流式细胞术课件

第六章第六章 流式细胞术流式细胞术 第六章第六章流式细胞术流式细胞术第一节第一节流式细胞术概述流式细胞术概述第二节第二节流式细胞术发展简史流式细胞术发展简史第三节第三节流式细胞仪主要技术指标流式细胞仪主要技术指标第四节第四节流式细胞仪主要构造和工作原理流式细胞仪主要构造和工作原理第五节第五节流式细胞术常规检测时的样品制备流式细胞术常规检测时的样品制备第六节第六节流式细胞计的调试和使用流式细胞计的调试和使用第七节第七节流式细胞术的应用流式细胞术的应用第一节第一节流式细胞术概述流式细胞术概述流式细胞术流式细胞术流式细胞术流式细胞术(Flow(FlowCytometryCytometry，FCM)FCM)是上世纪七是上世纪七是上世纪七是上世纪七十年代发展起来的高科学技术，它集计算机技术、十年代发展起来的高科学技术，它集计算机技术、十年代发展起来的高科学技术，它集计算机技术、十年代发展起来的高科学技术，它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，同时具有分析和分选细胞功能。体，同时具有分析和分选细胞功能。体，同时具有分析和分选细胞功能。体，同时具有分析和分选细胞功能。可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内表面和细胞浆抗原、细胞内表面和细胞浆抗原、细胞内表面和细胞浆抗原、细胞内DNADNA、RNARNA含量等含量等含量等含量等;可对群体细胞在单细胞水平上进行分析，可对群体细胞在单细胞水平上进行分析，可对群体细胞在单细胞水平上进行分析，可对群体细胞在单细胞水平上进行分析，在短时间在短时间在短时间在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析；能够分类收集进行多参数定量分析；能够分类收集进行多参数定量分析；能够分类收集进行多参数定量分析；能够分类收集(分选分选分选分选)某一亚某一亚某一亚某一亚群细胞，分选纯度大于群细胞，分选纯度大于群细胞，分选纯度大于群细胞，分选纯度大于95%95%。FCMFCM特点特点特点特点测量速度快，最快可在测量速度快，最快可在测量速度快，最快可在测量速度快，最快可在1 1秒种内计测数万个细胞秒种内计测数万个细胞秒种内计测数万个细胞秒种内计测数万个细胞；可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义学意义学意义学意义；是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术计算机技术计算机技术计算机技术、流体力学流体力学流体力学流体力学、细胞化学细胞化学细胞化学细胞化学、图像技术等图像技术等图像技术等图像技术等从多领域的知识和成果从多领域的知识和成果从多领域的知识和成果从多领域的知识和成果；既是细胞分析技术既是细胞分析技术既是细胞分析技术既是细胞分析技术，又是精确的分选技术又是精确的分选技术又是精确的分选技术又是精确的分选技术。FCMFCM发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果面的心血和成果面的心血和成果面的心血和成果，在血液学、免疫学、肿瘤学、，在血液学、免疫学、肿瘤学、，在血液学、免疫学、肿瘤学、，在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等基础学科和医学、检验学药物学、分子生物学等基础学科和医学、检验学药物学、分子生物学等基础学科和医学、检验学药物学、分子生物学等基础学科和医学、检验学等应用学科得到广泛应用。等应用学科得到广泛应用。等应用学科得到广泛应用。等应用学科得到广泛应用。目前使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生目前使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生目前使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生目前使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产：产：产：产：BECKMAN-COULTERBECKMAN-COULTER公司和公司和公司和公司和Becton-Becton-DickinsonDickinson公司公司公司公司(简称简称简称简称B-DB-D公司公司公司公司)。流式细胞仪主要有两型：临床型（又称小型机、流式细胞仪主要有两型：临床型（又称小型机、流式细胞仪主要有两型：临床型（又称小型机、流式细胞仪主要有两型：临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。综台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。综台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。综台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。综合型除具备检测分析功能外，还具有细胞分选功合型除具备检测分析功能外，还具有细胞分选功合型除具备检测分析功能外，还具有细胞分选功合型除具备检测分析功能外，还具有细胞分选功能，多用于科学研究。能，多用于科学研究。能，多用于科学研究。能，多用于科学研究。第二节第二节流式细胞术发展简史流式细胞术发展简史19341934年，年，年，年，MoldavanMoldavan首次提出了使悬浮的单个血红首次提出了使悬浮的单个血红首次提出了使悬浮的单个血红首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。