第一章绪论(酶工程)

第一章第一章绪绪论论n教学重点教学重点:酶工程的概念、固定化酶活性测定、酶工程的概念、固定化酶活性测定、酶的生产方法。酶的生产方法。n讲授要点：讲授要点：1、酶工程概念、酶工程概念2、酶工程发展概况、酶工程发展概况3、酶的基本知识（复习）、酶的基本知识（复习）4、酶的生产方法、酶的生产方法一、一、酶工程酶工程(enzymeengineering)概念概念n酶是具有生物催化功能的生物大分子。酶是具有生物催化功能的生物大分子。n酶酶工工程程又又称称酶酶技技术术，是是围围绕绕着着酶酶所所特特有有的的生生物物催催化化性性能能使使其其在在工工农农业业、医医学学和和其其他他方方面面发发挥挥作作用用的的应应用用技技术术，是是酶酶学学基基本本原原理理与与化化学学工工程程技技术术、基基因因重重组组技技术术及及微微生生物物学学技技术术有有机机结结合合的产物的产物。第一节第一节酶工程概念、研究内容和主要任务酶工程概念、研究内容和主要任务二、二、酶工程的主要内容包括：酶工程的主要内容包括：1、酶的生产和分离纯化；、酶的生产和分离纯化；2、酶分子改造与化学修饰、遗传修饰、酶分子改造与化学修饰、遗传修饰；3、酶、细胞和原生质体固定化；、酶、细胞和原生质体固定化；4、酶反应器；、酶反应器；5、酶的非水相催化；、酶的非水相催化；6、核酸酶、抗体酶的研究、核酸酶、抗体酶的研究7、模模拟拟酶酶、合合成成酶酶以以及及酶酶分分子子的的人人工工设设计计、合合成成的研究的研究8、酶的应用。、酶的应用。三、酶工程的主要任务三、酶工程的主要任务通通过过预预先先设设计计，经经过过人人工工操操作作控控制制而而大大量量所所需需的的酶酶，并并通通过过各各种种方方法法使使酶酶发发挥挥其其最最大大的的催化功能。催化功能。对酶及生物催化剂的认识的发展对酶及生物催化剂的认识的发展生物催化剂生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：蛋白质类：天然酶（天然酶（Enzyme）极端酶（极端酶（extremozyme）抗体酶抗体酶（abzyme）生物工程生物工程酶酶核酸类：核酸类：Ribozyme模拟生物催化剂模拟生物催化剂 克隆酶克隆酶 遗传修饰酶遗传修饰酶 蛋白质工程新酶蛋白质工程新酶采用生物体生产酶剂是从采用生物体生产酶剂是从19世纪末开始的。世纪末开始的。1894年年，日日本本的的高高峰峰让让吉吉首首先先从从米米曲曲霉霉中中制制备备得得到到高高峰峰淀淀粉粉酶酶，用用作作消消化化剂剂，开开创创了了近近代代酶的生产和应用的先例。酶的生产和应用的先例。1908年年，德德国国的的罗罗姆姆（Rohm)从从动动物物胰胰脏脏中中制得制得胰酶胰酶，用于皮革的软化；，用于皮革的软化；第二节第二节酶工程发展概况酶工程发展概况1908年，法国的波伊登制备得到年，法国的波伊登制备得到细菌淀粉酶细菌淀粉酶，应用于纺织品的退浆；应用于纺织品的退浆；1911年美国的华勒斯坦制成年美国的华勒斯坦制成木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶，用于，用于除去啤酒中的蛋白质浑浊。此后，酶的生产和除去啤酒中的蛋白质浑浊。此后，酶的生产和应用逐步发展。应用逐步发展。1949年年，用用液液体体深深层层培培养养法法进进行行细细菌菌-淀淀粉粉酶酶的的发发酵酵生生产产，揭揭开开了了近近代代酶酶工工业业的的序序幕幕。50年年代代以以后后，随随着着生生化化工工程程的的发发展展，大大多多数数酶酶制制剂剂的的生生产已转向微生物液体深层发酵的方法。产已转向微生物液体深层发酵的方法。1960年年，法法国国的的雅雅各各和和莫莫诺诺德德提提出出操操纵纵子子学学说说，阐阐明明了了酶酶生生物物全全面面的的调调节节机机制制。使使酶酶的的生生物物合合成成可可以以按按照照人人们们的的意意愿愿加加以以调调节节控控制制。通通过过酶酶的诱导和解除阻遏，可以显著地提高酶的产量。的诱导和解除阻遏，可以显著地提高酶的产量。20世世纪纪80年年代代迅迅速速发发展展起起来来的的动动、植植物物细细胞胞培培养养技技术术。植植物物细细胞胞、动动物物细细胞胞都都可可以以如如同同微微生生物物细细胞胞一一样样，在在人人工工控控制制条条件件的的生生物物反反应应器器中中进进行行培培养养，通通过过细细胞胞的的生生命命活活动动，得得到到人人们们所所需需的的各各种种产产物物，其中包括各种酶。其中包括各种酶。例例如如，通通过过植植物物细细胞胞培培养养可可以以获获得得超超氧氧化化物物歧歧化化酶酶、木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶、木木瓜瓜凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶、过过氧氧化化物物酶酶、糖糖苷苷酶酶、糖糖化化酶酶等等。通通过过动动物物细细胞胞培培养养可可以以获获得得血血纤纤维维蛋白酶原活化剂、胶原酶等。蛋白酶原活化剂、胶原酶等。1953年年，德德国国的的格格鲁鲁布布霍霍费费和和施施来来斯斯首首先先将将聚聚氨氨基基苯苯乙乙烯烯树树脂脂重重氮氮化化，然然后后将将淀淀粉粉酶酶、胃胃蛋蛋白白酶酶、羧羧肽肽酶酶和和核核糖糖核核酸酸酶酶等等与与上上述述载载体体结结合合，制制成成固定化酶。固定化酶。1969年年，日日本本的的千千烟烟一一郎郎首首次次在在工工业业上上应应用用固固定化氨基酰化酶定化氨基酰化酶从从DL-氨基酸生产氨基酸生产L-氨基酸。氨基酸。学学者者们们开开始始用用“酶酶工工程程”这这个个新新名名词词来来代代表表有有效效地地利利用用酶酶的的科科学学技技术术领领域域。1971年年第第一一次次国国际际酶酶工工程程学学术术会会议议在在美美国国召召开开，当当时时压压倒倒的的主主题题是是固定化酶。固定化酶。此此后后，为为了了省省去去酶酶的的分分离离纯纯化化过过程程，出出现现了了固固定化菌体定化菌体（固定化死细胞）技术。（固定化死细胞）技术。1973年年日日本本在在工工业业上上成成功功地地利利用用固固定定化化大大肠肠杆杆菌菌菌菌体体中中的的天天门门冬冬氨氨酸酸酶酶，由由反反丁丁烯烯二二酸酸连连续续生生产产L-天门冬氨酸。