DNA与基因芯片

目目 录录第第 二二 十十 一一 章章基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗Genetic Diagnosis and Gene Therapy南方医科大学基因工程研究所南方医科大学基因工程研究所郭秋野郭秋野目目 录录基因变异致病类型基因变异致病类型内源基因的变异：内源基因的变异：基因结构突变基因结构突变基因表达异常基因表达异常外源基因的入侵：外源基因的入侵：基因诊断和基因治疗基因诊断和基因治疗遗传性疾病遗传性疾病肿瘤、心脑血管病等肿瘤、心脑血管病等（生殖细胞）（生殖细胞）（体细胞）（体细胞）病毒感染性疾病：病毒感染性疾病：HIVHIV、SARSSARS、HCVHCV、HPVHPV目目 录录第第 一一 节节 基基 因因 诊诊 断断Genetic Diagnosis目目 录录 特点：特点：针对性强：针对性强：病因学检测病因学检测 特异性强：特异性强：分子杂交技术分子杂交技术灵敏度高：灵敏度高：PCRPCR、分子杂交放大效应，样品量少分子杂交放大效应，样品量少适应性强：适应性强：内源、外源基因内源、外源基因早期快速诊断：早期快速诊断：一、基因诊断的概念和特点一、基因诊断的概念和特点定义：定义：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。正常，从而对疾病作出诊断的方法。目目 录录二、基因诊断常用技术方法二、基因诊断常用技术方法（一）核酸分子杂交技术（一）核酸分子杂交技术（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应 (PCR)（三）基因测序三）基因测序（四）基因芯片（四）基因芯片目目 录录二、基因诊断常用技术方法二、基因诊断常用技术方法n限制性内切酶谱分析法限制性内切酶谱分析法nDNA限制性长度多态性限制性长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RLFP)间接间接分分析析（一）核酸分子杂交技术（一）核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术原理：核酸分子杂交技术原理：目目 录录核酸分子杂交的流程示意图待测核酸制备待测核酸制备滤膜上核酸固化滤膜上核酸固化杂杂 交交去除未参与杂交的探针去除未参与杂交的探针检检 测测 杂杂 交交 信信 号号制备探针核酸片段制备探针核酸片段探探 针针 标标 记记加入标记核酸探针加入标记核酸探针目目 录录Mst酶切位点酶切位点(GCTNAGG)53正常基因正常基因53突变基因突变基因1.15kb1.35kb1.镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析0.2kb正常正常 珠蛋白基因：珠蛋白基因：5CCTGAGG3镰刀型贫血镰刀型贫血 ：5CCTGTGG3目目 录录+0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者1.镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析目目 录录nDNA多态性多态性：中性突变导致个体间核苷酸序列的差异中性突变导致个体间核苷酸序列的差异n限制性长度多态性分析：限制性长度多态性分析：突变发生在酶切位点上，酶切突变发生在酶切位点上，酶切DNA片段不同长度片段不同长度nRFLP：孟德尔方式遗传，家族中，与某一疾病紧密连锁，孟德尔方式遗传，家族中，与某一疾病紧密连锁，作为遗传标志，判定家族成员是否携带致病基因作为遗传标志，判定家族成员是否携带致病基因n应用：应用：甲型血友病、囊性纤维病变、甲型血友病、囊性纤维病变、苯丙酮尿症苯丙酮尿症2.DNA限制性长度多态性分析限制性长度多态性分析目目 录录RLFP分析法分析法目目 录录单基因病单基因病-苯丙酮尿症苯丙酮尿症I 型型病因：肝脏合成的苯丙氨酸羟化酶病因：肝脏合成的苯丙氨酸羟化酶病因：肝脏合成的苯丙氨酸羟化酶病因：肝脏合成的苯丙氨酸羟化酶（Phenylalanina HydrozylasePhenylalanina Hydrozylase,PAH,PAH）缺乏。缺乏。缺乏。缺乏。主征：智力低下，尿有霉味主征：智力低下，尿有霉味主征：智力低下，尿有霉味主征：智力低下，尿有霉味治疗：新生儿诊断明确后，即用低苯丙氨酸饮治疗：新生儿诊断明确后，即用低苯丙氨酸饮治疗：新生儿诊断明确后，即用低苯丙氨酸饮治疗：新生儿诊断明确后，即用低苯丙氨酸饮食控制血中苯丙氨酸浓度，食控制血中苯丙氨酸浓度，食控制血中苯丙氨酸浓度，食控制血中苯丙氨酸浓度，改善脑子的发育，改善脑子的发育，改善脑子的发育，改善脑子的发育，而而而而“危险期危险期危险期危险期”一过，病婴后来就基本正常。一过，病婴后来就基本正常。一过，病婴后来就基本正常。一过，病婴后来就基本正常。