细胞团块的淤阻。细胞团块的淤阻。细胞团块的淤阻。19531953年年年年Crosland-TaylorCrosland-Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆根据雷诺对牛顿流体在圆根据雷诺对牛顿流体在圆根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到形管中流动规律的研究认识到形管中流动规律的研究认识到形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的管中轴线流过的管中轴线流过的管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。强的流体动力聚集作用。强的流体动力聚集作用。强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，于是设计了一个流动室，于是设计了一个流动室，于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。基础。基础。基础。19561956年，年，年，年，CoulterCoulter在多年研究的基础上利用在多年研究的基础上利用在多年研究的基础上利用在多年研究的基础上利用CoulterCoulter效应生产了效应生产了效应生产了效应生产了CoulterCoulter计数器。其基本原理是：使细计数器。其基本原理是：使细计数器。其基本原理是：使细计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。19671967年年年年HolmHolm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。的细胞，再由光电检测设备计数的装置。的细胞，再由光电检测设备计数的装置。的细胞，再由光电检测设备计数的装置。19731973年年年年SteinkampSteinkamp设计了一种利用激光激发双色荧设计了一种利用激光激发双色荧设计了一种利用激光激发双色荧设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代胞分选的装置。这样就基本完成了现代胞分选的装置。这样就基本完成了现代胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCMFCM计数计数计数计数技术的主要历程。技术的主要历程。技术的主要历程。技术的主要历程。现代的现代的现代的现代的FCMFCM数据采集和分析技术是从数据采集和分析技术是从数据采集和分析技术是从数据采集和分析技术是从组织化学组织化学组织化学组织化学发发发发源的。源的。源的。源的。19651965年，年，年，年，KamentskyKamentsky在在在在组织化学组织化学组织化学组织化学的基础上提出了的基础上提出了的基础上提出了的基础上提出了两个新设想：两个新设想：两个新设想：两个新设想：(1)(1)细胞的组分是可以用光度学来定细胞的组分是可以用光度学来定细胞的组分是可以用光度学来定细胞的组分是可以用光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。胞组织化学的重要信息。胞组织化学的重要信息。胞组织化学的重要信息。(2)(2)细胞的不同组分可以细胞的不同组分可以细胞的不同组分可以细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。KamentskyKamentsky不仅思路敏捷，而且能身体力行。他不仅思路敏捷，而且能身体力行。他不仅思路敏捷，而且能身体力行。他不仅思路敏捷，而且能身体力行。他是第一个把计算机接口接到仪器上并记录分析了是第一个把计算机接口接到仪器上并记录分析了是第一个把计算机接口接到仪器上并记录分析了是第一个把计算机接口接到仪器上并记录分析了多参数数据的人，也是第一个采用了二维直方图多参数数据的人，也是第一个采用了二维直方图多参数数据的人，也是第一个采用了二维直方图多参数数据的人，也是第一个采用了二维直方图来显示和分析多参数的人。来显示和分析多参数的人。来显示和分析多参数的人。来显示和分析多参数的人。流式细胞术在流式细胞术在流式细胞术在流式细胞术在细胞化学细胞化学细胞化学细胞化学中的应用的先驱者是中的应用的先驱者是中的应用的先驱者是中的应用的先驱者是VanVanDillaDilla和美国的和美国的和美国的和美国的LosAlamosLosAlamos小组。小组。小组。小组。19671967年年年年该研究组该研究组该研究组该研究组研制出流液束、照明光轴、检测研制出流液束、照明光轴、检测研制出流液束、照明光轴、检测研制出流液束、照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，首次用荧光首次用荧光首次用荧光首次用荧光FeulgenFeulgen反应对反应对反应对反应对DNADNA染色显示出染色显示出染色显示出染色显示出DNADNA的活性与荧光之间存在着线性关系，并在的活性与荧光之间存在着线性关系，并在的活性与荧光之间存在着线性关系，并在的活性与荧光之间存在着线性关系，并在DNADNA的的的的直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。GohdeGohde 和和和和DittrichDittrich接着把这项技术推向实用，他们接着把这项技术推向实用，他们接着把这项技术推向实用，他们接着把这项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动力学问题。