天门冬氨酸。现现在在已已经经有有多多种种固固定定化化酶酶用用于于大大规规模模工工业业化化生生产产。例例如如，利利用用固固定定化化葡葡萄萄糖糖异异构构酶酶由由葡葡萄萄糖糖生生产产果果葡葡糖糖浆浆；利利用用固固定定化化青青霉霉素素酰酰化化酶酶生生产产半半合合成成青青霉霉素素或或头头孢孢霉霉素素；利利用用固固定定化化-半半乳乳糖糖苷苷酶酶生产低乳糖奶等。生产低乳糖奶等。在在此此基基础础上上，70年年代代后后期期，出出现现了了固固定定化化细细胞胞（又又称称固固定定化化活活细细胞胞或或固固定定化化增增殖殖细细胞胞）技技术术。固固定定化化细细胞胞是是指指固固定定在在载载体体上上，在在一一定定的的空空间间范范围围内内进进行行生生命命活活动动（包包括括生生长长、增增殖殖、新新陈陈代代谢谢）的的细细胞胞，可可以以反反复复或或连连续续使使用用在在发发酵生产上。酵生产上。1978年年，日日本本的的铃铃木木等等人人用用固固定定化化细细胞胞生生产产淀淀粉粉酶酶研研究究成成功功。此此后后用用固固定定化化细细胞胞生生产产蛋蛋白白酶酶、糖糖化化酶酶、溶溶菌菌酶酶、天天冬冬酰酰胺胺酶酶、果果胶胶酶酶等等的的研研究究蓬蓬勃勃展展开开。然然而而，固固定定化化细细胞胞只只能能用用于于生生产产胞胞外外酶酶等等容容易易分分泌泌到到细细胞胞外外的的产产物物。对对于于胞胞内内酶酶及及其其他他胞胞内内产产物物的的生生产产必必须须采采用用8080年年代代中中期期才才发发展展起起来来的的固定化原生质体技术。固定化原生质体技术。19861986年年开开始始，华华南南理理工工大大学学生生物物工工程程研研究究所所用用固固定定化化原原生生质质体体发发酵酵生生产产碱碱性性磷磷酸酸酶酶、葡葡萄萄糖糖氧氧化化酶酶、谷谷氨氨酸酸脱脱氢氢酶酶等等的的研研究究相相继继取取得得成成功功，为为胞胞内内酶的连续生产开辟了崭新的途径。酶的连续生产开辟了崭新的途径。20世世纪纪80年年代代以以来来，酶酶分分子子修修饰饰技技术术发发展展很很快快，修修饰饰的的方方法法主主要要有有：酶酶分分子子主主链链修修饰饰，酶酶分分子子侧侧链链基基团团修修饰饰，酶酶分分子子组组成成单单位位置置换换修修饰饰，酶酶分分子子中中金金属属离离子子置置换换修修饰饰和和物物理理修修饰饰等等。通通过过酶酶分分子子修修饰饰，可可以以提提高高酶酶活活力力，增增加加酶酶的的稳稳定定性性，消消除除或或降降低低酶酶的抗原性等，的抗原性等，尤尤其其是是20世世纪纪80年年代代中中期期发发展展起起来来的的蛋蛋白白质质工工程程，已已把把酶酶分分子子修修饰饰与与基基因因工工程程技技术术结结合合在在一一起起。通通过过基基因因定定位位突突变变技技术术，可可把把酶酶分分子子修修饰饰后后的的信信息息储储存存于于DNA之之中中，经经过过基基因因克克隆隆和和表表达达，就就可可以以通通过过生生物合成的方法获得具有新的特性和功能的酶。物合成的方法获得具有新的特性和功能的酶。1984年年，克克利利巴巴诺诺夫夫（Klibanov)等等人人进进行行了了有有机机介介质质中中酶酶的的催催化化作作用用的的研研究究，发发现现脂脂肪肪酶酶在在有有机机介介质质中中不不但但具具有有催催化化活活性性，而而且且还还具具有有很很高高的的稳稳定定性性。改变了酶只能在水溶液中进行催化的传统概念。改变了酶只能在水溶液中进行催化的传统概念。与与水水溶溶液液中中酶酶的的催催化化相相比比，酶酶在在有有机机介介质质中中的的催催化化具具有有提提高高非非极极性性底底物物或或产产物物的的溶溶解解度度、进进行行在在水水溶溶液液中中无无法法进进行行的的合合成成反反应应、减减少少产产物物对对酶酶的的反反馈馈抑抑制制作作用用、提提高高手手性性化化合合物物不不对对称称反反应应的的对对映映体体选选择择性性等等显著特点。显著特点。近近2020多多年年来来，在在酶酶和和细细胞胞固固定定化化技技术术发发展展的的同同时时，其其他他的的酶酶分分子子修修饰饰技技术术也也不不断断发发展展。此此外外，核核酶酶、抗抗体体酶酶、酶酶的的化化学学合合成成、人人工工模模拟拟，以以及及各各种种酶酶的的应应用用技技术术的的研研究究，使使酶酶工工程程已已经经成成为为生生物物工工程程的的主主要要内内容容。今今后后将将不不断断地地向向广广度度和和深深度度发展，显示出广阔而诱人的前景。发展，显示出广阔而诱人的前景。一、酶作用的特点一、酶作用的特点 极高的催化效率极高的催化效率 高度的专一性高度的专一性 酶酶催化作用的条件温和催化作用的条件温和 酶酶活性可调控活性可调控 有的酶需辅助因子有的酶需辅助因子第三节第三节酶的基本知识酶的基本知识（一）、酶的专一性（一）、酶的专一性酶酶催催化化作作用用的的专专一一性性是是酶酶是是最最重重要要的的特特性性之之一一，是酶与其他非酶催化剂的最主要的不同之处。是酶与其他非酶催化剂的最主要的不同之处。酶酶的的专专一一性性是是指指一一种种酶酶只只能能催催化化一一种种或或一一类类结结构构相似的底物进行某种类型的反应。相似的底物进行某种类型的反应。酶酶的的专专一一性性可可以以按按其其严严格格程程度度的的不不同同，分分为为下下列列两大类两大类：1、结构专一性、结构专一性 概概念念：酶酶对对所所催催化化的的分分子子（底底物物，Substrate）化化学结构的特殊要求和选择学结构的特殊要求和选择类别类别：绝对专一性绝对专一性和和相对专一性相对专一性2、立体异构专一性、立体异构专一性概概念念：酶酶除除了了对对底底物物分分子子的的化化学学结结构构有有要要求求外外，对其立体异构也有一定的要求对其立体异构也有一定的要求类别类别：旋光异构专一性旋光异构专一性和和几何异构专一性几何异构专一性绝对专一性和相对专一性绝对专一性和相对专一性 绝对专一性绝对专一性 有的酶对底物的化学结构要求非常有的酶对底物的化学结构要求非常严格，只作用于一种底物，不作用于其它任何物质。严格，只作用于一种底物，不作用于其它任何物质。相对专一性相对专一性有的酶对底物的化学结构要求比有的酶对底物的化学结构要求比上述绝对专一性略低一些，它们能作用于一类化合上述绝对专一性略低一些，它们能作用于一类化合物或一种化学键。