PAHPAHPAHPAH仅仅存在于肝存在于肝存在于肝存在于肝脏细脏细胞中，在胞中，在胞中，在胞中，在绒绒毛、羊毛、羊毛、羊毛、羊水水水水细细胞和胎儿血中均不表达，故不能通胞和胎儿血中均不表达，故不能通胞和胎儿血中均不表达，故不能通胞和胎儿血中均不表达，故不能通过测过测定定定定酶酶酶酶活力及代活力及代活力及代活力及代谢产谢产物来物来物来物来进进行行行行PKUPKUPKUPKU的的的的产产前前前前诊诊断只能依断只能依断只能依断只能依赖赖于家系分析，找出与于家系分析，找出与于家系分析，找出与于家系分析，找出与PKUPKUPKUPKU致病基因相致病基因相致病基因相致病基因相连锁连锁的的的的RFLPRFLPRFLPRFLP，进进行基因行基因行基因行基因分析做出分析做出分析做出分析做出产产前前前前诊诊断断断断目目 录录（二二）聚合聚合酶酶链反反应（polymerasepolymerase chain reaction PCR chain reaction PCR）nPCRPCR定义定义：指由一对引物介导的基因或克隆：指由一对引物介导的基因或克隆的特定的特定DNADNA序列的酶促扩增的反应过程，是序列的酶促扩增的反应过程，是DNADNA的体外扩增技术，本质是的体外扩增技术，本质是DNADNA的体外复制。的体外复制。应用应用PCR技术可以使特定的基因或技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的片段在短短的23小时扩小时扩增至百万倍。增至百万倍。目目 录录（二二）聚合聚合酶酶链反反应Kary Mullis research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus co-winner of 1993 Nobel Prize 目目 录录PCR技术的基本原理技术的基本原理 n模板模板DNADNA的变性：的变性：9494热变性，使热变性，使DNADNA双链解双链解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；作准备；n模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：5555左右，左右，引物与模板引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；n引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板-引物结合物在引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用下，以聚合酶的作用下，以dNTPdNTP为反应原为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板原理，合成一条新的与模板DNA DNA 链互补的半保链互补的半保留复制链留复制链目目 录录PCR产物以指数形式增加，即产物以指数形式增加，即Y=2n (n 为循环次数为循环次数)目目 录录以以爱滋病的滋病的临床床检测为例，例，简要要说明一下明一下PCRPCR在在病毒感染的基因病毒感染的基因诊断中的断中的应用。用。组织中中总RNARNA的提取的提取 利用反利用反转录酶酶合成合成cDNA cDNA PCRPCR反反应：反反应缓冲液冲液 模板（上述合成的模板（上述合成的cDNAcDNA）底物（底物（dATPdATP,dGTPdGTP,dCTPdCTP,dTTPdTTP）引物（引物（爱滋病病毒特异性引物）滋病病毒特异性引物）TaqDNATaqDNA聚合聚合酶酶5050ll循循环：9595，3030secsec（变性）性）5555，1 1minmin（退火）退火）3030循循环 72，1min（延伸）延伸）目目 录录（三）基因测序技术（三）基因测序技术他们给他们给DNA 的测序带来了一场革命，分享了的测序带来了一场革命，分享了1980年的诺贝年的诺贝尔化学奖。后来尔化学奖。后来Sanger法发展为自动化测序法，并为人类法发展为自动化测序法，并为人类基因组测序做出了卓越贡献。基因组测序做出了卓越贡献。Fred Sanger 发明的发明的末端合成终止法末端合成终止法(sanger法法)Walter Gilbert发明的发明的化学裂解法化学裂解法 Maxam-Gillbert法法目目 录录末端合成终止法末端合成终止法(sanger法法)原理原理2,3-双脱氧核苷三磷酸（双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）与普通与普通dNTP不同不同之处在于其脱氧核糖的之处在于其脱氧核糖的3位置少一个羟基，可在位置少一个羟基，可在DNA聚聚合酶作用下通过其合酶作用下通过其5三磷酸基团掺入到正在增长的三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但链中，但ddNTP因缺乏因缺乏3羟基而不能同后续的羟基而不能同后续的dNTP形成形成磷酸二酯键，因此，当正在增长的磷酸二酯键，因此，当正在增长的DNA链末端碱基为链末端碱基为ddNTP时，则链延伸反应终止，不可能继续延伸。这样，时，则链延伸反应终止，不可能继续延伸。这样，在在DNA合成反应混合物的合成反应混合物的4种普通种普通dNTP中加入少量的一中加入少量的一种种ddNTP后，链延伸将与偶然发生却十分特异的链终止后，链延伸将与偶然发生却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始于从用以起始DNA合成引物末端到出现过早链终止的位合成引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离，结果将产生置之间的距离，结果将产生4类寡核苷酸，它们分别终止类寡核苷酸，它们分别终止于模板链的每一个于模板链的每一个A、C、G或或T的位置上。