力学问题。力学问题。力学问题。FCMFCM用于免疫组织化学中的关键是对用于免疫组织化学中的关键是对用于免疫组织化学中的关键是对用于免疫组织化学中的关键是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并没有多大差异。用并没有多大差异。用并没有多大差异。用并没有多大差异。第三节第三节流式细胞仪主要技术指标流式细胞仪主要技术指标3.1流式细胞仪的分析速度流式细胞仪的分析速度3.2流式细胞仪的荧光检测灵敏度流式细胞仪的荧光检测灵敏度3.3前向角散射（前向角散射（FSC）光检测灵敏度）光检测灵敏度3.4流式细胞仪的分辨率流式细胞仪的分辨率3.5流式细胞仪的分选速度流式细胞仪的分选速度3.1流式细胞仪的分析速度流式细胞仪的分析速度一般流式细胞仪每秒检测一般流式细胞仪每秒检测一般流式细胞仪每秒检测一般流式细胞仪每秒检测1000100050005000个细胞，大个细胞，大个细胞，大个细胞，大型机可达每秒上万个细胞。型机可达每秒上万个细胞。型机可达每秒上万个细胞。型机可达每秒上万个细胞。3.2流式细胞仪的荧光检测灵敏度流式细胞仪的荧光检测灵敏度最多能测出单个细胞上达最多能测出单个细胞上达最多能测出单个细胞上达最多能测出单个细胞上达600600个的荧光分子，两个个的荧光分子，两个个的荧光分子，两个个的荧光分子，两个细胞间的荧光差大于细胞间的荧光差大于细胞间的荧光差大于细胞间的荧光差大于5%5%即可区分。即可区分。即可区分。即可区分。3.3前向角散射（前向角散射（FSC）光检测灵敏度）光检测灵敏度前向角散射反映被测细胞的大小，一般流式细胞前向角散射反映被测细胞的大小，一般流式细胞前向角散射反映被测细胞的大小，一般流式细胞前向角散射反映被测细胞的大小，一般流式细胞仪能够测量到仪能够测量到仪能够测量到仪能够测量到0.2m0.2m0.5m0.5m。3.4流式细胞仪的分辨率流式细胞仪的分辨率用变异系数用变异系数CV值来表示，一般流式细胞仪值来表示，一般流式细胞仪能够达到低于能够达到低于2.0%，这也是测量标本前用，这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。荧光微球调整仪器时要求必须达到的。3.5流式细胞仪的分选速度流式细胞仪的分选速度一般流式细胞仪分选速度大于一般流式细胞仪分选速度大于1000个个/秒，秒，分选细胞纯度可达分选细胞纯度可达99%以上。以上。第四节第四节流式细胞仪主要构造和工作原理流式细胞仪主要构造和工作原理4.1流动室及液流驱动系统流动室及液流驱动系统4.2激光光源及光束形成系统激光光源及光束形成系统4.3光学系统光学系统4.4信号系统（检测、存储、显示和分析）信号系统（检测、存储、显示和分析）4.5细胞分选系统细胞分选系统流式细胞仪结构示意图流式细胞仪结构示意图4.1流动室及液流驱动系统流动室及液流驱动系统流动室流动室(FlowCell或或FlowChamber)是流是流式细胞仪的核心部件式细胞仪的核心部件流动室由石英玻璃制成流动室由石英玻璃制成单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔过流动室内的一定孔径的孔检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。次通过激光检测区。流动室孔径有流动室孔径有60m、100m、150m、250m等多种，供检测者选择。小型仪器一等多种，供检测者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。般固定装置了一定孔径的流动室。流动室里的鞘液流一般是稳定流动，控制鞘流动室里的鞘液流一般是稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成。系列压力系统、压力感受器组成。调整好鞘液压力和标本管压力调整好鞘液压力和标本管压力,鞘液流包鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。4.2激光光源及光束形成系统激光光源及光束形成系统流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的，荧光信号的强弱与激发光的强光激发的，荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关。度和照射时间相关。激光是一种相干光源，能提供单波长、高激光是一种相干光源，能提供单波长、高强度、高稳定性的光照。强度、高稳定性的光照。流式细胞仪可配备一根或多根激光管，常流式细胞仪可配备一根或多根激光管，常用氩离子气体激光管（波长用氩离子气体激光管（波长488nm），此外），此外可配备氦氖离子气体激光管（波长可配备氦氖离子气体激光管（波长633nm）和和/或紫外激光管。或紫外激光管。在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜，在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜，将激光光源发出的横截面为圆形的激光光将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22m66m)椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布，使椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致。通过激光检测区的细胞受照强度一致。4.3光学系统光学系统流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，可分为流动室前和流动室后两组。