复发或转移时，阳性率又再次升至85.75。一、鼻咽癌与EB病毒感染的关系 l 小小结结：流行病学、血清学和分子生物学的资料证实,EBV感染与NPC有密切关系。l 鼻咽癌患者癌细胞中证实有EB病毒的DNA，经原位杂交，多数癌细胞呈EBERs阳性、核抗原（EBNA-1）阳性。l 鼻咽癌患者肿瘤细胞中有EB病毒，血清有一套抗EB病毒的抗体，血清中的EBV抗体水平普遍升高。l 1997年世界卫生组织在国际抗癌联盟年会上把EBV归类为第一类致癌物（特别是鼻咽癌）。二、EB病毒携带者与鼻咽癌病人血清中EBV抗体的不同l EBV血清学诊断利用NPC的一个特征，即患者多种EBV抗体的水平较非患者高（Werner Henle et al.,1976.）。l EBV血清学诊断已用于NPC高危人群的筛查和对NPC可疑病例的诊断。根据从70年代后期以来的研究结果，VCA-IgA检测通常被用于筛查以排除NPC的诊断；EA-IgA检测目前被用于NPC的确定性检测。二、EB病毒携带者与鼻咽癌病人血清中EBV抗体的不同l检测哪种抗体？l检测抗体哪种类型？l 因为鼻咽癌（NPC）是来源于鼻咽粘膜上皮细胞的低分化或未分化癌。所以我们可以先了解EB病毒在上皮细胞中的潜伏感染以及两种形式的EB病毒感染所表达的各种抗原。l 各种抗原相应产生不同的特异性抗体中哪种有代表性？1、EB病毒的潜伏感染 上皮细胞中病毒复制循环中的B淋巴细胞池 长期潜伏感染 如果感染了无复制缺陷突变的病毒 EB病毒感染口咽上皮细胞 如果感染了复制缺陷突变的病毒 待上皮细胞增生后个别细胞死亡EB病毒引自:J Immmunol.2005;17498:4972-82、两种形式的、两种形式的EB病毒感染病毒感染潜伏性感染潜伏性感染(latent infection)I型潜伏性感染:表达EBNA1，病征为 Burkitt 淋巴瘤II型潜伏性感染:表达EBNA1和LMP1、LMP2A、LMP2B，病征为Hodgkin 淋巴瘤、鼻咽癌、鼻型 NK/T-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤III型潜伏性感染:表达EBNA1、EBNA2、EBNA3、EBNA4、EBNA5、EBNA6，病征为传染性单核细胞增多症、移植后淋巴 组织增生性疾病溶解性感染溶解性感染(lytic infection)在EBV潜伏感染的淋巴细胞中有小部分（约15%20%）出现溶解性感染，溶解性感染出现三个时相（phase）。立即早期:表达Zta(ZEBRA)、EBNA1等 早期:表达EA(D)、EA(R)、EBNA1等 晚期:表达VCA、EBNA1等EBNA-1 是在所有不同EBV感染细胞中都出现的唯一抗原。3、检测抗体哪种类型？l遵循免疫学抗体产生的基本原则遵循免疫学抗体产生的基本原则l IgGl IgMl IgA是上皮细胞的分泌型抗体l IgDl IgE二、EB病毒携带者与鼻咽癌病人血清中EBV抗体的不同检测对象 例数 EBNA1/IgA（rOD）中位数 范围 鼻咽癌 121 2.6 0.47.5患者 健康 332 0.5 0.23.9携带者l lNPC病人血清中的EBNA1/IgA抗体平均水平是健康携带者的4倍以上。EBNA 1 EBNA 1 IgAIgA 的抗体水平的抗体水平在在NPCNPC患者中高于正常的患者中高于正常的EBVEBV携带者携带者Cutoff OD?小结lNPC主要表现是EBV潜伏感染伴少量溶解性感染。EBNA-1 是在所有不同EBV感染细胞中都出现的唯一抗原。lNPC是来源于鼻咽粘膜上皮细胞，检测上皮细胞的分泌型IgA抗体水平对NPC较有诊断意义。l NPC的显著特征是病人血清中的EBV抗体（尤其是IgA亚型）水平普遍升高，这种变化在NPC发病前期将先于症状出现，借此可区分NPC与其它EB病毒感染相关疾病或健康携带者。l我们认为EBNA1/IgA抗体水平的检测对NPC高危人群的筛查可作为早期发现鼻咽癌的有效手段之一。三 本品是用于NPC 辅助诊断的有效手段NPC是来源于鼻咽粘膜上皮细胞的一种恶性肿瘤，组织病理学检查是确诊NPC的唯一方法。NPC的早期症状是非特异的，EBV血清学体外诊断最常用于诊断程序的初期及NPC高危人群的筛查。