生物大分子分离纯化技术

生物大分子分离纯化技术生物大分子分离纯化技术2.4.生物大分子的色谱分离纯化技术22.4.1 高效毛细管电泳高效毛细管电泳 高高效效毛毛细细管管电电泳泳(High-performance Capillary Electrophoresis,HPCE)是是荷荷电电粒粒子子在在直直流流高高压压的的作作用用下下，在在毛毛细细管管中中迁迁移移，从从而而进进行行高高效效、快快速速分分离离的的一一种种电电泳泳新新技技术术。其其分分离离是是基基于于带带电电离离子子在在电电场场中中的的不不同同的的电电泳泳淌淌度度。它它的的基基本本原原理理与与常常规规凝凝胶胶电电泳泳或或自自由由电电泳泳并并无无本本质质的的差差别别。所所以以，HPCE可可以以看看成成是是一一种种仪仪器器化化程程度度比比较较高高的的电电泳泳方方式。式。3由由于于毛毛细细管管具具有有良良好好的的散散热热性性能能，从从而而可可以以在在毛毛细细管管两两端端加加上上高高达达30000 V 的的高高压压、分分离离可可以以在在很很短短时时间间内内完完成成，分分离离效效率率非非常常高高。这这种种方方法法所所需需样样品品体体积积只只有有 L-nL级级。所所以以，HPEC法法的的特特点点为为：高高效效、快快速速、微微量量、易易于于实实现现自自动动化化，而而且且溶溶剂剂消耗少、环境污染小等等。消耗少、环境污染小等等。4仪器仪器 HPCEHPCE仪仪器器的的基基本本组组成成如如图图所所示示，它它由由毛毛细细管管，带带电电极极的的容容器器，高高压压直直流流电电源源，进进样样系系统统，检检测测器器及及数数据据采采集集和和记记录录系系统统组组成成。比比较较先先进进的的HPCEHPCE仪仪器器还还配配有有毛毛细细管管恒恒温温设设备备，自自动动采采样样器器，微微制制备备组组分分收集器和基于计算机的自动化及数据评价系统。收集器和基于计算机的自动化及数据评价系统。56 1毛细管毛细管 HPCE在在 毛毛 细细 管管 中中 进进 行行，管管 内内 径径 一一 般般 在在25100 m之之间间，外外径径在在100400 m之之间间长长度度为为0.11m。除除了了石石英英毛毛细细管管外外，玻玻璃璃、聚聚四四氟氟乙乙烯烯(PTPE)及聚氟乙烯及聚氟乙烯-丙烯毛细管也有使用。丙烯毛细管也有使用。7 2 2进样系统进样系统 为为了了保保证证HPCEHPCE分分离离的的高高效效性性，进进样样系系统统应应尽尽量量把把nL-pLnL-pL级级的的样样品品以以最最短短的的样样品品区区带带引引入入到到毛毛细细管管中。中。一般可采用电动法或流体力学法。一般可采用电动法或流体力学法。8 3高压直流电源高压直流电源 高高压压电电源源需需提提供供高高达达30 kV的的直直流流电电压压。检检测测器器位位于于毛毛细细管管的的接接地地端端，电电流流在在3300 A之之间间。电电源源应应能能以以恒恒电电压压或或恒恒电电流流(ITP)或或恒恒功功率率的的方方式式工工作作，其其稳稳定定件件应应达达到到设设置置值值的的 0.1%。另另外外，电电源源的的正正负负极极应应可可以以切切换换，以以适适应应带带不不同同电电荷荷的的样样品的分离。品的分离。9 4 4检测检测 HPEC HPEC这种方法的灵敏度及高效性都依赖于检测这种方法的灵敏度及高效性都依赖于检测器的高灵敏度，实际已经采用的检测器类型有多种。器的高灵敏度，实际已经采用的检测器类型有多种。10HPEC中的主要检测技术中的主要检测技术检测原理检测原理 最低检出浓度最低检出浓度(mol/L)最低检出量最低检出量 适用范围适用范围紫外可见吸收法紫外可见吸收法 10-610-4 10-1510-13 通用通用/特殊情特殊情况况基于一般光源的荧光法基于一般光源的荧光法 10-810-5 10-1810-13 特殊情况特殊情况基于激光的荧光法基于激光的荧光法 10-1210-9 10-2110-18 特殊情况特殊情况热光吸收法热光吸收法 10-810-5 10-1710-14 通用通用/特殊情特殊情况况折射率法折射率法 