第三章-吸附层析ppt课件

我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物第四章第四章 吸附层析吸附层析(Absorption chromatography)第一节第一节 层析技术概述层析技术概述一、原理一、原理 又叫色层法、色谱法。是一种物理的分离方法。它又叫色层法、色谱法。是一种物理的分离方法。它是利用混合物中是利用混合物中各组分各组分理化性质的差别理化性质的差别，使各组分以不，使各组分以不同的程度分布在同的程度分布在固定相固定相和和流动相流动相中，经连续多次中，经连续多次分配分配、吸附吸附或或交换交换作用，从而使各组分以不同速度移动而达到作用，从而使各组分以不同速度移动而达到分离。分离。性质：性质：吸附力；分子形状和大小；分子极性；亲和力；吸附力；分子形状和大小；分子极性；亲和力；分配系数等。分配系数等。第四章 吸附层析一、原理1我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物二、产生和沿革：二、产生和沿革：1.1.产生：产生：1903 1903年，用于植物色素年，用于植物色素的分离提取。分离后的叶绿的分离提取。分离后的叶绿素、叶黄素等在碳酸钙的吸素、叶黄素等在碳酸钙的吸附柱上，从上到下排列成色附柱上，从上到下排列成色谱，故也叫谱，故也叫“色层分离法色层分离法”或或“色谱法色谱法”。2.2.发展：发展：层析基质和仪器的发展层析基质和仪器的发展 层析方法的发展层析方法的发展 层析操作的发展：简便、层析操作的发展：简便、快速、自动化快速、自动化 二、产生和沿革：2我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物三、分类三、分类 可根据不同角度进行分类：可根据不同角度进行分类：依固定相（床）的形式分类：依固定相（床）的形式分类：柱层析柱层析 薄板层析薄板层析 薄膜层析薄膜层析 纸层析等纸层析等洗脱液洗脱液样品样品填充物填充物分部收集分部收集玻璃柱玻璃柱三、分类 可根据不同角度进行分类：依固定相（床）的形式分3我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物第三章-吸附层析ppt课件4我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物依流动相分类：依流动相分类：液相层析和气相层析。液相层析和气相层析。依分离原理分类：依分离原理分类：吸附层析、吸附层析、分配层析、分配层析、离子交换层、离子交换层、凝胶过滤层析、凝胶过滤层析、亲和层析、亲和层析、聚焦层析等。聚焦层析等。依流动相分类：5我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物各类层析的原理和载体各类层析的原理和载体类别类别 分离原理分离原理 基质或载体基质或载体吸附层析吸附层析 化学、物理吸附化学、物理吸附 硅胶、氧化铝硅胶、氧化铝、羟基磷酸、羟基磷酸分配层析分配层析 两溶剂相中的溶解效应两溶剂相中的溶解效应 纤维素、硅藻土纤维素、硅藻土、硅胶、硅胶凝胶层析凝胶层析 分子筛效应的排阻效应分子筛效应的排阻效应 sepharose 、sephadex离子交换层析离子交换层析 离子基团的交换反应离子基团的交换反应 离子交换树脂离子交换树脂 、纤维素、纤维素、葡聚糖葡聚糖亲和层析亲和层析 分离物与配体之间有分离物与配体之间有 带配基的带配基的sepharose 特殊亲和力特殊亲和力 或或sephadex聚焦层析聚焦层析 等电点和离子交换作用等电点和离子交换作用 多缓冲交换剂（与带有多种电多缓冲交换剂（与带有多种电 荷基团的配体相偶联的荷基团的配体相偶联的 sepharose 6B）各类层析的原理和载体类别 分离6我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物四常用术语四常用术语固定相：固定相：由层析基质组成的。这些基质能与相关的化合物由层析基质组成的。这些基质能与相关的化合物进行可逆的吸附、溶解和交换作用。进行可逆的吸附、溶解和交换作用。流动相：流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。动的液体或气体称为流动相。柱层析时，称洗脱液柱层析时，称洗脱液 或洗涤剂；或洗涤剂；薄层层析时称展层剂。薄层层析时称展层剂。操作容量操作容量：指在特定条件下，某种成分与基质反应达到平：指在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克（或毫升）衡时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克（或毫升）基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数表示。基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数表示。数值大，表明基质对某中成分的结合力强；反之，则小。数值大，表明基质对某中成分的结合力强；反之，则小。