物或一种化学键。1）键专一性键专一性有的酶只作用于一定的键，而对有的酶只作用于一定的键，而对键键两端的基团并无严格要求。两端的基团并无严格要求。2）基团专一性基团专一性另一些酶，除要求作用于一定另一些酶，除要求作用于一定的键以外，对键两端的基团还有一定要求，往往的键以外，对键两端的基团还有一定要求，往往是对其中一个基团要求严格，对另一个基团则要是对其中一个基团要求严格，对另一个基团则要求不严格。求不严格。锁锁钥钥学学说说：将将酶酶的的活活性性中中心心比比喻喻作作锁锁孔孔，底底物物分分子子象钥匙，底物能专一性地插入到酶的活性中心。象钥匙，底物能专一性地插入到酶的活性中心。诱诱导导契契合合学学说说：酶酶的的活活性性中中心心在在结结构构上上具具柔柔性性，底底物物接接近近活活性性中中心心时时，可可诱诱导导酶酶蛋蛋白白构构象象发发生生变变化化，这这样样就就使使使使酶酶活活性性中中心心有有关关基基团团正正确确排排列列和和定定向向，使使之之与底物成互补形状有机的结合而催化反应进行。与底物成互补形状有机的结合而催化反应进行。3、有关酶专一性的学说、有关酶专一性的学说酶专一性的酶专一性的“锁钥学说锁钥学说”酶专一性的酶专一性的“诱导契合学说诱导契合学说”4、酶的专一性的确定酶的专一性的确定确定某种酶的专一性有好几个步骤。确定某种酶的专一性有好几个步骤。（1）首首先先要要选选择择一一种种酶酶可可催催化化的的物物质质作作为为该该酶酶的的作作用用底底物物，通通过过试试验验确确定定其其最最适适的的pH值值、温温度度等等反反应应条件；条件；（2）其其次次是是试试验验底底物物浓浓度度对对反反应应速速度度的的影影响响，确确定定其米氏常数其米氏常数Km和最大反应速度；和最大反应速度；（3）然然后后用用其其他他有有可可能能是是该该酶酶作作用用底底物物的的物物质质，在在相相同同的的条条件件下下逐逐个个进进行行试试验验，有有时时要要在在不不同同的的条条件件下下逐逐个个试试验验，观观察察是是否否有有催催化化反反应应发发生生，从从而而确确定定该该酶是属于绝对专一性还是相对专一性。酶是属于绝对专一性还是相对专一性。（4）对对于于相相对对专专一一性性的的酶酶，可可作作用用于于一一类类物物质质。可可以以选选择择几几种种有有代代表表性性的的底底物物，求求出出各各自自的的Km值值。在在某某些些情情况况下下，不不同同的的底底物物有有不不同同的的最最适适pH值值，而而pH值值对对Km有有一一定定的的影影响响。此此时时必必须须作作出出不不同同底底物物各各自自的的pH曲曲线线。然然后后再再在在各各自自的的最最适适pH值值条条件件下下进行试验，以确定各底物相应的进行试验，以确定各底物相应的Km值。值。（5）在在进进行行酶酶的的专专一一性性试试验验时时，所所使使用用的的酶酶和和各各种种底底物物都都要要尽尽可可能能地地纯纯。对对于于有有不不对对称称碳碳原原子子的的物物质，应分别对不同的光学异构体进行试验。质，应分别对不同的光学异构体进行试验。（二）酶具有很高的二）酶具有很高的催化效率催化效率 酶的催化效率可比一般催化剂高酶的催化效率可比一般催化剂高10106 610102020倍。倍。如：如：H H2 2O O2 2 H H2 2O+OO+O2 2 H H2 2O O2 2酶为酶为 5 510106 6 mol mol ；Fe Fe2+2+为为6 61010-4-4 molmol（三）反应条件温和，酶易三）反应条件温和，酶易变性失活变性失活（四）体内酶活性是受（四）体内酶活性是受调控调控的的（五）酶的催化活性与辅基、辅酶和金属离子（五）酶的催化活性与辅基、辅酶和金属离子有关有关E+SP+EES能能量量水水平平反应过程反应过程 G E1 E2酶（酶（E）与底物（与底物（S）结合生成不稳定的中间结合生成不稳定的中间物（物（ES），），再分解成产再分解成产物（物（P）并释放出酶，使并释放出酶，使反应沿一个低活化能的反应沿一个低活化能的途径进行，降低反应所途径进行，降低反应所需活化能，所以能加快需活化能，所以能加快反应速度。反应速度。酶催化的中间产物理论酶催化的中间产物理论 二、酶催化机理二、酶催化机理1、邻近效应和定向效应、邻近效应和定向效应 邻邻近近效效应应(proximity effect)是是指指在在酶酶促促反反应应中中，底底物物分分子子结结合合到到酶酶的的活活性性中中心心，底底物物在在酶酶活活性性中中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度；心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度；定定向向效效应应(orientation effect)是是指指酶酶的的活活性性中中心心的的立立体体结结构构和和相相关关基基团团的的诱诱导导和和定定向向作作用用，使使底底物物分分子子中中参参与与反反应应的的基基团团相相互互接接近近，并并被被严严格格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。（二）（二）底物形变底物形变（张力学说）（张力学说）酶酶与与底底物物结结合合，不不仅仅使使酶酶分分子子构构象象发发生生变变化化，同同时时也也使使底底物物分分子子发发生生扭扭曲曲变变形形，称称为为应应变变或或形形变变效效应应（strain effect)。这这是是由由于于酶酶与与底底物物结结合合之之后后,一一部部分分结结合合能能被被用用来来削削弱弱底底物物分分子子中中的的敏敏感感键键,产产生生键键扭扭变变,有有助助于于过过渡渡态态的的形形成成,降降低低了了底底物物反应的活化能反应的活化能,从而使反应速度大大加快。从而使反应速度大大加快。（三）、共价催化（三）、共价催化 某某些些酶酶分分子子的的催催化化基基团团可可以以通通过过共共价价键键与与底底物物分分子子结结合合形形成成不不稳稳定定的的共共价价中中间间产产物物，这这个个中中间间产产物物极极易易变变成成过过渡渡态态，因因而而大大大大降降低低了了活活化化能能，使使反反应应速速度度大大为为提提高高。