片组成，可分为流动室前和流动室后两组。片组成，可分为流动室前和流动室后两组。片组成，可分为流动室前和流动室后两组。流动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小流动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小流动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小流动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小孔（一般为孔（一般为孔（一般为孔（一般为2 2片透镜、片透镜、片透镜、片透镜、1 1个小孔）的主要作用是将激个小孔）的主要作用是将激个小孔）的主要作用是将激个小孔）的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束，使激光能量成正态分布，面较小的椭圆形激光光束，使激光能量成正态分布，面较小的椭圆形激光光束，使激光能量成正态分布，面较小的椭圆形激光光束，使激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度使通过激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度使通过激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度使通过激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度的减少杂散光的干扰。的减少杂散光的干扰。的减少杂散光的干扰。的减少杂散光的干扰。流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成，滤光流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成，滤光流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成，滤光流动室后的光学系统主要由多组滤光片组成，滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。光电倍增管。光电倍增管。光电倍增管。滤光片主要有三类：滤光片主要有三类：长通滤片长通滤片长通滤片长通滤片(LP)(LP)只允许特定波长以上的光线通过。只允许特定波长以上的光线通过。只允许特定波长以上的光线通过。只允许特定波长以上的光线通过。短通滤片短通滤片短通滤片短通滤片(SP)(SP)只允许特定波长以下的光线通过。；只允许特定波长以下的光线通过。；只允许特定波长以下的光线通过。；只允许特定波长以下的光线通过。；带通滤片带通滤片带通滤片带通滤片(BP)(BP)只允许特定波长的光线通过。只允许特定波长的光线通过。只允许特定波长的光线通过。只允许特定波长的光线通过。不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管送到不同的光电倍增管(PMT)，如接收绿色荧，如接收绿色荧，如接收绿色荧，如接收绿色荧光光光光(FITC)(FITC)的的的的PMTPMT前面配置的滤光片是前面配置的滤光片是前面配置的滤光片是前面配置的滤光片是LP550LP550和和和和BP525BP525，接收色橙红色荧光，接收色橙红色荧光，接收色橙红色荧光，接收色橙红色荧光(PE)(PE)的的的的PMTPMT前面配置的前面配置的前面配置的前面配置的滤光片是滤光片是滤光片是滤光片是LP600LP600和和和和BP575BP575，接收红色荧光，接收红色荧光，接收红色荧光，接收红色荧光(CY5)(CY5)的的的的PMTPMT前面配置的滤光片是前面配置的滤光片是前面配置的滤光片是前面配置的滤光片是LP650LP650和和和和BP675BP675。4.4信号系统（检测、存储、显示和分析）信号系统（检测、存储、显示和分析）当测定标本在鞘流液的约束下，细胞成单行当测定标本在鞘流液的约束下，细胞成单行排列依次通过激光检测区时，产生散射光排列依次通过激光检测区时，产生散射光和荧光信号。和荧光信号。散射光分为：散射光分为：前向角散射或前向角散射或0散射散射（ForwardScatterForwardScatter，FSFS）侧向角散射或侧向角散射或90散射散射（SideScatterSideScatter，SSSS）。散射光是细胞的物理参数，与细胞样本的制散射光是细胞的物理参数，与细胞样本的制备备(如染色如染色)无关。无关。前向角散射前向角散射(FS)反映被测细胞的大小，它由反映被测细胞的大小，它由正对着流动室的光电二极管装置，接收并正对着流动室的光电二极管装置，接收并转变为电信号。转变为电信号。侧向角散射侧向角散射(SS)反映被测细胞的细胞膜、细反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状，胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状，它由一个光电倍增管它由一个光电倍增管(PMT)接收并转变为接收并转变为电信号，这些电信号存储在流式细胞仪的电信号，这些电信号存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。计算机硬盘或软盘内。荧光信号也有两种：荧光信号也有两种：一种是细胞自发荧光，它一般很微弱。一种是细胞自发荧光，它一般很微弱。一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后，经激光激发发出的荧光，它抗体染色后，经激光激发发出的荧光，它是我们要测定的荧光，荧光信号较强。