NPC的显著特征是病人血清中的EBV多种抗体水平普遍升高，因此一种抗体的检测有一定的局限性。本品的设计应用ELISA技术，采用了高度纯化的EBNA 1的抗原，它的抗体水平在鼻咽癌和非鼻咽癌患者之间的差异，大于那些不是由肿瘤细胞所表达的抗原的特异性抗体。同时每个试剂盒中加入了一份定值参考对照，在每次的检测中与测试样品同时进行检测，使抗体的水平以标准的rOD单位来表示，这样可以减少实验之间和实验室之间的误差，从而可以直接地比较不同的实验室在不同的时间所独立得出的检测结果。1、本品的用途和局限性 用途 本品适用于疑似鼻咽癌病人的血清学检测，检测结果有助于临床医生作出排除或进一步确认 NPC 的诊断。主要可用于高危人群的筛查。局限性 本本品品并并非非NPC诊诊断断的的确确诊诊试试剂剂，只只有有组组织织病病理学检查能确诊理学检查能确诊NPC。检测结果只提供了额外的信息，以指导对疑似NPC病例的诊断。同时对健康人群来说，检测结果可能反映可能反映NPC的风险程度。的风险程度。2、本品的使用特点l推荐使用的诊断参数及其临床意义：推荐使用的诊断参数及其临床意义：当疑似鼻咽癌症状的病人首次到专科门诊就诊时，血清当疑似鼻咽癌症状的病人首次到专科门诊就诊时，血清学诊断可作初步筛选，学诊断可作初步筛选，此时敏感性为主要的诊断参数此时敏感性为主要的诊断参数。其。其目的是评估病人被诊断为鼻咽癌的可能性大小。目的是评估病人被诊断为鼻咽癌的可能性大小。推荐使用推荐使用当当 rOD值低于值低于0.700时，可判定为阴性（此时敏感性大于时，可判定为阴性（此时敏感性大于94.1%），支持排除），支持排除NPC，但应建议病人定期复查；但应建议病人定期复查；当普查时，绝大部分人均非鼻咽癌患者，因此特异性为当普查时，绝大部分人均非鼻咽癌患者，因此特异性为主要的诊断参数。推荐使用当主要的诊断参数。推荐使用当 rOD值高于值高于1.500时，可判时，可判定为阳性（此时特异性大于定为阳性（此时特异性大于94.4%），即高度怀疑病人患），即高度怀疑病人患有有NPC，应继续进行组织学检查以确诊。应继续进行组织学检查以确诊。当当rOD值在值在0.700至至1.500之间时，判定为可疑之间时，判定为可疑NPC（此时此时敏感性和特异性在敏感性和特异性在70%95%之间），须结合临床作进一之间），须结合临床作进一步检查和随访，必要时进行组织学检查。步检查和随访，必要时进行组织学检查。3、本品的判断依据和评价l 相对抗体水平与罹患相对抗体水平与罹患NPC的关系的关系：l 对1402例1998年以来在NPC高发区普通门诊和耳鼻喉科就诊病人的血清进行检测，其相对抗体水平（rOD）与罹患NPC的关系见下表。1402例病人中有321例经组织学检查确诊为NPC，其他1081例临床经多种血清学方法或组织学方法检查，结合临床观察，不能确诊为NPC，应考虑排除NPC。表表 NPCNPC高发区高发区14021402例疑似病人相对抗体水平与罹患例疑似病人相对抗体水平与罹患NPCNPC的关系的关系 rOD%敏感性敏感性%特异性特异性 阳性试验似然阳性试验似然比（比（LR）0.200 99.7 (320/321)8.0 (86/1081)1.1 0.400 98.1 (315/321)38.6 (417/1081)1.6 0.600 94.7 (304/321)62.6 (677/1081)2.5 0.700 94.1 (302/321)70.1 (758/1081)3.1 0.800 90.0 (289/321)76.3 (825/1081)3.8 1.000 85.0 (273/321)84.4 (912/1081)5.4 1.300 76.0 (244/321)91.5 (989/1081)8.9 1.500 69.2 (222/321)94.4 (1021/1081)12.5 1.600 63.6 (204/321)95.9 (1037/1081)15.6 1.800 57.9 (186/321)97.4 (1053/1081)22.4 2.000 47.7 (153/321)98.1 (1061/1081)25.8 注：阳性试验似然比（LR）=敏感性 (1特异性)EBNA1-IgA ELISA EBNA1-IgA ELISA 检测结果的最优化选择检测结果的最优化选择检测结果的最优化选择检测结果的最优化选择特异度 controls敏感度 NPC低/高lrOD值l百分比临床考核试验评价（1）三个医疗单位的非鼻咽癌个体的抗体水平相似，并且明显低于鼻咽癌患者的抗体水平。