10-710-5 10-1610-14 通用通用电导法电导法 10-810-6 10-1910-17 特殊情况特殊情况安培法安培法 10-810-6 10-1910-17 特殊情况特殊情况质谱法质谱法 10-910-5 10-1710-15 通用通用放射测定法放射测定法 10-910-7 10-1910-17 特殊情况特殊情况11分离模式分离模式 HPCE的的操操作作模模式式有有多多种种，如如毛毛细细管管区区带带电电泳泳(Capillary Zone Electrophoresis,CZE)；毛毛细细管管等等速速电电泳泳(Capillary Isotachophoresis，CITP)，毛毛 细细 管管 胶胶 束束 电电 动动 色色 谱谱(Capillary Micellar Electrokinetic Chromatography，CEKC)；毛毛细细管管凝凝胶胶电电泳泳(Capillary Gel Electrophoresis，CGE)和和毛毛细细管管等等电电聚聚焦焦法法(Capillary Isoelectric Focusing，CIEF)等。等。12 CZECZE是是基基于于溶溶质质在在自自由由溶溶液液中中淌淌度度差差异异的的电电泳泳分分离离方方法法，是是目目前前应应用用最最广广泛泛的的一一种种，如如氨氨基基酸酸、多多肽肽及及无无机机离离子子的的分分析析，手手性性对对映映体体分分离离，蛋白质纯度鉴定及构型研究等。蛋白质纯度鉴定及构型研究等。13 CGE主主要要在在生生物物学学上上用用于于大大分分子子的的分分离离分分析析，如如蛋蛋白白质质和和核核酸酸。它它是是基基于于分分子子的的尺尺寸寸，让让样样品品在在合合适适的的起起分分子子筛筛作作用用的的聚聚合合物物网网孔孔内内进进行行电电泳泳分分离。离。CGE可用于可用于DNA序列分析，蛋白质分析。序列分析，蛋白质分析。14pBR332 DNA的的MSPI酶解片段混合物的酶解片段混合物的CGE分离分离(峰(bP)：1，26；2，34；3,67；4,76；5,90；6,110；7,123；8、9,147,10,11，160；12，180；13，190；14，201；15，2I7；16，238；17，242。缓冲液：TEB。进样：3s，30 mW。TEB组成：89 mmol/L Tris,89mmol/L 硼酸盐及2 mmol/L EDTA)。200V/cm，毛细管有效长度：7cm，EB的浓度为1g/ml15标准蛋白质的分离162.4.2 2.4.2 液相色谱法液相色谱法 液液相相色色谱谱是是目目前前对对生生物物大大分分子子的的分分离离纯纯化化能能力力最最强强、效效率率最最高高、使使用用最最广广泛泛的的手手段段之之一一。液液相相色色谱谱大大都都在在室室温温下下操操作作，所所用用流流动动相相可可以以用用与与生生理理液液相相近近的的缓缓冲冲水水溶溶液液。所所用用固固定定相相的的表表面面经经过过化化学学修修饰饰和和覆覆盖盖，为为生生物物大大分分子子的的分分离离分分析析提提供供了了温温和和的的条条件件，有有利利于于保保持持生生物物大大分分子子的的构构象象和和活活性。性。17 在在生生物物大大分分子子分分离离分分析析及及纯纯化化中中最最常常用用的的色色谱谱方方法法是是空空间间排排阻阻色色谱谱法法、离离子子交交换换色色谱谱法法、反反相相色色谱谱法法、疏疏水水作作用用色色谱谱法法、亲亲和和色色谱谱法法、羟羟基基磷磷灰灰石石(用用于于单单链链和和双双链链DNA的的纯纯化化和和鉴鉴定定)及及液液液液分配色谱法。分配色谱法。18核酸的色谱分离法核酸的色谱分离法19酶及蛋白质的各种分离纯化方法的比较酶及蛋白质的各种分离纯化方法的比较201 排阻色谱 排排阻阻色色谱谱(Size Exclusion Chromatography,SEC)也也被被称称之之为为凝凝胶胶过过滤滤色色谱谱是是20世世纪纪60年年代代发发展展起起来来的一种特别适合于生物大分子分离和纯化的技术。的一种特别适合于生物大分子分离和纯化的技术。