这这种种催催化化称称为为共共价价催催化化（covalent catalysis)。1、亲亲核核催催化化（nucleophilic catalysis)是是指指酶酶活活性性中中心心的的亲亲核核催催化化基基团团提提供供一一对对电电子子，与与底底物物分分子子中中的的缺缺少少电电子子具具有有部部分分正正电电荷荷的的碳碳原原子子形形成成共共价价键键，从从而而产产生生不不稳稳定的共价中间物。定的共价中间物。酶分子中可作为亲核基团酶分子中可作为亲核基团2、亲亲电电子子催催化化 是是指指酶酶活活性性中中心心上上的的亲亲电电子子催催化化基基团团从从底底物物分分子子的的亲亲核核原原子子上上争争夺夺一一对对电电子子，形形成成共共价价键键，从从而而产产生生不不稳稳定定的的共共价价中间物。中间物。（四）、酸碱催化（四）、酸碱催化 在在酶酶活活性性中中心心上上，有有些些催催化化基基团团是是酸酸催催化化基基团团向向底底物物分分子子提提供供质质子子；有有些些催催化化基基团团是是碱碱催催化化基基团团从从底底物物分分子子接接受受质质子子。当当酸酸催催化化基基团团和和碱碱催催化化基基团团共共同同发发挥挥作作用用时时，可可以以大大大大提提高高底底物物反反应应速速度度，这这种种催催化化就就称称为为酸酸碱碱催催化化。His咪咪唑唑基基就是许多酶的酸碱催化基团。就是许多酶的酸碱催化基团。酶分子中可作为酸硷催化的功能基团酶分子中可作为酸硷催化的功能基团（五）活性部位疏水空穴的影响（五）活性部位疏水空穴的影响 已已知知某某些些化化学学反反应应，在在非非极极性性（低低介介电电常常数数）的的介介质质中中，其其反反应应速速度度比比在在极极性性（高高介介电电常常数数）介介质质中中快快得得多多。酶酶分分子子的的活活性性中中心心是是位位于于非非极极性性的的空空穴穴中中的的，因因此此，非非极极性性的空穴有利于提高酶促底物反应速度。的空穴有利于提高酶促底物反应速度。与酶的高效率有关的主要因素与酶的高效率有关的主要因素“邻近邻近”和定向效应和定向效应张力学说张力学说共价催化共价催化酸碱催化酸碱催化微环境影响微环境影响三、影响酶催化作用的因素三、影响酶催化作用的因素（一）底物浓度与酶反应速度的关系（一）底物浓度与酶反应速度的关系nMichaelisMichaelis&MentenMenten 于于19131913年年推推导导出出了了上上述述矩矩形形双双曲曲线线的的数数学学表表达达式式，即著名的即著名的米氏方程米氏方程。Vmax 米氏常数的意义米氏常数的意义 （1 1）当当=V=Vmaxmax/2/2时，时，K Km m=S=S。因此，因此，K Km m等于酶等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。促反应速度达最大值一半时的底物浓度。（2 2）K Km m可以反映酶与底物亲和力的大小可以反映酶与底物亲和力的大小K Km m越小，酶与底物的亲和力越大。越小，酶与底物的亲和力越大。（3 3）可可用用于于判判断断反反应应级级数数：当当 S0.01KS100KS100Km m时时，=V Vmaxmax，反反应为零级反应应为零级反应.（4 4）.K Km m是是酶酶的的特特征征性性常常数数：在在一一定定条条件件下下，某某种种酶酶的的K Km m值值是是恒恒定定的的，因因而而可可以以通通过过测测定定不不同同酶酶（特特别别是是一一组组同同工工酶酶）的的K Km m值值，来来判判断断是是否否为不同的酶。为不同的酶。（5 5）.K Km m可可用用来来判判断断酶酶的的最最适适底底物物：当当酶酶有有几几种种不不同同的的底底物物存存在在时时，通通过过测测定定酶酶在在不不同同底底物物存存在在时时的的K Km m值值，K Km m值值最最小小者者，即即为为该该酶酶的的最最适适底底物。物。（二）、抑制剂对反应速度的影响（二）、抑制剂对反应速度的影响n 凡凡是是能能降降低低酶酶促促反反应应速速度度，但但不不引引起起酶酶分分子子变变 性性 失失 活活 的的 物物 质质 统统 称称 为为 酶酶 的的 抑抑 制制 剂剂(inhibitor)inhibitor)。n 按按照照抑抑制制剂剂的的抑抑制制作作用用，可可将将其其分分为为不不可可逆逆抑抑制制作作用用(irreversible irreversible inhibition)inhibition)和和可可逆逆抑制作用抑制作用(reversible inhibition)reversible inhibition)两大类。两大类。1、可逆抑制作用、可逆抑制作用：n 抑抑制制剂剂以以非非共共价价键键与与酶酶分分子子可可逆逆性性结结合合造造成成酶酶活活性性的的抑抑制制，且且可可采采用用透透析析等等简简单单方方法法去去除除抑抑制制剂剂而而使使酶酶活活性性完完全全恢恢复复的的抑抑制制作作用用就就是是可可逆抑制作用。逆抑制作用。n 可可逆逆抑抑制制作作用用包包括括竞竞争争性性和和非非竞竞争争性性抑抑制制两两种类型。种类型。竞竞争争性性抑抑制制的的速速度度方方程程与与图图形形特特征征竞争性抑制的双倒数图形特征竞争性抑制的双倒数图形特征n 竞争性抑制的特点竞争性抑制的特点：竞争性抑制剂往往是酶的竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物底物类似物或反应产物；或反应产物；抑抑制制剂剂与与酶酶的的结结合合部部位位与与底底物物与与酶酶的的结结合合部部位位相相同；同；抑抑制制剂剂浓浓度度越越大大，则则抑抑制制作作用用越越大大；但但增增加加底底物物浓度可使抑制程度减小；浓度可使抑制程度减小；动力学参数：动力学参数：KmKm值增大，值增大，VmVm值不变值不变。非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用：n抑抑制制剂剂既既可可以以与与游游离离酶酶结结合合，也也可可以以与与ESES复复合合物物结结合合，使使酶酶的的催催化化活活性性降降低低，称称为为非非竞竞争性抑制。