生物大分子的分离纯化技术

生物大分子的分离纯化技生物大分子的分离纯化技术术生物样品的常规分离纯化方法n n透析 n n微过滤n n盐析n n冷冻干燥n n离心透 析基本原理透析膜:材料:火棉胶(Collodion),玻璃纸(Cellophane),纤维素(Cellulose)纤维透析管的处理:1%乙酸水溶液 1h,碱性EDTA(1%Na2CO3,1 mM EDTA)煮1h,纯水清洗,保存.透析液:水,缓冲液,高分子的浓溶液Donnan效应:pH变化 (勤换透析液,使用大量的透析液)Donnan效应:微过滤的类型:深层滤器深层滤器(Depth Filter):(Depth Filter):滤膜滤器滤膜滤器(Screen Filter):(Screen Filter):纤维素醋酸酯纤维素醋酸酯(硝酸酯硝酸酯)微过滤技术的应用:溶液的澄清溶液的澄清微量沉淀物的收集微量沉淀物的收集细菌细胞的收集细菌细胞的收集微过滤盐析基本原理：在盐浓度很低时，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增在盐浓度很低时，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶；随盐浓度不断增加，蛋白质的溶解度不加，这称为盐溶；随盐浓度不断增加，蛋白质的溶解度不断降低而沉淀析出，即盐析。断降低而沉淀析出，即盐析。盐析实验应注意的问题：盐类的选择：硫酸铵盐类的选择：硫酸铵 （767g/l,25767g/l,25)盐的饱和度：盐的饱和度：温度：室温或温度：室温或4 4 pH pH：等电点：等电点 蛋白质的浓度：蛋白质的浓度：冷冻干燥n n基本原理：又称升华干燥，是在低温、副压下又称升华干燥，是在低温、副压下进行干燥的方法。进行干燥的方法。n n冷冻干燥的条件：冷冻干燥的条件：温度，温度，-10-40-10-40；真空度，；真空度，131340 Pa40 Pa。离心n n基本原理种类：普通离心机普通离心机（6000rpm)6000rpm)，高速离心机高速离心机(25000 rpm)(25000 rpm)，超速离心机超速离心机转子：固定角度式，固定角度式，悬挂吊桶式悬挂吊桶式离心(2)离心力和相对离心力(Relative centrifugal force)(Relative centrifugal force)：F=m F=m2 2r;r;F Fcfcf=(1.11910=(1.11910-5-5)(rpm)(rpm)2 2r r沉淀速度与沉降系数：F摩擦摩擦=fv F净=(Mp-Ms)2r-fv沉降系数：沉降系数：沉淀速度与离心力的比率（单位离心场中颗粒沉淀速度与离心力的比率（单位离心场中颗粒的沉降速度），的沉降速度），蛋白质蛋白质 核酸核酸 病毒等的沉降系数介于病毒等的沉降系数介于110110-13-13到到2001020010-13-13秒的范围秒的范围.以以110110-13-13s s 为一个单位为一个单位,称为斯韦德贝格单位称为斯韦德贝格单位(Svedberg)(Svedberg)，用，用S(S(大写大写)表示表示.离心(3)n n离心技术的类型：离心技术的类型：最大速度方法：最大速度方法：移动界面（移动界面（Moving Moving Boundary)Boundary)超速离心法超速离心法 移动区带移动区带(Moving Zone)(Moving Zone)超速超速离心法离心法 等密度方法等密度方法(Iso-(Iso-density)density)：临床及生化分析样品的预处理n n 样品的类型、采集与保存n n 酶样品的准备样品的类型、采集与保存n n样品的类型：样品的类型：样品的类型、采集与保存n n样品的采集样品的采集 血样：血样：全血：肝素抗凝（全血：肝素抗凝（0.020.2mg/ml)0.020.2mg/ml)血浆：血浆：2000g2000g离心离心10min10min 血细胞：血细胞：血清：血清：530 min530 min自凝分离自凝分离 尿样：尿样：酸式采集（酸式采集（HClHCl或硼酸，或硼酸，pH2.5)pH2.5)，碱式采集碱式采集(碳酸钠，几滴苯酚抗菌）碳酸钠，几滴苯酚抗菌）唾液：唾液：组织样品：组织样品：液氮等冷冻液氮等冷冻酶样品的准备酶活性的保持 控制纯化过程中的控制纯化过程中的pHpH、温度及有机试剂、温度及有机试剂 加入载体蛋白防止酶的吸附，如加入载体蛋白防止酶的吸附，如:BSABSA 加入辅助因子保护活性部位加入辅助因子保护活性部位,如如:EDTA,EDTA,巯基乙醇，谷胱甘肽巯基乙醇，谷胱甘肽 抑制蛋白酶的水解作用，如抑制蛋白酶的水解作用，如:氟代磷酸二异丙酯，甲（乙）氟代磷酸二异丙酯，甲（乙）酰酰-亮亮-亮亮-精三肽等精三肽等 亲水分子稳定剂，如甘油，糖醇等亲水分子稳定剂，如甘油，糖醇等样品制备 从组织或器官制备样品从组织或器官制备样品 从组织或器官培养液中制备样品从组织或器官培养液中制备样品 从生物体液中制备样品从生物体液中制备样品 （5000 rpm,15 min)5000 rpm,15 min)从细胞培养液制备样品从细胞培养液制备样品电泳分离纯化技术n n聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳n n琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳n n高效毛细管电泳高效毛细管电泳电泳分离纯化技术基本原理 V=e E (e e 为电泳迁移率为电泳迁移率,即电场强度为即电场强度为1 V/cm 1 V/cm 时的迁移速率时的迁移速率.).)