四常用术语7我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物床体积（床体积（VtVt）：）：指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积。床由三部分组成：基质本身、内部孔隙和外部缝隙。积。床由三部分组成：基质本身、内部孔隙和外部缝隙。基质体积基质体积(Vg)(Vg)：指基质自身所具有的体积。指基质自身所具有的体积。内水体积内水体积(Vi)(Vi)：指基质颗粒内部体积的总和。指基质颗粒内部体积的总和。外水体积外水体积(Vo)(Vo)：指基质颗粒之间（空隙）体积的总和。指基质颗粒之间（空隙）体积的总和。关系：关系：Vt=Vo+Vi+VgVt=Vo+Vi+Vg洗脱体积洗脱体积(Ve)(Ve)：指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大时的流动相体积。现浓度达到最大时的流动相体积。床体积（Vt）：指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积。床由8我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物第三章-吸附层析ppt课件9我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物膨胀度膨胀度（V V）：在一定溶液中，单位重量的基质充分膨在一定溶液中，单位重量的基质充分膨胀后所占有的体积。胀后所占有的体积。一般，亲水基质比疏水性的大。一般，亲水基质比疏水性的大。分配系数（分配系数（K K）：指某一组分在固定相与流动相中含量的：指某一组分在固定相与流动相中含量的比值。比值。迁移率（迁移率（R Rf f）：指一组分在相同时间内，在固定相移动的：指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值。距离与流动相移动距离之比值。K K与与R Rf f之间的关系：之间的关系：R Rf f 1/K 1/K，即反比关系。，即反比关系。K K大，表明该组分与固定相结合大，表明该组分与固定相结合力大，迁移率小；反之，亦然。力大，迁移率小；反之，亦然。物质间分配系数或迁移率物质间分配系数或迁移率差异程度越大，分离效果越好。差异程度越大，分离效果越好。膨胀度（V）：在一定溶液中，单位重量的基质充分膨胀后所占10我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 第二节 吸附柱层析基本原理基本原理 固定相固定相:即吸附剂。即吸附剂。指凡能将液体或气体中某些物质浓指凡能将液体或气体中某些物质浓集于其表面的固体物质。可通过静电引力、范德华力与集于其表面的固体物质。可通过静电引力、范德华力与蛋白质、核酸等结合。并且由于各种欲分离物质结构不蛋白质、核酸等结合。并且由于各种欲分离物质结构不同，吸附力强弱不同。同，吸附力强弱不同。流动相：流动相：一般为液体。可解吸附。不同吸附力的物质解一般为液体。可解吸附。不同吸附力的物质解吸附快慢不同。吸附快慢不同。过程：过程：吸附、解吸附、再吸附的连续过程。吸附、解吸附、再吸附的连续过程。简言之：简言之：吸附层析主要是利用吸附剂对不同物质吸附力吸附层析主要是利用吸附剂对不同物质吸附力的差异而使混合物分离的方法。的差异而使混合物分离的方法。第二节 吸附柱层析基本原理 11我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物二、吸附剂二、吸附剂（一）吸附剂的选择（一）吸附剂的选择 具有较大的吸附表面和一定的吸附能力，对欲分离的具有较大的吸附表面和一定的吸附能力，对欲分离的物质应有不同的吸附能力，即有物质应有不同的吸附能力，即有较高的分辨率较高的分辨率。与展层剂或洗脱剂及样品中各组分不起化学反应，并与展层剂或洗脱剂及样品中各组分不起化学反应，并不在这些试剂中溶解（不在这些试剂中溶解（化学稳定性高化学稳定性高）。）。粒度均匀，在柱层析中要有一定的机械强度。粒度均匀，在柱层析中要有一定的机械强度。（二）吸附剂的预处理：（二）吸附剂的预处理：过筛：除去过大的颗粒；过筛：除去过大的颗粒；悬浮法：除去过小的颗粒；悬浮法：除去过小的颗粒；酸碱浸泡、沸水煮、清水洗；酸碱浸泡、沸水煮、清水洗；有机溶剂浸泡：除去杂质；有机溶剂浸泡：除去杂质；热处理活化：使除去或保持一定的含水量，提高分离热处理活化：使除去或保持一定的含水量，提高分离效果。效果。二、吸附剂12我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物（三）常见的吸附剂（三）常见的吸附剂无机的：无机的：Al2O3、CaCO3、羟基磷灰石、活性炭、硅胶等、羟基磷灰石、活性炭、硅胶等有机的：纤维素、蔗糖、淀粉等有机的：纤维素、蔗糖、淀粉等天然的：滑石、陶土、黏土等天然的：滑石、陶土、黏土等 硅胶硅胶:SiO:SiO2 2XHXH2 2O O结构特点：结构特点：颗粒状、多孔、表面有许多硅醇基团（颗粒状、多孔、表面有许多硅醇基团（SiOH，功能基团），功能基团）用途：用途：用于非极性和极性物质的分离。如氨基酸衍生物、用于非极性和极性物质的分离。