是我们要测定的荧光，荧光信号较强。这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由，以便从测出的荧要设定阴性对照的理由，以便从测出的荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异结合产生的荧光。结合产生的荧光。流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种，其分子流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种，其分子流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种，其分子流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种，其分子结构不同，激发光谱和发射光谱也各异，选择荧结构不同，激发光谱和发射光谱也各异，选择荧结构不同，激发光谱和发射光谱也各异，选择荧结构不同，激发光谱和发射光谱也各异，选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长。的发射光波长。的发射光波长。的发射光波长。如氩离子气体激光管，它的发射光波如氩离子气体激光管，它的发射光波如氩离子气体激光管，它的发射光波如氩离子气体激光管，它的发射光波488nm488nm。氦氖离子气体激光管发射光波长氦氖离子气体激光管发射光波长氦氖离子气体激光管发射光波长氦氖离子气体激光管发射光波长633nm633nm。488nm488nm激光光源常用的荧光染料有激光光源常用的荧光染料有激光光源常用的荧光染料有激光光源常用的荧光染料有FITCFITC（异硫氰（异硫氰（异硫氰（异硫氰酸荧光素）、酸荧光素）、酸荧光素）、酸荧光素）、PEPE（藻红蛋白）、（藻红蛋白）、（藻红蛋白）、（藻红蛋白）、PIPI（碘化丙啶）、（碘化丙啶）、（碘化丙啶）、（碘化丙啶）、CY5CY5（化青素）、（化青素）、（化青素）、（化青素）、preCPpreCP(叶绿素蛋白叶绿素蛋白叶绿素蛋白叶绿素蛋白)、ECD(ECD(藻藻藻藻红蛋白红蛋白红蛋白红蛋白-得克萨斯红得克萨斯红得克萨斯红得克萨斯红)等。等。等。等。各种荧光信号由各自的光电倍增管各种荧光信号由各自的光电倍增管各种荧光信号由各自的光电倍增管各种荧光信号由各自的光电倍增管(PMT)(PMT)接收并接收并接收并接收并转变为电信号后，存储在流式细胞仪的计算机硬转变为电信号后，存储在流式细胞仪的计算机硬转变为电信号后，存储在流式细胞仪的计算机硬转变为电信号后，存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。盘或软盘内。盘或软盘内。盘或软盘内。信号存储时，数据一般是以信号存储时，数据一般是以信号存储时，数据一般是以信号存储时，数据一般是以ListmodeListmode（列表排队）（列表排队）（列表排队）（列表排队）方式存入的。方式存入的。方式存入的。方式存入的。采用采用采用采用ListmodeListmode方式有两大优点：方式有两大优点：方式有两大优点：方式有两大优点：节约内存和磁节约内存和磁节约内存和磁节约内存和磁盘空间；盘空间；盘空间；盘空间；易于加工处理分析。易于加工处理分析。易于加工处理分析。易于加工处理分析。ListmodeListmode方式数据缺乏直观性，数据的显示和分方式数据缺乏直观性，数据的显示和分方式数据缺乏直观性，数据的显示和分方式数据缺乏直观性，数据的显示和分析一般采用一维直方图、二维点阵图、等高线图析一般采用一维直方图、二维点阵图、等高线图析一般采用一维直方图、二维点阵图、等高线图析一般采用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图等。和密度图等。和密度图等。和密度图等。(1)单参数数据显示和分析单参数数据显示和分析细胞的每一个单参数测细胞的每一个单参数测细胞的每一个单参数测细胞的每一个单参数测量数据用直方图来显示量数据用直方图来显示量数据用直方图来显示量数据用直方图来显示横坐标表示散射光或荧横坐标表示散射光或荧横坐标表示散射光或荧横坐标表示散射光或荧光信号相对强度值，其光信号相对强度值，其光信号相对强度值，其光信号相对强度值，其单位是道数，可以是线单位是道数，可以是线单位是道数，可以是线单位是道数，可以是线性的，也可以是对数的性的，也可以是对数的性的，也可以是对数的性的，也可以是对数的纵坐标表示细胞数。纵坐标表示细胞数。纵坐标表示细胞数。纵坐标表示细胞数。(2)双参数数据显示和分析：双参数数据显示和分析：细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系用细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系用一维直方图、二维点阵图、假三维地形图、一维直方图、二维点阵图、假三维地形图、等高线图和密度图显示和分析。等高线图和密度图显示和分析。二维点阵图二维点阵图二维点阵图二维点阵图前向散射光（前向散射光（前向散射光（前向散射光（FSFS）和侧向散射光（）和侧向散射光（）和侧向散射光（）和侧向散射光（SSSS）组成的点）组成的点）组成的点）组成的点阵图，横坐标和纵坐标均是线性的，图中的细胞阵图，横坐标和纵坐标均是线性的，图中的细胞阵图，横坐标和纵坐标均是线性的，图中的细胞阵图，横坐标和纵坐标均是线性的，图中的细胞可以很容易地圈可以很容易地圈可以很容易地圈可以很容易地圈“门门门门”(Bitmap(Bitmap，无定型门，无定型门，无定型门，无定型门)，从而分析各亚群细胞的数据从而分析各亚群细胞的数据从而分析各亚群细胞的数据从而分析各亚群细胞的数据假三维地形图假三维地形图假三维地形图假三维地形图X X轴：轴：轴：轴：SSCSSC；Y Y轴：轴：轴：轴：FSCFSC；Z Z轴：细胞数。