争性抑制。非非竞竞争争性性抑抑制制的的速速度度方方程程与与图图形形特特征征非竞争性抑制的双倒数图形特征非竞争性抑制的双倒数图形特征n非竞争性抑制的特点：非竞争性抑制的特点：非非竞竞争争性性抑抑制制剂剂的的化化学学结结构构不不一一定定与与底底物物的的分子结构类似；分子结构类似；底底物物和和抑抑制制剂剂分分别别独独立立地地与与酶酶的的不不同同部部位位相相结合；结合；抑抑制制剂剂对对酶酶与与底底物物的的结结合合无无影影响响，故故底底物物浓浓度的改变对抑制程度无影响；度的改变对抑制程度无影响；动力学参数：动力学参数：KmKm值不变，值不变，VmVm值降低值降低。竞争性抑制作用竞争性抑制作用非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用竞竞争争性性非非竞竞争争性性抑抑制制作作用用机机理理示示意意图图底物与酶专一性结合底物与酶专一性结合2 2、不可逆抑制作用、不可逆抑制作用n 抑抑制制剂剂与与酶酶分分子子的的必必需需基基团团共共价价结结合合引引起起酶酶活活性性的的抑抑制制，且且不不能能采采用用透透析析等等简简单单方方法法使使酶酶活活性性恢恢复的抑制作用就是复的抑制作用就是不可逆抑制作用。不可逆抑制作用。n 酶酶的的不不可可逆逆抑抑制制作作用用（如如有有机机磷磷农农药药对对胆胆碱碱酯酯酶酶的抑制和的抑制和重金属、碘乙酰胺重金属、碘乙酰胺对巯基酶的抑制）。对巯基酶的抑制）。专一性不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂 这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失。性丧失。实例：实例：有机磷杀虫剂有机磷杀虫剂-Ser-OH-Ser-OPO-RO-ROPO-RO-ROX非专一性不可逆抑制剂非专一性不可逆抑制剂抑抑制制剂剂作作用用于于酶酶分分子子中中的的一一类类或或几几类类基基团团，这这些些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。类型类型：（三）、激活剂对反应速度的影响（三）、激活剂对反应速度的影响n 能能够够促促使使酶酶促促反反应应速速度度加加快快的的物物质质称称为为酶酶的激活剂。的激活剂。n 酶酶的的激激活活剂剂大大多多数数是是无无机机离离子子，如如K K+、MgMg2+2+、MnMn2+2+、ClCl-等。等。（四）、酶浓度对反应速度的影响四）、酶浓度对反应速度的影响n当当反反应应系系统统中中底底物物的的浓浓度度足足够够大大时时，酶酶促促反应速度与酶浓度成反应速度与酶浓度成正比正比，即，即=kEkE。（五）、温度对反应速度的影响（五）、温度对反应速度的影响n一一般般来来说说，酶酶促促反反应应速速度度随随温温度度的的增增高高而而加加快快。但但当当温温度度增增加加达达到到某某一一点点后后，由由于于酶酶蛋蛋白白的的热热变变性性作作用用，反反应应速速度度迅迅速速下下降降，直直到到完全失活。完全失活。n 酶酶促促反反应应速速度度随随温温度度升升高高而而达达到到一一最最大大值值时时的温度就称为的温度就称为酶的最适温度酶的最适温度。温度对酶促反应速度的影响温度对酶促反应速度的影响（六）、溶液（六）、溶液pHpH对反应速度的影响对反应速度的影响n 观观察察pHpH对对酶酶促促反反应应速速度度的的影影响响，通通常常为为一一“钟钟形形”曲曲线线，即即pHpH过过高高或或过过低低均均可可导导致致酶酶催化活性的下降。催化活性的下降。n 酶酶催催化化活活性性最最高高时时溶溶液液的的pHpH值值就就称称为为酶酶的的最适最适pHpH。pHpH对酶促反应速度的影响对酶促反应速度的影响n 人体内大多数酶的最适人体内大多数酶的最适pHpH在在6.56.58.08.0之间。之间。n 酶的最适酶的最适pHpH不是酶的特征性常数不是酶的特征性常数。n pHpH对酶促反应速度的影响，其原因主要是由对酶促反应速度的影响，其原因主要是由于于pHpH的改变导致了酶的催化基团以及底物分的改变导致了酶的催化基团以及底物分子的解离状态改变或者导致了酶蛋白的变性。子的解离状态改变或者导致了酶蛋白的变性。四、酶的活力测定四、酶的活力测定在在酶酶的的生生产产及及应应用用过过程程中中，经经常常要要进进行行酶酶的的活活力测定，以确定酶量的多少及其变化情况。力测定，以确定酶量的多少及其变化情况。酶酶活活力力是是指指在在一一定定条条件件下下，酶酶所所催催化化的的反反应应速速度。反应速度越大，意味着酶活力越高。度。反应速度越大，意味着酶活力越高。酶催化反应速度，用单位时间内底物的减少量酶催化反应速度，用单位时间内底物的减少量或产物的增加量表示。即：或产物的增加量表示。即：V=S/tV=S/t或或P/tP/t1、酶活力测定方法、酶活力测定方法酶酶活活力力测测定定方方法法多多种种多多样样。总总的的要要求求是是快快速速、简便、准确。简便、准确。酶酶活活力力测测定定均均包包括括两两个个阶阶段段。首首先先要要在在一一定定的的条条件件下下，酶酶与与其其作作用用底底物物反反应应一一段段时时间间，然然后后再再测测定定反反应应液液中中底底物物或或产产物物变变化化的的量量。一一般般采采取取如下步骤：如下步骤：（1）根根据据酶酶的的专专一一性性，选选择择适适宜宜的的底底物物，并并配配制制成一定浓度的底物溶液。成一定浓度的底物溶液。（2）根根据据酶酶的的动动力力学学性性质质，确确定定酶酶促促反反应应的的温温度度，pH值、底物浓度、激活剂浓度等值、底物浓度、激活剂浓度等条件条件。（3）在在一一定定条条件件下下，将将一一定定量量的的酶酶液液与与底底物物溶溶液液混合均匀，适时记下反应开始的混合均匀，适时记下反应开始的时间时间。（4 4）反应到一定的时间，取出适量的反应液运用）反应到一定的时间，取出适量的反应液运用各种生化检测技术，各种生化检测技术，测定产物的生产量或底物的减测定产物的生产量或底物的减少量。少量。为了准确地反映酶促反应的结果，应尽量采为了准确地反映酶促反应的结果，应尽量采用快速、简便的方法，立即测出结果。