详见下表 鼻咽癌患者抗体鼻咽癌患者抗体中位数水平中位数水平 非鼻咽癌个体抗非鼻咽癌个体抗体体中位数水平中位数水平 玛丽医院玛丽医院 2.1 2.1 rODrOD 0.56 0.56 rODrOD 东莞市人民医院东莞市人民医院 1.8 1.8 rODrOD 0.67 0.67 rODrOD 中山市肿瘤研究所中山市肿瘤研究所 1.9 1.9 rODrOD 0.63 0.63 rODrOD 综合综合 1.9 1.9 rODrOD 0.63 0.63 rODrOD 临床考核试验评价（2）三个医疗单位的检测中，敏感性和特异性的水平相似。详见下表 界限值界限值 =0.7=0.7 rODrOD 界限值界限值 =1.5=1.5 rODrOD 灵敏度灵敏度 特异性特异性 灵敏度灵敏度 特异性特异性 玛丽医院玛丽医院93%93%77%77%77%77%95%95%东莞市人民医院东莞市人民医院 94%94%70%70%63%63%94%94%中山市肿瘤研究所中山市肿瘤研究所 96%96%68%68%68%68%94%94%综合综合 94%94%69%69%66%66%94%94%临床考核试验评价（3）进行了VCA IgA 和EA IgA的免疫荧光检测以及EBV DNA检测对比。作为筛查实验排除鼻咽癌的应用与VCA IgA相比较 VCA IgA 界值 0.7 rOD 阴性预测率 94%97%假阴性率 13%7%被排除的疑似鼻咽癌病例 59%77%作为确定实验预测鼻咽癌的应用与EA IgA 和EBV DNA检测相比较 EA IgA EBV DNA 界值 1.5 rOD阳性预测率 86%89%83%假阳性率 4%2%5%被预测的疑似鼻咽癌病例 75%57%77%结果表明，本品在筛查试验中的应用与目前所使用的VCA IgA相似，在确定实验中的应用与目前所使用的EA IgA，或与最新使用的EBV DNA检测相似。小结l临床考核检测441例鼻咽癌患者，1523例非鼻咽癌患者。考核结果显示：l以R0.7为临界值（与目前所使用的VCA IgA相似），本品检测阴性符合率为94%。假阴性率为6%；特异性为69%，假阳性31%。l以R1.5为 临界值（与目前所使用的EA IgA），本品检测的阳性符合率为66%，假阳性率为6%，特异性94%，假阴性34%。l上述结果与本品的使用说明书推荐使用的上述结果与本品的使用说明书推荐使用的诊断参数及其临床意义相一致。诊断参数及其临床意义相一致。l 中国药品生物制品检定所药品注册检验报告检品名称及批号EB病毒IgA抗体酶联免疫吸附法诊断试剂盒批号：20040612检验项目标准规定检验结果物理检查液体组份应为澄清液体符合规定阳性参考品符合率：阳性参考品20份阳性参考品符合率为19/2019/20阴性参考品符合率：阴性参考品20份阴性参考品符合率为19/2019/20精密性（%）精密性参考品 n=10CV15%2检验结论符合规定报告编号：SZ200501144签发日期：2005年3月29日中国药品生物制品检定所药品注册检验报告检品名称及批号EB病毒IgA抗体酶联免疫吸附法诊断试剂盒批号：20040619检验项目标准规定检验结果物理检查液体组份应为澄清液体符合规定阳性参考品符合率：阳性参考品20份阳性参考品符合率为19/2019/20阴性参考品符合率：阴性参考品20份阴性参考品符合率为19/2019/20精密性（%）精密性参考品 n=10CV15%8检验结论符合规定报告编号：SZ200501145签发日期：2005年3月29日中国药品生物制品检定所药品注册检验报告检品名称及批号EB病毒IgA抗体酶联免疫吸附法诊断试剂盒批号：20040626检验项目标准规定检验结果物理检查液体组份应为澄清液体符合规定阳性参考品符合率：阳性参考品20份阳性参考品符合率为19/2019/20阴性参考品符合率：阴性参考品20份阴性参考品符合率为19/2019/20精密性（%）精密性参考品 n=10CV15%3检验结论符合规定报告编号：SZ200501146签发日期：2005年3月29日 谢 谢