大肠杆菌质粒DNA的提取-(碱法)ppt课件

眼睛是心灵的窗户，是人体中最宝贵的感觉器官，可很多孩子对眼睛的重要性不重视。在每学期的视力测查中情况都不容乐观实验实验 一大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒DNA的提取的提取(碱法碱法)实验 一大肠杆菌质粒DNA的提取(碱法)1 1眼睛是心灵的窗户，是人体中最宝贵的感觉器官，可很多孩子对眼睛的重要性不重视。在每学期的视力测查中情况都不容乐观背背 景景 知知 识识n n质粒是染色体外的质粒是染色体外的DNADNA分子，大小可为分子，大小可为1kb1kb到到200kb200kb。n n大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。n n其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。于宿主编码的蛋白和酶。背 景 知 识质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到22 2眼睛是心灵的窗户，是人体中最宝贵的感觉器官，可很多孩子对眼睛的重要性不重视。在每学期的视力测查中情况都不容乐观质粒特点：质粒特点：质粒特点：质粒特点：n n质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。是比病毒更简单的原始生命。n n质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体，质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子是细菌有性繁殖的性因子.n n年由年由LederburgLederburg正式命名为质粒。正式命名为质粒。质粒类型：质粒类型：质粒类型：质粒类型：按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和严紧型质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和严紧型质粒质粒特点：质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是3 3眼睛是心灵的窗户，是人体中最宝贵的感觉器官，可很多孩子对眼睛的重要性不重视。在每学期的视力测查中情况都不容乐观1.1.松弛型质粒松弛型质粒松弛型质粒松弛型质粒 松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-2000-30003000拷贝。拷贝。2.2.严紧型质粒严紧型质粒严紧型质粒严紧型质粒 严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。1.松弛型质粒 松弛型质粒的复制不需要质粒编码4 4眼睛是心灵的窗户，是人体中最宝贵的感觉器官，可很多孩子对眼睛的重要性不重视。在每学期的视力测查中情况都不容乐观质粒的应用质粒的应用质粒的应用质粒的应用n n大多数基因工程使用松弛型质粒。大多数基因工程使用松弛型质粒。n n严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。基因。n n质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。中具有极广泛的应用价值。质粒的应用大多数基因工程使用松弛型质粒。5 5眼睛是心灵的窗户，是人体中最宝贵的感觉器官，可很多孩子对眼睛的重要性不重视。在每学期的视力测查中情况都不容乐观一、实验目的一、实验目的1.了解碱法提取质粒的原理；2.掌握碱法提取质粒的方法。一、实验目的6 6眼睛是心灵的窗户，是人体中最宝贵的感觉器官，可很多孩子对眼睛的重要性不重视。在每学期的视力测查中情况都不容乐观二、实验原理二、实验原理 使蛋白质或脂类等菌体成分变性 基因组DNA产生缺刻，变成线状，并解离成单链（变性）由于质粒DNA较小，仍为环状变性区虽大，但不分离 利用强碱（或加热）及表面活性剂利用强碱（或加热）及表面活性剂利用强碱（或加热）及表面活性剂利用强碱（或加热）及表面活性剂(SDS)(SDS)裂解菌体裂解菌体裂解菌体裂解菌体中和或恢复至室温中和或恢复至室温 变性的质粒DNA按原互补配对结构复性 基因组DNA随机复性，与蛋白质等菌体成分结合在一起离心分离离心分离 质粒DNA存在于上清中，回收 苯酚/氯仿/异戊醇抽提，乙醇沉淀纯化纯化二、实验原理 使蛋白质或脂类等菌体成分变性利用强碱（或加热7 7眼睛是心灵的窗户，是人体中最宝贵的感觉器官，可很多孩子对眼睛的重要性不重视。在每学期的视力测查中情况都不容乐观二、实验原理二、实验原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们的。在碱性异来分离它们的。在碱性pHpH，DNADNA变性，当恢复中性并在高盐离子变性，当恢复中性并在高盐离子浓度时，绝大多数质粒浓度时，绝大多数质粒DNADNA可以准确复性，留在上清中；而线性染色可以准确复性，留在上清中；而线性染色体体DNADNA不能准确复性，相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上与蛋白质发不能准确复性，相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上与蛋白质发生沉淀。离心后获得含有大量质粒的上清液，利用亲水性有机溶剂生沉淀。离心后获得含有大量质粒的上清液，利用亲水性有机溶剂（乙醇、异丙醇、（乙醇、异丙醇、PEG8000PEG8000）使质粒）使质粒DNADNA脱水，离心后收集。脱水，离心后收集。碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。由碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：超螺旋、开环和线状于操作原因提取的质粒可有三种结构：超螺旋、开环和线状二、实验原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质8 8眼睛是心灵的窗户，是人体中最宝贵的感觉器官，可很多孩子对眼睛的重要性不重视。在每学期的视力测查中情况都不容乐观三、实验仪器、材料与试剂三、实验仪器、材料与试剂（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅锅（二）材料：含有质粒的大肠杆菌、（二）材料：含有质粒的大肠杆菌、LBLB液体培养基液体培养基（三）试剂：（三）试剂：溶液溶液I I：25mM TrisHCl(pH8.0),10mM EDTA(Ph8.0)25mM TrisHCl(pH8.0),10mM EDTA(Ph8.0)，50mM 50mM GlucoseGlucose；溶液溶液：0.2M NaOH0.2M NaOH，1%SDS1%SDS，现用现配；，现用现配；作用作用:细胞壁肽聚糖碱性下水解细胞壁肽聚糖碱性下水解,核酸和蛋白质变性。