若不能立即用快速、简便的方法，立即测出结果。若不能立即测出结果的，则要及时终止酶反应，然后再测定。测出结果的，则要及时终止酶反应，然后再测定。终止酶反应终止酶反应的方法很多，的方法很多，常用的有：常用的有：反应时间一到，立即取出适量的反应液，置于沸水反应时间一到，立即取出适量的反应液，置于沸水浴中，浴中，加热加热使酶失活；使酶失活；立即加入适宜的立即加入适宜的酶变性剂酶变性剂，如三氯醋酸等，使酶变，如三氯醋酸等，使酶变性失活；性失活；加入加入酸或碱溶液酸或碱溶液，使反应液的，使反应液的pH值迅速远离酶催化值迅速远离酶催化反应的最适反应的最适pH，从而终止反应；从而终止反应；将取出的反应液立即置于低温冰箱、冰粒堆或冰盐将取出的反应液立即置于低温冰箱、冰粒堆或冰盐溶液中，使反应液的溶液中，使反应液的温度迅速降低至温度迅速降低至100C以下以下等等。等等。测定反应液中物质的变化量，可采用光学检测法，测定反应液中物质的变化量，可采用光学检测法，化学检测法等化学检测法等生化检测技术生化检测技术。例如，用分光光度法测定碱性磷酸酶催化硝基酚磷例如，用分光光度法测定碱性磷酸酶催化硝基酚磷酸水解生成的对硝基酚的量；酸水解生成的对硝基酚的量；用化学滴定法测定糖化酶催化淀粉水解生成的葡萄用化学滴定法测定糖化酶催化淀粉水解生成的葡萄糖的量等等。糖的量等等。一种酶可能有多种测定方法，要根据实际情况选用。一种酶可能有多种测定方法，要根据实际情况选用。2、酶活力单位酶活力单位活力单位活力单位（activeunit）习惯单位（习惯单位（U）:底物底物(或产物或产物)变化量变化量/单位时间单位时间国际单位（国际单位（IU）:1moL变化量变化量/分钟分钟Katal（Kat）：）：1moL变化量变化量/秒秒比活力比活力=总活力单位总活力单位总蛋白总蛋白mg数数=U(或或IU)mg蛋白蛋白量度酶催化能力大小量度酶催化能力大小量度酶纯度量度酶纯度比活力比活力（specificactivity）3.固定化酶的活力测定固定化酶的活力测定 与与水水不不溶溶性性载载体体结结合合，在在一一定定的的空空间间范范围围内内起起催催化化作作用用的的酶酶称称为为固固定定化化酶酶。固固定定化化酶酶的的性性质质与与游游离离酶酶有有一一些些区区别别。所所以以固固定定化化酶酶的的活活力力测测定定与与游离酶活力测定方法也有一些不同。游离酶活力测定方法也有一些不同。常用的固定化酶测定方法：常用的固定化酶测定方法：（1）振振荡荡测测定定：称称取取一一定定重重量量的的固固定定化化酶酶，放放在在一一定定形形状状，一一定定大大小小的的容容器器中中，加加入入一一定定量量的的底底物物溶溶液液,在在特特定定的的条条件件下下,一一边边振振荡荡或或搅搅拌拌,一一边边进进行行催催化化反反应应，经过一定时间，取出一定量的反应液进行测定。经过一定时间，取出一定量的反应液进行测定。固固定定化化酶酶反反应应液液的的测测定定方方法法与与游游离离酶酶反反应应液液的的测测定定方方法法完完全全相相同同，振振荡荡或或搅搅拌拌速速度度对对反反应应速速度度有有很很大大影影响响。过过大大过过小小都都对对反反应应速速度度有有明明显显影影响响。所所以以，在在测测定定固固定定化化酶酶的的活活力力时时，要要在在一一定定的的振振荡荡或或搅搅拌拌速速度度下进行。下进行。（2 2）柱法测定）柱法测定：将一定量的固定化酶装进具有：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中，让底物溶液以一定的速度恒温装置的反应柱中，让底物溶液以一定的速度流过酶柱，收集流出的反应液。按常规方法测定流过酶柱，收集流出的反应液。按常规方法测定底物的消耗量或产物的生成量。测定方法与游离底物的消耗量或产物的生成量。测定方法与游离酶反应液的测定方法相同。酶反应液的测定方法相同。但在测定固定化酶活力要在但在测定固定化酶活力要在固定的流速条件固定的流速条件下下进行。而且酶柱的形状和径高比都对反应速度有进行。而且酶柱的形状和径高比都对反应速度有明显影响。所有明显影响。所有这些条件都必须固定不变。这些条件都必须固定不变。（3）连连续续测测定定法法：利利用用连连续续分分光光光光度度法法等等测测定定方方法法可可以以对对固固定定化化酶酶反反应应液液进进行行连连续续测测定定，从从而而测测定定固固定定化化酶酶的的酶酶活活力力。测测定定时时，可可将将振振荡荡反反应应器器中中的的反反应应液液连连续续引引起起连连续续测测定定仪仪（例例如如，双双束束紫紫外外光光分分光光光光度度计计等等）的的流流动动比比色色杯杯中中进进行行连连续续分分光光测测定定。或或者者使使固固定定化化酶酶流流出出的的反反应应液液连连续续流流经经流流动动比比色色杯杯进行连续分光测定。进行连续分光测定。酶酶活活力力的的连连续续测测定定，可可以以及及时时并并准准确确地地知知道道某某一一时时刻刻的的酶酶活活力力变变化化情情况况，对对利利用用固固定定化化酶酶进进行行连连续续生生产产和和自自动动控控制制有有重重大大意意义义，这这方方面面正正在在不不断断地地研究发展之中。研究发展之中。（4）固定化酶的比活力测定固定化酶的比活力测定：游游离离酶酶的的比比活活力力可可以以用用每每1ml酶酶蛋蛋白白所所具具有有的的酶酶活活力力单单位位数数表表示示。在在固固定定化化酶酶中中，一一般般要要采采用用每每1mg干干固固定定化化酶酶所所具有的酶活力单位数表示，即为具有的酶活力单位数表示，即为单位单位/mg干固定化酶干固定化酶。为为此此，测测定定固固定定化化酶酶比比活活力力时时，首首先先用用湿湿固固定定化化酶酶测测定定其其酶酶活活力力，然然后后将将固固定定化化酶酶在在一一定定条条件件下下干干燥燥，称称取取一一定定量量的的干干重重，然然后后计计算算两两者者的的商商,才才得得到到固固定定化化酶酶的的比比活活力力。也也可可称称取取一一定定量量的的干干固固定定化化酶酶，让让它它在在一一定定条条件件下下充充分分溶溶涨涨后后进行固定化酶活力测定，再计算比活力。进行固定化酶活力测定，再计算比活力。