仪器的轴：细胞数。仪器的轴：细胞数。仪器的轴：细胞数。仪器的计算机很容易给出两种荧光的测定值：阴性细胞计算机很容易给出两种荧光的测定值：阴性细胞计算机很容易给出两种荧光的测定值：阴性细胞计算机很容易给出两种荧光的测定值：阴性细胞%、两种荧光各自的阳性细胞两种荧光各自的阳性细胞两种荧光各自的阳性细胞两种荧光各自的阳性细胞%、两种荧光的双阳性细、两种荧光的双阳性细、两种荧光的双阳性细、两种荧光的双阳性细胞胞胞胞%、各群细胞的平均荧光强度等。、各群细胞的平均荧光强度等。、各群细胞的平均荧光强度等。、各群细胞的平均荧光强度等。等高线图等高线图等高线图等高线图分别是测定细胞的两种荧光双参数数据，横坐标分别是测定细胞的两种荧光双参数数据，横坐标分别是测定细胞的两种荧光双参数数据，横坐标分别是测定细胞的两种荧光双参数数据，横坐标和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定“十字门十字门十字门十字门”就可得到两种荧光的各种测定值，密就可得到两种荧光的各种测定值，密就可得到两种荧光的各种测定值，密就可得到两种荧光的各种测定值，密度图和等高线图较点阵图更直观。度图和等高线图较点阵图更直观。度图和等高线图较点阵图更直观。度图和等高线图较点阵图更直观。(3)(3)三参数数据显示和分析：三参数数据显示和分析：三参数数据显示和分析：三参数数据显示和分析：细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个数据组成一对（三参数测量数据和细胞数量每两数据组成一对（三参数测量数据和细胞数量每两数据组成一对（三参数测量数据和细胞数量每两数据组成一对（三参数测量数据和细胞数量每两个数据可组成个数据可组成个数据可组成个数据可组成6 6对数据）用一维直方图、二维点阵对数据）用一维直方图、二维点阵对数据）用一维直方图、二维点阵对数据）用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。图、等高线图和密度图显示和分析。图、等高线图和密度图显示和分析。图、等高线图和密度图显示和分析。三个荧光数据关系可以用分光图（三个荧光数据关系可以用分光图（三个荧光数据关系可以用分光图（三个荧光数据关系可以用分光图（prismprism）表示，）表示，）表示，）表示，分光图可直接给出分光图可直接给出分光图可直接给出分光图可直接给出8 8个数据（如个数据（如个数据（如个数据（如ABCABC代表代表代表代表3 3种荧光，种荧光，种荧光，种荧光，可有可有可有可有A A+B B+C C+、A A+B B+C C-、A A-B B+C C+、A A+B B-C C+、A A+B B-C C-、A A-B B+C C-、A A-B B-C C+、A A-B B-C C-）。）。）。）。列表模式其实只是多参数数据文件的一种计列表模式其实只是多参数数据文件的一种计算机存贮方式算机存贮方式三个以上的参数数据显示是用多个直方图、三个以上的参数数据显示是用多个直方图、二维图和假三维图来完成的。二维图和假三维图来完成的。可用可用ListMode中的特殊技术，开窗或用游中的特殊技术，开窗或用游标调出相关部分再改变维数进行显示。例标调出相关部分再改变维数进行显示。例如，如，“一调二一调二”就是在一维图上调出二维图就是在一维图上调出二维图来；来；“二调一二调一”就是从二维图中调出一维图就是从二维图中调出一维图来。来。下下图给出了从二维图等高图中调出相图给出了从二维图等高图中调出相应窗口的直方图的示意图。应窗口的直方图的示意图。从二维图设窗调出直方图示意从二维图设窗调出直方图示意从二维图设窗调出直方图示意从二维图设窗调出直方图示意4.5细胞分选系统细胞分选系统如果在细胞流动室上装有超声压电晶体，通电后如果在细胞流动室上装有超声压电晶体，通电后如果在细胞流动室上装有超声压电晶体，通电后如果在细胞流动室上装有超声压电晶体，通电后超声压电晶体发生高频震动，可带动细胞流动室超声压电晶体发生高频震动，可带动细胞流动室超声压电晶体发生高频震动，可带动细胞流动室超声压电晶体发生高频震动，可带动细胞流动室高频震动，使细胞流动室里喷嘴流出的液流束被高频震动，使细胞流动室里喷嘴流出的液流束被高频震动，使细胞流动室里喷嘴流出的液流束被高频震动，使细胞流动室里喷嘴流出的液流束被连续分断成一连串均匀的液滴，每秒钟形成液滴连续分断成一连串均匀的液滴，每秒钟形成液滴连续分断成一连串均匀的液滴，每秒钟形成液滴连续分断成一连串均匀的液滴，每秒钟形成液滴上万个。上万个。上万个。上万个。每个液滴中包含着一个样品细胞，液滴中的细胞每个液滴中包含着一个样品细胞，液滴中的细胞每个液滴中包含着一个样品细胞，液滴中的细胞每个液滴中包含着一个样品细胞，液滴中的细胞在形成液滴前已被测量，如符合预定要求则可被在形成液滴前已被测量，如符合预定要求则可被在形成液滴前已被测量，如符合预定要求则可被在形成液滴前已被测量，如符合预定要求则可被充电，在通过偏转板的高压静电场时向左或向右充电，在通过偏转板的高压静电场时向左或向右充电，在通过偏转板的高压静电场时向左或向右充电，在通过偏转板的高压静电场时向左或向右偏转被收集在指定容器中；不含细胞液滴或细胞偏转被收集在指定容器中；不含细胞液滴或细胞偏转被收集在指定容器中；不含细胞液滴或细胞偏转被收集在指定容器中；不含细胞液滴或细胞不符合预定要求液滴不被充电，亦不发生偏转而不符合预定要求液滴不被充电，亦不发生偏转而不符合预定要求液滴不被充电，亦不发生偏转而不符合预定要求液滴不被充电，亦不发生偏转而进入中间废液收集器中，从而实现了分选。进入中间废液收集器中，从而实现了分选。