21基本原理基本原理 排排阻阻色色谱谱是是依依据据分分离离样样品品物物质质分分子子大大小小而而进进行行分分离离的的一一种种方方法法，其其固固定定相相由由一一种种惰惰性性的的凝凝胶胶颗颗粒粒构构成成，颗颗粒粒内内部部有有许许多多网网孔孔。颗颗粒粒和和网网孔孔的的大大小小都都可可以以人人为为地地去去控控制制和和选选择择。在在分分离离过过程程中中，比比网网孔孔大大的的分分子子不不能能进进入入网网孔孔的的内内部部，它它们们只只限限于于在在凝凝胶胶颗颗粒粒之之间间的的流流动动相相空空间间里里向向下下流流动动，其其流流程程短短流流动动速速度度快快，而而比比网网孔孔小小的的分分子子能能扩扩散散到到网网孔孔的的内内部部，因因而而向向下下移移动动时时所所经经历历的的流流程程长长，下下行行速速度度慢慢。最最终终所所产产生生的的结结果果是是：分分子子越越大大移移动动的的越越快快，从从而而达达到大小不同分子间的分离。到大小不同分子间的分离。2223凝胶色谱的物理特性凝胶色谱的物理特性 1凝胶颗粒的大小和形状凝胶颗粒的大小和形状 层层析析用用凝凝胶胶的的形形状状均均为为球球形形，内内部部具具有有高高密密度度网孔，并能形成均一的柱床。网孔，并能形成均一的柱床。2排阻极限排阻极限(Exclusion Limit)排排阻阻极极限限指指不不能能扩扩散散进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒网网孔孔内内部部的的最最小小溶溶质质分分子子的的分分子子量量大大小小。排排阻阻极极限限的的涵涵义义是是能能有有效效分分离离一一定定形形状状分分子子的的分分子子量量最最大大极极限限。大大于于这这一一极极限限的的所所有有分分子子，都都在在同同一一区区带带内内被被快快速速洗洗脱脱出出。典典型型的的葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶Sephadex G-50(G50)排阻极限为排阻极限为3.010424 3分级分离范围分级分离范围(Fractionation Range)该该物物理理性性质质表表示示某某种种凝凝胶胶允允许许溶溶质质分分子子量量在在多大范围内能得到线性分离。多大范围内能得到线性分离。如如上上所所述述的的G50的的分分级级分分离离范范围围为为1.51033.0104。4.得水率得水率(Water Regain,Wr)每每1g干干凝凝胶胶吸吸收收水水的的克克数数就就叫叫得得水水率率。对对G50凝凝胶胶，其其得得水水率率为为5.0 0.38，这这个个数数值值只只表表示示吸吸进进凝胶颗粒内部的水分，不包括凝胶周围的水分。凝胶颗粒内部的水分，不包括凝胶周围的水分。255床体积床体积(Bed Volume)每每1g干凝胶吸水膨化后的最后体积就叫床体积。干凝胶吸水膨化后的最后体积就叫床体积。6外水体积外水体积(Void Volume,V0)凝凝胶胶装装柱柱以以后后，凝凝胶胶周周围围所所有有空空间间的的总总体体积积就就叫叫外外水体积。水体积。7洗脱体积洗脱体积(Elution Volume,Vc)指指从从柱柱床床上上将将样样品品中中某某一一物物质质洗洗脱脱下下来来所所需需洗洗脱脱液液的总体积。的总体积。26 在在凝凝胶胶层层析析中中，最最常常用用的的四四种种凝凝胶胶是是：葡葡聚聚糖糖 凝凝 胶胶(Dextran)、聚聚 丙丙 烯烯 酰酰 胺胺 凝凝 胶胶(Polyacrylamine)、琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶(Agarose)以以及及后两者的复合凝胶。后两者的复合凝胶。