对对于于酶酶膜膜，酶酶板板或或酶酶管管等等固固定定化化酶酶，其其比比活活力力则则以以单单位位面面积的活力单位表示。即为积的活力单位表示。即为酶活力（单位）酶活力（单位）/cm2。（5）酶结合效率与酶活力回收率的测定）酶结合效率与酶活力回收率的测定：将将一一定定量量的的酶酶进进行行固固定定化化时时，不不是是全全部部都都成成为为固固定定化化酶酶，而而总总是是有有一一部部分分酶酶没没有有与与载载体体结结合合在在一一起起。为为了了确确定定固固定定化化的的效效果果，需需要要测测定定酶酶的的结结合合效效率率或或酶活力回收率。酶活力回收率。酶酶结结合合效效率率一一般般由由加加入入的的总总酶酶活活力力减减去去未未结结合合的的酶活力的差值与加入的酶活力的百分比来表示。酶活力的差值与加入的酶活力的百分比来表示。未未结结合合酶酶活活力力，包包括括固固定定化化后后滤滤出出固固定定化化酶酶后后的的滤滤液液以以及及洗洗涤涤固固定定化化酶酶的的洗洗涤涤液液中中所所含含有有的的酶酶活活力力的和。的和。酶酶活活力力回回收收率率是是指指固固定定化化酶酶的的总总活活力力与与用用于于固固定化酶总活力的百分比。定化酶总活力的百分比。当当固固定定化化方方法法对对酶酶活活力力没没有有明明显显影影响响时时，酶酶结结合合效效率率与与酶酶活活力力回回收收率率的的数数值值相相近近。然然后后固固定定化化方方法法往往往往对对酶酶活活力力有有一一定定影影响响，两两者者的的数数值值往往往往有有较较大大的的差差别别。所所以以，通通常常都都通通过过测测定定酶酶结结合合效效率来表示固定化的效果。率来表示固定化的效果。（6）相对酶活力测定）相对酶活力测定：具具有有相相同同酶酶蛋蛋白白量量的的固固定定化化酶酶活活力力与与游游离离酶酶活活力的比值称为相对酶活力。力的比值称为相对酶活力。固固定定化化酶酶的的相相对对酶酶活活力力与与载载体体结结构构，颗颗粒粒大大小小，底底物物分分子子量量大大小小及及酶酶结结合合效效率率等等有有密密切切关关系系。相相对对酶酶活活力力的的高高低低表表明明了了固固定定化化酶酶应应用用价价值值的的大大小小。故故此此，在在固固定定化化酶酶的的研研制制过过程程中中，应应从从固固定定化化载载体体，固固定定化化技技术术等等方方面面进进行行研研究究和和改改进进，以以提提高高固固定定化化酶的相对酶活力。酶的相对酶活力。第四节第四节酶的生产方法酶的生产方法n酶酶的的生生产产是是指指经经过过预预先先设设计计，通通过过人人工工操操作作控控制制而获得所需的酶的过程。而获得所需的酶的过程。n酶酶的的生生产产方方法法可可分分为为提提取取法法、发发酵酵法法以以及及化化学学合合成成法法等等3 3种种。其其中中，提提取取法法是是最最早早采采用用而而沿沿用用至至今今的的方方法法，发发酵酵法法是是5050年年代代以以来来酶酶生生产产的的主主要要方方法。而化学合成法仍在实验室阶段。法。而化学合成法仍在实验室阶段。一、提取分离法一、提取分离法 提提取取分分离离法法是是指指将将酶酶从从细细胞胞或或其其他他含含酶酶原原料料中中提提取取出出来来，再再与与杂杂质质分分开开，而而获获得得符符合合研研究究或或使使用用要要求求的的酶酶制制品品的的过过程程。提取法分离法是最早采用的酶生产方法。提取法分离法是最早采用的酶生产方法。酶酶的的提提取取是是指指在在一一定定的的条条件件下下，用用适适当当的的溶溶剂剂处处理理含含酶酶原原料料，使使酶酶充充分分溶溶解解到到溶溶剂剂中中的的过过程程，也也称称为为酶酶的的抽抽提提。酶酶提取时首先应根据酶的结果和溶解性质，选择适当的溶剂。提取时首先应根据酶的结果和溶解性质，选择适当的溶剂。根根据据酶酶提提取取时时所所采采用用的的溶溶剂剂或或溶溶液液的的不不同同，酶酶的的提提取取方方法法主主要要有有盐盐溶溶液液提提取取、酸酸溶溶液液提提取取、碱碱溶溶液液提提取取和和有有机机溶溶剂剂提取提取等方法。等方法。酶酶的的分分离离纯纯化化是是采采用用各各种种生生化化分分离离技技术术使使酶酶与与各各种种杂杂质分离，达到所需的纯度，以满足使用的要求。质分离，达到所需的纯度，以满足使用的要求。酶的分离纯化方法主要有：酶的分离纯化方法主要有：1 1、沉淀分离、沉淀分离 （1 1）盐盐析析沉沉淀淀法法 （2 2）等等电电点点沉沉淀淀法法 （3 3）有有机机溶溶剂剂沉淀法沉淀法 （4 4）复合沉淀法）复合沉淀法 （5 5）选择性变性沉淀法）选择性变性沉淀法 2 2、离心分离、离心分离 3 3、过滤与膜分离、过滤与膜分离 4 4、层析分离、层析分离 （1 1）吸附层析）吸附层析 （2 2）分配层析）分配层析 （3 3）离子交换层析）离子交换层析 （4 4）凝胶层析）凝胶层析 （5 5）亲和层析）亲和层析 （6 6）层析聚焦）层析聚焦 5、电泳分离、电泳分离（1）纸电泳）纸电泳（2）薄层电泳）薄层电泳（3）薄膜电泳）薄膜电泳（4）凝胶电泳）凝胶电泳（5）等电点聚焦电泳）等电点聚焦电泳6、萃取分离、萃取分离（1）有机溶剂萃取有机溶剂萃取（2）双水相萃取）双水相萃取（3）超临界萃取）超临界萃取（4）反胶束萃取）反胶束萃取7、结晶、结晶（1）盐析结晶法）盐析结晶法（2）有机溶剂结晶法）有机溶剂结晶法（3）透析平衡结晶法）透析平衡结晶法（4）等电点结晶法）等电点结晶法8、浓缩与干燥、浓缩与干燥选用酶的分离纯化的要点：选用酶的分离纯化的要点：1、目标酶分子特性及其他物理化学性质；、目标酶分子特性及其他物理化学性质；2、酶分子和杂质的主要性质差异；、酶分子和杂质的主要性质差异；3、酶的使用目的和要求；、酶的使用目的和要求；4、技术实施的难易程度；、技术实施的难易程度；5、分离成本的高低；、分离成本的高低；6、是否会造成环境污染等、是否会造成环境污染等 从从动动物物、植植物物或或微微生生物物的的组组织织、细细胞胞中中提提取取分分离离所所需需的的酶，至今仍然使用。酶，至今仍然使用。