进入中间废液收集器中，从而实现了分选。进入中间废液收集器中，从而实现了分选。第五节第五节常规检测时的样品制备常规检测时的样品制备5.1直接免疫荧光标记法直接免疫荧光标记法5.2间接免疫荧光标记法间接免疫荧光标记法5.3最小化非特异性结合的方法最小化非特异性结合的方法5.1直接免疫荧光标记法直接免疫荧光标记法取一定量细胞取一定量细胞取一定量细胞取一定量细胞(约约约约1 1 10106 6细胞细胞细胞细胞mLmL)，在每一管中分，在每一管中分，在每一管中分，在每一管中分别加入别加入别加入别加入50l50l的平衡盐缓冲液，并充分混匀，于室的平衡盐缓冲液，并充分混匀，于室的平衡盐缓冲液，并充分混匀，于室的平衡盐缓冲液，并充分混匀，于室温中静置温中静置温中静置温中静置1 1分钟以上，再直接加入连接有荧光素的分钟以上，再直接加入连接有荧光素的分钟以上，再直接加入连接有荧光素的分钟以上，再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入），可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入），可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入），可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入），孵育孵育孵育孵育20-6020-60分钟后，用分钟后，用分钟后，用分钟后，用PBS(pH7.2-7.4)PBS(pH7.2-7.4)洗洗洗洗1212次，加次，加次，加次，加入缓冲液重新悬浮，上机检测。入缓冲液重新悬浮，上机检测。入缓冲液重新悬浮，上机检测。入缓冲液重新悬浮，上机检测。优点：操作简便，结果准确，易于分析，适用于优点：操作简便，结果准确，易于分析，适用于优点：操作简便，结果准确，易于分析，适用于优点：操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群的多参数的同时测定。虽然直标抗体同一细胞群的多参数的同时测定。虽然直标抗体同一细胞群的多参数的同时测定。虽然直标抗体同一细胞群的多参数的同时测定。虽然直标抗体成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，更适用于临床标本的检测。荧光的干扰，更适用于临床标本的检测。荧光的干扰，更适用于临床标本的检测。荧光的干扰，更适用于临床标本的检测。5.2间接免疫荧光标记法间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液取一定量的细胞悬液取一定量的细胞悬液取一定量的细胞悬液(约约约约1 1 10106 6细胞细胞细胞细胞mLmL)，先加，先加，先加，先加入特异的第一抗体，待反应完全后，洗去未结合入特异的第一抗体，待反应完全后，洗去未结合入特异的第一抗体，待反应完全后，洗去未结合入特异的第一抗体，待反应完全后，洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原-抗抗抗抗体体体体-抗抗体复合物，以抗抗体复合物，以抗抗体复合物，以抗抗体复合物，以FCMFCM检测激发荧光。检测激发荧光。检测激发荧光。检测激发荧光。优点：费用较低，二抗应用广泛，多用于科研。优点：费用较低，二抗应用广泛，多用于科研。优点：费用较低，二抗应用广泛，多用于科研。优点：费用较低，二抗应用广泛，多用于科研。缺点：缺点：缺点：缺点：二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。标本制备时应加入阴性或阳性对照。标本制备时应加入阴性或阳性对照。标本制备时应加入阴性或阳性对照。步骤较多，步骤较多，步骤较多，步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。本。本。本。5.3最小化非特异性结合的方法最小化非特异性结合的方法(1)荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增高。的增加而增高。(2)在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白白（如小牛血清蛋白（如小牛血清蛋白（如小牛血清蛋白（如小牛血清蛋白(BSA)(BSA)、或来自于同一寄主的正常血、或来自于同一寄主的正常血、或来自于同一寄主的正常血、或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体）清来作为标记的第二抗体）清来作为标记的第二抗体）清来作为标记的第二抗体）一起培育，这个步骤一起培育，这个步骤通过阻断通过阻断（封阻）（封阻）（封阻）（封阻）第一抗体和细胞表面或胞第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性交互作用来降低背景。内结构的非特异性交互作用来降低背景。(3)在使用第一抗体之后，将样品与在使用第一抗体之后，将样品与5%至至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育，这个步骤会减少不必要第二抗体一起培育，这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。构之间的交互作用。用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。体可以略过此步骤。此步骤也可能引入不良影响。此步骤也可能引入不良影响。(4)使用使用F(ab)2片段会使背景决定于第一或第片段会使背景决定于第一或第二抗体与二抗体与FC受体的全分子结合。