的位置上。目目 录录双脱氧链终止法的双脱氧链终止法的测序基础测序基础是以是以双脱氧核双脱氧核苷三磷酸苷三磷酸为循环测序反应的链终止剂。为循环测序反应的链终止剂。目目 录录 POHdNTPddNTP POHOH P P P POH末端合成终止法末端合成终止法(sanger法法)原理原理目目 录录5353引物引物模板模板DNAdNTPDNA聚合酶聚合酶ddATPddTTPddGTPddCTP末端合成终止法末端合成终止法(sanger法法)原理原理目目 录录末端合成终止法末端合成终止法(sanger法法)原理原理目目 录录目目 录录DNA自动测序结果目目 录录（四）基因芯片技术n快速、高通量、平行化、自动化快速、高通量、平行化、自动化 指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量基因探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）目目 录录（四）基因芯片技术目目 录录1.芯片的制备 Gene probes（cDNA、DNA）substrate Ready-to-usemicroarrayOligo probesAGCTorarrayer目目 录录Sample cells1)Extract RNA or DNA2)RT or PCR amplification3)Fluorescent labelingReference cellsSample readycombineLabeled RNA or DNA(Sample)Labeled RNA or DNA(Reference)2)1)3)1)2)3)2.基因表达谱双色标记目目 录录3.分子杂交1)hybridizeApply sample2)rinse目目 录录4.检测分析Laser 1Laser 2Detector 1Detector 2Scanner芯片的扫描目目 录录5.图 像 处 理Detector 1Detector 2False-color differential image目目 录录图 像 分 析基因诊断方法基因诊断方法经典基因诊断经典基因诊断.限制性内切酶法限制性内切酶法.RFLP分析法分析法.寡核苷酸分析法寡核苷酸分析法优优点点缺缺点点.特异基因诊断特异基因诊断.未知基因诊断未知基因诊断.直接，过程简直接，过程简单单.过程繁杂过程繁杂.准确性低，过程准确性低，过程繁繁.条件严格条件严格基因诊断进展基因诊断进展.PCR方法方法.PCR-序列分析法序列分析法.DNA芯片技术芯片技术.简单、经济、敏感简单、经济、敏感.操作直接、准确操作直接、准确.集成度高、快速、并行集成度高、快速、并行.假阳性高假阳性高.价格高价格高.尚无成熟产品问世尚无成熟产品问世目目 录录三、基因诊断的应用三、基因诊断的应用n遗传疾病遗传疾病n肿瘤肿瘤n感染性疾病，传染性流行病感染性疾病，传染性流行病n判断个体疾病易感性判断个体疾病易感性n器官移植组织配型器官移植组织配型n法医学中个体识别、亲子鉴定法医学中个体识别、亲子鉴定目目 录录小结n基因诊断的定义n基因诊断的特点n基因诊断的常用技术目目 录录第第 二二 节节 基基 因因 治治 疗疗Gene Therapy目目 录录定义定义早期早期是指用正常的基因整合入细胞基因组，是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。以校正和置换致病基因的一种治疗方法。目前目前广义上来讲是指将某种遗传物质转广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。达到治疗疾病目的的方法。一、基因治疗的概念一、基因治疗的概念目目 录录基因治疗的基本方法基因治疗的基本方法基因矫正基因矫正 (gene correction)基因置换基因置换 (gene replacement)基因增补基因增补 (gene augmentation)基因失活基因失活 (gene inactivation)目目 录录几种常见的基因失活技术几种常见的基因失活技术反义核酸技术反义核酸技术核酶技术核酶技术三链技术三链技术干扰干扰RNA技术技术基因治疗的其他方法：基因治疗的其他方法：如如“自杀基因自杀基因”的应用，基因疫苗等的应用，基因疫苗等目目 录录二、基因治疗的基本程序二、基因治疗的基本程序治疗性基因的选择治疗性基因的选择基因载体的基因载体的选择选择靶细胞的选择靶细胞的选择基因转移基因转移外源基因表达的筛选外源基因表达的筛选 利用在体中的标记基因利用在体中的标记基因回输体内回输体内病毒载体病毒载体非病毒载体非病毒载体体细胞体细胞生殖细胞生殖细胞间接体内疗法间接体内疗法直接体内疗法直接体内疗法目目 录录目目 录录三、基因治疗的应用与展望三、基因治疗的应用与展望应用应用展望展望遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、感染性疾病、神经系统疾病感染性疾病、神经系统疾病进一步寻找切实有效的基因进一步寻找切实有效的基因精密调控外源基因在人体内的表达精密调控外源基因在人体内的表达体细胞移植和重建的生物学研究体细胞移植和重建的生物学研究减少外源基因对机体的不利影响减少外源基因对机体的不利影响