例例如如，从从动动物物胰胰脏脏中中提提取取胰胰蛋蛋白白酶酶、胰胰淀淀粉粉酶酶、胰胰脂脂肪肪酶酶或或这这些些酶酶的的混混合合物物胰胰酶酶；从从动动物物胃胃中中提提取取胃胃蛋蛋白白酶酶；从从动动物物小小肠肠中中提提取取碱碱性性磷磷酸酸酶酶；从从木木瓜瓜中中提提取取木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶；从从菠菠萝萝中中提提取取菠菠萝萝蛋蛋白白酶酶；从从柠柠檬檬酸酸发发酵酵的的废废菌菌体体黑黑曲霉菌体中提取果胶酶等。曲霉菌体中提取果胶酶等。酶酶的的分分离离提提取取技技术术不不但但在在酶酶的的提提取取分分离离法法生生产产中中使使用用，而而且且在在采采用用其其他他生生产产方方法法生生产产酶酶的的过过程程中中也也是是不不可可缺缺少少的的技技术术，此此外外，在在酶酶的的结结构构与与功功能能、酶酶的的催催化化机机制制、酶酶催催化化动力学等酶学研究方面也是不可缺少的重要手段。动力学等酶学研究方面也是不可缺少的重要手段。二、生物合成法二、生物合成法 生生物物合合成成法法是是5050年年代代以以来来酶酶生生产产的的主主要要方方法法。它它是是利利用用微微生生物物细细胞胞、植植物物细细胞胞或或动动物物细细胞胞的的生生命命活活动动而而获获得人们所需酶的技术过程。得人们所需酶的技术过程。生物合成法产酶程序生物合成法产酶程序1 1、经经过过筛筛选选、诱诱变变、细细胞胞融融合合、基基因因重重组组等等方方法法获获得得优良的产酶细胞；优良的产酶细胞；2 2、在在人人工工控控制制条条件件的的生生物物反反应应器器中中进进行行细细胞胞培培养养，通通过细胞内物质的新陈代谢作用，生成各种代谢产物。过细胞内物质的新陈代谢作用，生成各种代谢产物。3 3、再经过分离纯化得到所需的酶。、再经过分离纯化得到所需的酶。经经过过预预先先设设计计，通通过过人人工工操操作作，利利用用微微生生物物细细胞胞的的生生命命活活动动合合成成所所需需酶酶的的方方法法又又称称为为发发酵酵法法，根根据据微微生生物物培培养养方方式式的的不不同同，发发酵酵法法可可分分为为固固体体培培养养发发酵酵、液液体体深深层层发发酵酵、固固定定化化细细胞胞发发酵酵和和固固定化原生质体发酵等。定化原生质体发酵等。固固体体培培养养发发酵酵的的培培养养基基,以以麸麸皮皮、米米糠糠为为原原料料，加加入入其其他他必必要要的的营营养养成成分分，制制成成固固体体或或半半固固体体的的麸麸曲曲，经经过过灭灭菌菌、冷冷却却后后，接接种种菌菌株株后后在在一一定定条条件下进行发酵，已获得所需的酶。件下进行发酵，已获得所需的酶。其其优优点点是是：设设备备简简单单，操操作作方方便便，麸麸曲曲中中酶酶的的浓度较高，特别适合各种霉菌的培养和发酵产酶。浓度较高，特别适合各种霉菌的培养和发酵产酶。其其缺缺点点是是劳劳动动强强度度较较大大，原原料料利利用用率率较较低低，生生产周期较长。产周期较长。现现在在普普遍遍使使用用的的是是液液体体深深层层发发酵酵技技术术。是是置置于于生生物物反反应应器器中中，经经过过灭灭菌菌、冷冷却却后后，接接种种产产酶酶细细胞胞，在在一一定定条条件件下下，进进行行发发酵酵，生生产产所所需需的的酶酶。例例如如，利利用用枯枯草草杆杆菌菌细细胞胞生生产产淀淀粉粉酶酶、蛋蛋白白酶酶，利利用用黑黑曲曲霉霉生生产产糖糖化化酶酶、果果胶胶酶酶，利利用用大大肠肠杆杆菌菌生生产产谷谷氨氨酸酸脱脱羧羧酶酶、多多核核苷苷酸酸聚聚合合酶等。酶等。其其特特点点是是：机机械械化化程程度度较较高高，技技术术管管理理较较严严格格，酶酶的的产率较高，质量稳定，产品回收率较高。产率较高，质量稳定，产品回收率较高。用用固固定定化化细细胞胞生生产产胞胞外外酶酶。固固定定化化细细胞胞是是指指固固定定在在水水不不溶溶性性的的载载体体上上，在在一一定定空空间间范范围围内内进进行行生生命命活活动动的的细细胞胞。例例如如，固固定定化化枯枯草草杆杆菌菌细细胞胞生生产产 淀粉酶，固定化黑曲霉细胞生产糖化酶、果胶酶等。淀粉酶，固定化黑曲霉细胞生产糖化酶、果胶酶等。其其特特点点是是：1 1、细细胞胞密密度度大大，可可提提高高产产酶酶能能力力；2 2、发发酵酵稳稳定定性性好好，可可以以反反复复使使用用或或连连续续使使用用较较长长时时间间；3 3、细细胞胞固固定定在在载载体体上上，流流失失较较少少，可可以以在在高高稀稀释释率率的的条条件件下下连连续续发发酵酵，利利于于自自动动化化生生产产；4 4、发发酵酵液液中中含菌教少，利于产品分离纯化，提高质量等。含菌教少，利于产品分离纯化，提高质量等。利利用用固固定定化化原原生生质质体体生生产产胞胞内内酶酶。是是指指固固定定在在载载体体上上、在在一一定定空空间间范范围围内内进进行行生生命命活活动动的的原原生生质质体体。例例如如，固固定定化化枯枯草草杆杆菌菌原原生生质质体体生生产产碱碱性性磷磷酸酸酶酶；固固定定化化黑黑曲曲霉霉原原生生质质体体生生产产葡葡萄萄糖糖氧氧化化酶酶；固固定定化化谷氨酸棒杆菌原生质体生产谷氨酸脱氢酶等。谷氨酸棒杆菌原生质体生产谷氨酸脱氢酶等。其其特特点点是是：1、有有利利于于胞胞内内物物质质透透过过细细胞胞膜膜分分泌泌到到细胞外。细胞外。2、有利于细胞间质中的物质游离到细胞外。、有利于细胞间质中的物质游离到细胞外。3、稳定性好，可以连续或重复使用一段时间。、稳定性好，可以连续或重复使用一段时间。8080年年代代以以来来，除除了了利利用用微微生生物物细细胞胞进进行行发发酵酵以以外外，还还发发展展起起了了用用植植物物细细胞胞或或动动物物细细胞胞培培养养技技术术，即即通通过过特特定定技技术术获获得得优优良良的的动动、植植物物细细胞胞，然然后后在在人人工工控控制制的的条条件件的的反反应应器器中中进进行行细细胞胞培培养养以以得得到所需的酶的过程。到所需的酶的过程。例例如如，利利用用大大蒜蒜细细胞胞培培养养生生产产超超氧氧化化物物歧歧化化酶酶；利利用用木木瓜瓜细细胞胞培培养养生生产产木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶、木木瓜瓜凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶；利利用用人人黑黑色色素素瘤瘤细细胞胞培培养养生生产产血血纤纤维维蛋蛋白白溶酶原激活剂等。溶酶原激活剂等。动物细胞的获得：动物细胞