受体的全分子结合。大多数的第二抗体的大多数的第二抗体的F(ab)2片段容易利用。片段容易利用。而第一抗体的而第一抗体的F(ab)2片段一般是不能利用片段一般是不能利用或很难制作。或很难制作。在在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或细胞存在的条件下，将新鲜组织或细胞与正常血清一起培育应选择优先加入第一与正常血清一起培育应选择优先加入第一抗体。在此情况下，即使在随后的步骤中抗体。在此情况下，即使在随后的步骤中用完所有的抗体分子，用完所有的抗体分子，FC受体决定的背景受体决定的背景影响已不再重要。影响已不再重要。(5)其它其它已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的其它物质的交叉反应或加入实验系统中的其它物质的交叉反应也可能会有背景影响。也可能会有背景影响。为了降低背景，在多重标记过程中，所有的为了降低背景，在多重标记过程中，所有的已标记的抗体应被吸附，避免其他种类蛋已标记的抗体应被吸附，避免其他种类蛋白的交叉反应。白的交叉反应。第六节第六节流式细胞计的调试和使用流式细胞计的调试和使用6.1调试和校准调试和校准6.2仪器的操作和使用仪器的操作和使用6.1调试和校准调试和校准流式细胞计在使用前，甚至在使用过程中都流式细胞计在使用前，甚至在使用过程中都要精心进行调试，以保证工作的可靠性和要精心进行调试，以保证工作的可靠性和最佳性。最佳性。调试的项目主要是激光强度、液流速度和测调试的项目主要是激光强度、液流速度和测量区的光路等。量区的光路等。激光强度：除调整反射镜的角度以调整到所激光强度：除调整反射镜的角度以调整到所需波长的激光出光外，还要结合显示屏上需波长的激光出光外，还要结合显示屏上的光谱曲线使激光的强度输出为最大。的光谱曲线使激光的强度输出为最大。液流速度：可通过操作台数字显示监督，调液流速度：可通过操作台数字显示监督，调节节气体压力大小以获得稳定的液流速度。气体压力大小以获得稳定的液流速度。测量区光路调节测量区光路调节：这是调试工作的关键。需这是调试工作的关键。需要保证在测量区的液流、激光束、要保证在测量区的液流、激光束、90散射散射测量光电系统垂直正交，而且交点较小。测量光电系统垂直正交，而且交点较小。一般可在用标准荧光微球等校准中完成。一般可在用标准荧光微球等校准中完成。6.26.2仪器的操作和使用仪器的操作和使用仪器的操作和使用仪器的操作和使用打开电源，对系统进行预热；打开电源，对系统进行预热；打开电源，对系统进行预热；打开电源，对系统进行预热；打开气体阈，调节压力，获得适宜的液流速度；开启光打开气体阈，调节压力，获得适宜的液流速度；开启光打开气体阈，调节压力，获得适宜的液流速度；开启光打开气体阈，调节压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；源冷却系统；源冷却系统；源冷却系统；样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；利用校准标准样品，在激光功率、光电倍增管电压、放利用校准标准样品，在激光功率、光电倍增管电压、放利用校准标准样品，在激光功率、光电倍增管电压、放利用校准标准样品，在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，大器电路增益调定的基础上，大器电路增益调定的基础上，大器电路增益调定的基础上，00和和和和9090散射的荧光强度最散射的荧光强度最散射的荧光强度最散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小；强，并要求变异系数为最小；强，并要求变异系数为最小；强，并要求变异系数为最小；选定流速、测量细胞数、测量参数选定流速、测量细胞数、测量参数选定流速、测量细胞数、测量参数选定流速、测量细胞数、测量参数等，同等，同等，同等，同时选择计算机时选择计算机时选择计算机时选择计算机屏上数据的显示方式；屏上数据的显示方式；屏上数据的显示方式；屏上数据的显示方式；样品测量完毕后，用去离子水冲洗液流系统；样品测量完毕后，用去离子水冲洗液流系统；样品测量完毕后，用去离子水冲洗液流系统；样品测量完毕后，用去离子水冲洗液流系统；关闭气体、测量装置，用计算机进行数据处理关闭气体、测量装置，用计算机进行数据处理关闭气体、测量装置，用计算机进行数据处理关闭气体、测量装置，用计算机进行数据处理；将所需结果打印出来。将所需结果打印出来。将所需结果打印出来。将所需结果打印出来。在操作和使用中一定要注意如下事项：在操作和使用中一定要注意如下事项：在操作和使用中一定要注意如下事项：在操作和使用中一定要注意如下事项：光电倍增管要求稳定的工作条件，暴露的较强的光线光电倍增管要求稳定的工作条件，暴露的较强的光线光电倍增管要求稳定的工作条件，暴露的较强的光线光电倍增管要求稳定的工作条件，暴露的较强的光线下以后，需要较长时间的下以后，需要较长时间的下以后，需要较长时间的下以后，需要较长时间的“暗适应暗适应暗适应暗适应”以消除或降低部分以消除或降低部分以消除或降低部分以消除或降低部分暗电流本底才能工作；另外还要注意磁屏蔽；暗电流本底才能工作；另外还要注意磁屏蔽；暗电流本底才能工作；另外还要注意磁屏蔽；暗电流本底才能工作；另外还要注意磁屏蔽；光源不得在短时间内光源不得在短时间内光源不得在短时间内光源不得在短时间内(一般要一般要一般要一般要1h1h左右左右左右左右)关上又打开；使关上又打开；使关上又打开；使关上又打开；使用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常；用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常；用