如氨基酸衍生物、甾体激素、皂苷类、类脂、色素等甾体激素、皂苷类、类脂、色素等注意事项：注意事项：活化，即活化，即110烘，烘，1h；立即使用；立即使用；干燥器或密闭的瓶可短时间保存；干燥器或密闭的瓶可短时间保存；（三）常见的吸附剂13我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物羟基磷灰石（羟基磷灰石（hydroxy apatitehydroxy apatite，HAHA）分子式分子式CaCa1010（POPO4 4）6 6（OHOH）2 2是一种磷酸钙晶体，是骨骼和牙齿的主要成分。可用作骨科、是一种磷酸钙晶体，是骨骼和牙齿的主要成分。可用作骨科、牙科材料、荧光材料、聚合助剂、湿度传感器、催化剂及层析牙科材料、荧光材料、聚合助剂、湿度传感器、催化剂及层析分离介质。分离介质。吸附原理：吸附原理：在在HA晶体表面有两种不同的吸附面（晶体表面有两种不同的吸附面（a晶晶面和面和b晶面）。晶面）。a晶面由晶面由Ca2+基团构成，带正电荷，可基团构成，带正电荷，可以和生物分子表面的负电荷基团相互反应，起主要作以和生物分子表面的负电荷基团相互反应，起主要作用；用；b晶面由晶面由PO43-基团构成，带负电荷，可以和生物基团构成，带负电荷，可以和生物分子表面的正电荷基团相互反应，起次要作用。分子表面的正电荷基团相互反应，起次要作用。用途：用途：分离带负电荷的化合物，如蛋白质、核酸、病分离带负电荷的化合物，如蛋白质、核酸、病毒等。毒等。羟基磷灰石（hydroxy apatite，HA）14我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物三、柱层析系统：三、柱层析系统：包括恒流泵、层析柱、部分收包括恒流泵、层析柱、部分收集器、检测器、记录仪五部分组成集器、检测器、记录仪五部分组成三、柱层析系统：包括恒流泵、层析柱、部分收集器、检测器、记录15我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物1.恒流泵：恒流泵：增加压力增加压力:2.2.获得均匀的流速。获得均匀的流速。3.3.2.2.层析柱：层析柱：材料材料：国内主要是国内主要是玻璃玻璃层析柱，国外有层析柱，国外有塑料塑料的。柱大小、的。柱大小、粗细多样。柱下有粗细多样。柱下有筛板筛板，石英砂烧制，有，石英砂烧制，有3#、5#型号，型号，区别在于筛孔大区别在于筛孔大 小不同。小不同。规格规格：试验盒规模的为几毫升；实验室规模的为几到几：试验盒规模的为几毫升；实验室规模的为几到几十毫升；生产规模的为几升到十几升。十毫升；生产规模的为几升到十几升。径高比径高比：d：h=1：101：40 （d 直径，直径，h柱高）体柱高）体积小的选瘦长型的，大的选矮胖型的；颗粒细的选矮积小的选瘦长型的，大的选矮胖型的；颗粒细的选矮胖型的，颗粒粗的选瘦长型的。胖型的，颗粒粗的选瘦长型的。恒流泵：增加压力:16我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物3.检测器：检测器：用于检测流经层析柱的样品。用于检测流经层析柱的样品。利用蛋白质或核酸的紫外吸收特征、电导率等。利用蛋白质或核酸的紫外吸收特征、电导率等。4.部分收集器：部分收集器：用来收集层析柱中流出的样品。用来收集层析柱中流出的样品。按时间、体积、质量等不同方法分管收集。按时间、体积、质量等不同方法分管收集。5.记录仪：记录仪：绘制曲线。绘制曲线。3.检测器：用于检测流经层析柱的样品。17我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物四、操作装柱；平衡；上样；洗脱和检测；层析柱的再生；四、操作装柱；平衡；18我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物a.a.将层析柱垂直固定，加入适将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。量溶剂排走空气。b.b.将平衡好的吸附剂搅匀，连将平衡好的吸附剂搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降续倾入柱中，待其自然沉降至至1/4-1/31/4-1/3高时打开下端出口，高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续倾入让溶剂慢慢流出，继续倾入吸附剂至沉降到所需高度。吸附剂至沉降到所需高度。c.c.用用3-53-5倍柱床体积的起始缓冲倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使吸附剂充分平衡，液走柱，使吸附剂充分平衡，柱床稳定。柱床稳定。装柱、平衡将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。装柱、平衡19我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物上柱、洗脱、收集a.a.如图装好层析装置，打开下端出如图装好层析装置，打开下端出口，使溶液流出至刚好达到吸附口，使溶液流出至刚好达到吸附剂表面剂表面b.b.