核酸和蛋白质变性。溶液溶液III:3M KOAcIII:3M KOAc，5M CH3COOH 5M CH3COOH；作用作用:酸性下质粒酸性下质粒DNADNA非特异性复性，变性蛋白非特异性复性，变性蛋白SDSSDS线性线性DNADNA沉沉淀淀三、实验仪器、材料与试剂（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、9 9眼睛是心灵的窗户，是人体中最宝贵的感觉器官，可很多孩子对眼睛的重要性不重视。在每学期的视力测查中情况都不容乐观平衡酚：氯仿：异戊醇（平衡酚：氯仿：异戊醇（2525：2424：1 1）作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8pH7.8（酸性下（酸性下DNADNA分配于有机相，酚的密度大），可使分配于有机相，酚的密度大），可使DNADNA在上清在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。无水乙醇：除去无水乙醇：除去DNADNA水化层，使水化层，使DNADNA沉淀沉淀TETE缓冲液：溶解缓冲液：溶解DNADNA三、实验仪器、材料与试剂三、实验仪器、材料与试剂 平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）三、实验仪器、材料与试1010眼睛是心灵的窗户，是人体中最宝贵的感觉器官，可很多孩子对眼睛的重要性不重视。在每学期的视力测查中情况都不容乐观1、取1.5ml培养液倒入1.5ml EP管中,4下6000g离心2min。2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽，使细胞沉淀尽可能干燥。3、菌体沉淀重悬浮于200l溶液中(需剧烈振荡,充分摇匀)。4、加入新配制的400l溶液(新鲜配置：0.4M NaOH和2%SDS 储液各取等体积混匀后加入),盖紧管口，温和颠倒离心管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴3分钟。5、加入300l预冷的溶液,盖紧管口，温和颠倒离心管振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4下12000g离心5-10分钟。四、操作步骤四、操作步骤 1、取1.5ml培养液倒入1.5ml EP管中,4下6001111眼睛是心灵的窗户，是人体中最宝贵的感觉器官，可很多孩子对眼睛的重要性不重视。在每学期的视力测查中情况都不容乐观四、操作步骤四、操作步骤6 6、上清液、上清液（700700ll左右左右）移入干净移入干净EPEP管中管中,加入加入等体积等体积的的酚：氯仿：异戊醇酚：氯仿：异戊醇(25:24:1),(25:24:1),振荡混匀振荡混匀,44下下12000g12000g离离心心5min5min。7 7、将水相（上清）、将水相（上清）（500500ll左右左右）移入干净移入干净EPEP管中管中,加入加入2 2倍体积倍体积的无水乙醇的无水乙醇,振荡混匀后置于振荡混匀后置于-20-20冰箱中冰箱中1515分钟分钟，然后然后44下下12000g12000g离心离心1010分钟分钟。8 8、弃上清、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加加入入1ml 1ml 7070乙醇洗沉淀一次。乙醇洗沉淀一次。9 9、吸除上清液、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥真空干燥1010分钟分钟或室温干燥。或室温干燥。1010、将沉淀溶于、将沉淀溶于20l 20l TETE缓冲液缓冲液或者灭菌水或者灭菌水(pH8.0(pH8.0，含，含20g/ml RNaseA)20g/ml RNaseA)中，储于中，储于-20-20冰箱中。冰箱中。四、操作步骤6、上清液（700l左右）移入干净EP管中,加1212眼睛是心灵的窗户，是人体中最宝贵的感觉器官，可很多孩子对眼睛的重要性不重视。在每学期的视力测查中情况都不容乐观q碱裂解法流程图碱裂解法流程图对数期菌体对数期菌体溶液溶液IIIIII中和中和溶液溶液I I充分重悬充分重悬溶液溶液IIII裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液碱裂解法流程图对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液I1313眼睛是心灵的窗户，是人体中最宝贵的感觉器官，可很多孩子对眼睛的重要性不重视。在每学期的视力测查中情况都不容乐观五、注意事项五、注意事项材料准备材料准备使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）五、注意事项材料准备使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导1414眼睛是心灵的窗户，是人体中最宝贵的感觉器官，可很多孩子对眼睛的重要性不重视。在每学期的视力测查中情况都不容乐观五、注意事项五、注意事项细胞裂解细胞裂解菌体量适当。培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断。复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染。对于细胞壁较厚的菌（如酵母菌）质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁。五、注意事项细胞裂解菌体量适当。1515眼睛是心灵的窗户，是人体中最宝贵的感觉器官，可很多孩子对眼睛的重要性不重视。在每学期的视力测查中情况都不容乐观五、注意事项五、注意事项核酸分离、纯化核酸分离、纯化采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法五、注意事项核酸分离、纯化1616眼睛是心灵的窗户，是人体中最宝贵的感觉器官，可很多孩子对眼睛的重要性不重视。在每学期的视力测查中情况都不容乐观五、注意事项五、注意事项核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 （TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase；pH值为8.0，可防止DNA发生酸解）五、注意事项核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇1717眼睛是心灵的窗户，是人体中最宝贵的感觉器官，可很多孩子对眼睛的重要性不重视。在每学期的视力测查中情况都不容乐观 简要叙述溶液、溶液和溶液的作用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。七、问题与讨论七、问题与讨论 简要叙述溶液、溶液和溶液的作用，以及1818