27凝胶排阻层析的应用凝胶排阻层析的应用 凝凝胶胶排排阻阻层层折折的的用用途途非非常常多多，主主要要有有以以下下两两个个方面：方面：(1)脱脱盐盐 在在生生物物大大分分子子纯纯化化过过程程中中，常常要要除除去去无无机机盐盐、有有机机溶溶剂剂及及其其它它小小分分子子杂杂质质，利利用用凝凝胶胶排阻分离是一种廉价、简便又快速的方法；排阻分离是一种廉价、简便又快速的方法；(2)生生物物大大分分子子纯纯化化 凝凝胶胶层层析析应应用用最最为为广广泛泛的的一一个个方方面面是是生生物物大大分分子子的的分分离离和和纯纯化化，因因为为凝凝胶胶具具有有根根据据分分子子量量的的大大小小而而分分级级分分离离生生物物大大分分子子的的能力。能力。282 亲和层析亲和层析(Affinity Chromatography)常规层析的不足常规层析的不足 大大多多数数层层析析法法都都是是依依据据样样品品物物质质和和固固定定相相之之间间的的非非特特异异性性相相互互作作用用，如如根根据据样样品品物物质质的的电电荷荷性性质质、大大小小、极极性性、分分配配系系数数、吸吸附附等等作作用用的的差差别别进进行行分分离的。由于选择性不够强，故分离效率不高。离的。由于选择性不够强，故分离效率不高。29 近近年年来来又又发发展展了了一一种种新新的的层层析析法法“亲亲和和层层析析法法”，又称，又称特异配基层析法特异配基层析法”。一一些些生生物物大大分分子子能能和和高高分分子子化化合合物物发发生生特特异异性性的的化化学学反反应应，这这些些反反应应是是可可逆逆的的、特特异异的的。根根据据这这一一性性质质所所进进行行的的分分离离就就叫叫亲亲和和层层析析。与与生生物物大大分分子子可可逆逆而而又又特特异异性性结结合合的的分分子子就就叫叫配配基。基。30基本原理基本原理 亲亲和和层层析析的的原原理理可可用用一一个个亲亲和和对对来来说说明明。如如生生物物大大分分子子抗抗体体可可以以与与其其对对应应的的抗抗原原发发生生如如上上所所述述的的亲亲和和作作用用。若若把把抗抗原原固固定定在在类类似似于于凝凝胶胶的的固固相相载载体体上上得得到到亲亲和和固固定定相相，在在进进行行层层析析分分离离时时，抗抗体体与与抗抗原原间间发发生生特特异异性性的的亲亲和和作作用用，而而其其他他的的物物质质不不能能与与固固定定相相结结合合。因因而而被被洗洗脱脱出出。然然后后用用一一种种特特殊殊的的洗洗脱脱剂剂把把抗抗体体从从亲亲和和柱柱上上洗洗脱脱下下来来也也可可以以固固相相抗抗体体来来提提纯纯、分分离离抗抗原原。亲亲和和层层析析已已被被广广泛泛地地用用于于酶酶类类、运运输输蛋蛋白白、抗抗体体、激激素素受受体体蛋蛋白白、药药物物结结合合蛋蛋白白、核核酸酸、神神经经递递质质蛋蛋白白以以及及其其它它生生物物大大分分子子物物质质的的分分离分析。离分析。3132抗体亲和层析纯化示意图抗体亲和层析纯化示意图33 亲亲和和层层析析的的成成败败取取决决于于精精细细的的实实验验条条件件的的选选择择，其其中中最最主主要要的的是是制制备备带带有有共共价价结结合合配配基基的的固定相以及洗脱条件的优化。固定相以及洗脱条件的优化。34亲和层析的固定相载体必须符合以下要求亲和层析的固定相载体必须符合以下要求(1)在实验条件下具有化学及物理稳定性在实验条件下具有化学及物理稳定性(2)非特异性吸附要尽可能小；非特异性吸附要尽可能小；(3)具有均匀的网状空隙结构；具有均匀的网状空隙结构；(4)具有和配基结合的活性基团。具有和配基结合的活性基团。35亲和色谱的应用亲和色谱的应用 基基于于羟羟基基磷磷灰灰石石固固定定相相的的亲亲和和色色谱谱可可用用于于单单链链和和双双链链DNA的的纯纯化化和和鉴鉴定定。DNA与与羟羟基基磷磷灰灰石石的的相相互互作作用用基基于于DNA磷磷酸酸酯酯骨骨架架与与羟羟基基磷磷灰灰石石中中的的钙钙离离子子间间的的相相互互作作用用。洗洗脱脱时时用用磷磷酸酸缓缓冲冲液液，核核酸酸分分子子的的亲亲和和性性受受其其分分子子中中磷磷酸酸基基团团的的控控制制。单单链链DNA分分子子的的结结构构可可变变无无序序，它它与与刚刚性性有有序序的的双双链链DNA分分子子相相比比，其其亲亲和和性性要要小小。杂杂交交的的双双链链DNA及及部部分分变变性性的的DNA分分子子的的亲亲和和性性适适中中。因因此此，单单链链DNA分分子子的的结结合合弱弱，结结合合的的双双链链DNA分分子子可可以以通通过过增增加加磷磷酸酸洗洗脱脱缓冲液的浓度使之解离。