沿柱壁缓慢加入沿柱壁缓慢加入2ml2ml样品，打开下样品，打开下端出口，待样品液流到基质表面端出口，待样品液流到基质表面时，用滴管加入洗脱剂直高出液时，用滴管加入洗脱剂直高出液面面5cm5cm。c.c.打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。d.d.用自动部分收集器自动或手动收用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。集，合并同一高峰各管。上柱、洗脱、收集如图装好层析装置，打开下端出口，使溶液流出至20我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 绘制曲线绘制曲线以管号或洗脱体积为横以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液中样坐标，以每管溶液中样品的浓度或活性为纵坐品的浓度或活性为纵坐标。标。曲线用途：表明物质的曲线用途：表明物质的高峰；确定有利的收集高峰；确定有利的收集部分。部分。收集范围确定：由原材收集范围确定：由原材料和要求的纯度（纯化料和要求的纯度（纯化倍数）来确定。倍数）来确定。V 或管号含量或活力洗脱峰 绘制曲线 V 或管号含量或活力洗脱峰21我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物吸附剂再生吸附剂再生 再生：再生：是指用适当的方法处理来恢复原来的性能。是指用适当的方法处理来恢复原来的性能。不同基质，方法不同。不同基质，方法不同。第三章-吸附层析ppt课件22我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物第三节第三节 吸附薄层层析吸附薄层层析一、薄层层析（一、薄层层析（thin layer chromatography,TLCthin layer chromatography,TLC）：）：又叫板状层析。把涂布在玻璃板上或涤纶片等载体上的又叫板状层析。把涂布在玻璃板上或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相来分离小分子化合物的基质为固定相，以液体为流动相来分离小分子化合物的一种层析方法。一种层析方法。二、二、原理：原理：吸附薄层层析、离子交换薄层层析、分配薄吸附薄层层析、离子交换薄层层析、分配薄层层析等。层层析等。薄层层析薄层层析上行上行下行下行卧式卧式第三节 吸附薄层层析薄层层析上行23我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物薄层层析薄层层析玻璃板玻璃板固定相固定相流动相流动相薄层层析玻璃板固定相流动相24我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物三、优点三、优点 时间短，分离一般混合物只需时间短，分离一般混合物只需151560min;60min;设备简单、操作方便，分析、制备都适用；设备简单、操作方便，分析、制备都适用；灵敏度高；灵敏度高；温度、溶剂饱和度对温度、溶剂饱和度对R Rf f 值影响较小；（重复性好）值影响较小；（重复性好）多数可使用腐蚀性显色剂。多数可使用腐蚀性显色剂。四、操作及注意事项四、操作及注意事项 简介硅胶薄板层析、主要在实验上讲。简介硅胶薄板层析、主要在实验上讲。1.1.硅胶：硅胶：薄层层析中颗粒为薄层层析中颗粒为150150200200目（孔目（孔/c/cm m2 2 ）柱层析中的颗粒为柱层析中的颗粒为6060目。目。三、优点25我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物型号：型号：硅胶硅胶H H：纯硅胶，黏性差，一般用于卧式，耐腐蚀性纯硅胶，黏性差，一般用于卧式，耐腐蚀性好，可用腐蚀性显色剂。好，可用腐蚀性显色剂。硅胶硅胶G G：含含10%10%15%15%锻石膏和锻石膏和5%5%的淀粉，黏性好，不的淀粉，黏性好，不耐腐蚀，上行、下行较好。耐腐蚀，上行、下行较好。硅胶硅胶CMCCMC：含适量的羧甲基纤维素，黏性好，不耐腐：含适量的羧甲基纤维素，黏性好，不耐腐蚀，上行、下行较好。蚀，上行、下行较好。GF254 GF254 和和HF254HF254：分别为含荧光粉的硅胶分别为含荧光粉的硅胶G G和和H H，分离，分离紫外灯下不发荧光的物质。紫外灯下不发荧光的物质。型号：26我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2.2.操作操作（1 1）铺板铺板 要求均匀、厚度要求均匀、厚度1 mm 1 mm，干厚，干厚0.250.250.3mm0.3mm。（2 2）活化活化 很重要很重要。加温使水分蒸发。加温使水分蒸发。110 1110 12h2h。特别注意：特别注意：缓慢升、降温。干燥器保存缓慢升、降温。干燥器保存。（3 3）点样点样 需小，需小，2 mm 2 mm直径。直径。（4 4）展层展层 选适当的的展层剂，恰当的装置。选适当的的展层剂，恰当的装置。展层的方式有：上行、下行、连续和卧式。展层的方式有：上行、下行、连续和卧式。（5 5）显色计算显色计算RfRf 喷雾显色。要求均匀，防脱落。喷雾显色。要求均匀，防脱落。2.操作27