影响电泳分离的因素:物质本身的结构和性质物质本身的结构和性质:荷电性质荷电性质,形状形状 支持介质支持介质:吸附作用吸附作用,电渗作用电渗作用 溶液介质溶液介质:pH,pH,离子强度离子强度 电场强度电场强度:常压常压 500 V500 V聚丙烯酰胺凝胶电泳n n聚丙烯酰胺凝胶的结聚丙烯酰胺凝胶的结构和性质构和性质 凝胶的机械强度、弹性、凝胶的机械强度、弹性、透明度和黏度等取决于凝透明度和黏度等取决于凝胶的总浓度胶的总浓度:聚丙烯酰胺凝胶电泳(2)凝胶电泳的装置凝胶电泳的装置 柱型柱型(Column Gel):(Column Gel):10cm6cm10cm6cm 板型板型(Slab Gel):(Slab Gel):12cm12cm12cm12cm或或14cm16cm;14cm16cm;玻璃板间距玻璃板间距1.751.75或或1.5 cm.1.5 cm.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(盘状电泳盘状电泳)电荷效应电荷效应 浓缩效应浓缩效应 分子筛效应分子筛效应不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用n nSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量 1%SDS+0.1 M 1%SDS+0.1 M 巯基乙醇巯基乙醇分子量分子量1.0101.0104 42.0102.0105 5n n蛋白质的等电聚焦蛋白质的等电聚焦(Isoelectric Focusing,IEF)(Isoelectric Focusing,IEF)原理原理pHpH梯度的形成与保持梯度的形成与保持 琼脂糖凝胶电泳特点：适合分子量大的分子；无毒；分辨率高；重复性好适合分子量大的分子；无毒；分辨率高；重复性好胶浓度：胶浓度：0.5%3%0.5%3%；分离；分离19.01019.0107 7DNADNA片段片段0.51.0%0.51.0%胶分离胶分离0.530 kb DNA,0.530 kb DNA,1.01.5%1.01.5%胶分离小片段胶分离小片段琼脂糖凝胶电泳的应用n n限制性核酸内切酶存在下酶切DNA片段的分析n nDNA超螺旋结构的鉴定n nDNA分子量的测定n n脉冲场凝胶电泳DNA分子量的测定高效毛细管电泳n n仪器仪器n n毛细管毛细管:I.D,25100I.D,25100 m;O.D.,100400m;O.D.,100400 m;L,0.11 mm;L,0.11 mn n进样系统进样系统:nLpL,nLpL,流体力学方法和电动进样流体力学方法和电动进样n n高压直流电源高压直流电源：30kV,130030kV,1300 A An n检测检测 紫外紫外-可见吸收法可见吸收法荧光检测法荧光检测法电化学检测法电化学检测法质谱法质谱法高效毛细管电泳基本概念：基本概念：电泳淌度电泳淌度电渗流电渗流分析参数：分析参数：淌度和迁移时间淌度和迁移时间分离效率分离效率分离度分离度高效毛细管电泳分离模式n n毛细管区带电泳 （Capillary Zone Electrophoresis,CZE)Capillary Zone Electrophoresis,CZE)n n毛细管胶束电泳 （Capillary Micellar Electrokinetic Chromatography,CEKC)Capillary Micellar Electrokinetic Chromatography,CEKC)n n毛细管凝胶电泳 （Capillary Gel Electrophoresis,CGE)Capillary Gel Electrophoresis,CGE)n n毛细管等电聚焦 （Capillary Isoelectric Focusing,CIEF)Capillary Isoelectric Focusing,CIEF)CGE的应用n nDNA序列分析n n蛋白质分析n n物理胶CZE生物大分子的色谱分离纯化技术n n排阻色谱n n亲和色谱n n离子交换色谱n n反相及疏水作用色谱n n液液分配色谱亲和色谱固定相葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺琼脂糖混合凝胶，琼脂糖混合凝胶，（与凝胶色谱相似）（与凝胶色谱相似）配基：分离抗体用抗原，半抗原分离抗体用抗原，半抗原分离酶用底物，抑制剂，辅助因子等分离酶用底物，抑制剂，辅助因子等通用型配基，巯基丙基琼脂糖通用型配基，巯基丙基琼脂糖含巯基配体亲和色谱分离原理亲和色谱配基与载体的结合琼脂糖的溴化氰活化法琼脂糖的溴化氰活化法6-6-氨基己酸琼脂糖和氨基己酸琼脂糖和,1,6-,1,6-己二胺琼脂糖己二胺琼脂糖亲和层析的特点：层析柱短层析柱短配基与大分子间以氢键离子键或疏水相互作用结合配基与大分子间以氢键离子键或疏水相互作用结合结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！36