缓冲液的浓度使之解离。363 离子交换色谱离子交换色谱 离离子子交交换换色色谱谱(Ion Exchange Chromatography,IEC)是是生生物物大大分分子子分分级级分分离离的的最最可可靠靠的的方方法法之之一一，它它分分离离蛋蛋白白质质、核核酸酸等等是是依依据据生生物物大大分分子子的的电电荷荷特特性性，因因而而依依赖赖于于系系统统的的pH及及分分离离物物质质的的等等电电点点(pI)。当当缓缓冲冲溶溶液液的的pH高高于于生生物物分分子子的的pI时时，应应采采用用阴阴离离子子交交换换树树脂脂，反反之之，应应采采用用阳阳离离子子交交换树脂。换树脂。生生物物大大分分子子非非常常小小的的电电荷荷差差异异都都可可以以用用IEC法法分离开。分离开。374 反相疏水作用色谱法反相疏水作用色谱法 反反相相色色谱谱(Reverse-phase Chromatography,RPC)及及 疏疏 水水 作作 用用 色色 谱谱(Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC)法法依依据据的的是是生生物物大大分分子子表表面面疏水性。疏水性。反反相相色色谱谱是是基基于于溶溶质质、极极性性流流动动相相和和非非极极性性固固定定相相表表面面之之间间的的疏疏水水作作用用建建立立的的一一种种色色谱谱模模式式。而而疏疏水水作作用用色色谱谱与与反反相相色色谱谱的的原原理理相相同同，只只是是填填料料表表面面疏水性弱一些。疏水性弱一些。38 蛋蛋白白质质及及多多肽肽的的疏疏水水基基因因一一般般包包埋埋在在分分子子的的内内部部许许多多生生物物大大分分子子尽尽管管是是亲亲水水性性的的，但但它它们们也也有有足足够够多多的的疏疏水水基基团团暴暴露露在在分分子子的的表表面面，因因而而可可以以与与载载体体表表面面的的疏疏水水基基团团发发生生相相互互作作用用。在在上上述述两两种种技技术术中中固固定定相相都都由由具具有有疏疏水水表表面面的的色色谱谱基基质质所所组组成成，但但与与反反相相色色谱谱相相比比，疏疏水水作作用用色色谱谱载载体体表表而而的的疏疏水水基基团团的的密密度度要要低低得得多多，因因而而它它的的选选择择性性高高，洗洗脱脱强强度度相相应应低低，有有利利于于生生物物大大分分子子的的洗洗脱脱及及生生物物活活性性的的保保持持。高高盐盐浓浓度度可增强生物分子与载体的疏水相互作用可增强生物分子与载体的疏水相互作用.反相色谱法常作为一种制备色谱用于核酸相关的研究。反相色谱法常作为一种制备色谱用于核酸相关的研究。395.5.液液分配色谱液液分配色谱 在在液液液液分分配配色色谱谱中中，流流动动相相和和固固定定相相均均为为液液体体，分分离离基基于于DNADNA分分子子在在两两种种液液相相间间的的分分配配差差异异，但但液液体体固固定定相相是是通通过过物物理理吸吸附附或或化化学学键键合合的的方方式式固固定定在支持载体的表面上的。在支持载体的表面上的。40 常常见见的的液液液液分分配配色色谱谱中中含含有有两两种种液液体体，如如水水合合聚聚乙乙烯烯醇醇(PEG)和和葡葡聚聚糖糖(DX)。PEG和和DX之之间间由由于于缺缺乏乏相相互互作作用用而而成成为为完完全全分分离离的的两两相相，DX可可以以通通过过共共价价键键键键合合固固定定在在固固相相载载体体的的表表面面而而作作为为固固定定相相。因因此此，DNA在在两两相相间间的的分分配配系系数数主主要要依依赖赖于于溶溶质质的的表表面面积积，即即DNA分分子子的的分分子子质质量量，但但两两相相中中所所存存在在的的离离子子的的浓浓度度及及其其性性质质会会对对DNA的的分分配配产产生生极极大大的的影影响响。当当盐盐的的浓浓度度大大于于0.5 mol/L时时，核核酸酸在在DX中中的的溶溶解解度度远远远远高高于于在在PEG中中的的溶溶解解度度。这这是是由由于于阴阴离离子和阳离子在两相间的不等价分配造成的。子和阳离子在两相间的不等价分配造成的。41