细菌病的实验室诊断

细菌病的实验室诊断主讲：沈美艳细菌病的实验室诊断n初诊：根据流行病学、症状、病变等方面的疾病特征，做出初步诊断n通过实验室诊断，确定病原是否是细菌，病原菌的类型实验室诊断是在临床诊断的基础上进行的细菌病实验室诊断的主要内容n病料的采集、保存和运送病料的采集、保存和运送病料采集遵循病料采集遵循的原则的原则防止污染、无菌采样、适时采样、适当部位防止污染、无菌采样、适时采样、适当部位病料采集方法病料采集方法（不同病料不同方法）（不同病料不同方法）实质脏器、液体材料、其他病料实质脏器、液体材料、其他病料病料的保存和送检病料的保存和送检n病料中细菌检查方法病料中细菌检查方法1.防止污染（1）剖检场所剖检场所：应选择便于消毒、不渗水的解剖地点，最好有专门的剖检场所和剖检台。（2 2）剖检前，动物剖检前，动物尸体应浸泡消毒。尸体应浸泡消毒。（3）做好个人防护：剖检过程中，注意个人防护。（4）剖检后的器械浸泡消毒后洗刷。1.1.防止污染防止污染1.1.防止污染防止污染动物尸体焚烧炉深埋（投入消毒药）（5 5）焚烧或深埋：）焚烧或深埋：剖检后动物尸体和剖检后动物尸体和病料焚烧灭菌或消病料焚烧灭菌或消毒深埋。毒深埋。1.1.防止污染防止污染垃圾直接洗刷处理不当会引起人和动物疫病的散播动物或人的传染病目的目的 防止病料被污染防止病料被污染措施措施所用器械和器皿必须灭菌所用器械和器皿必须灭菌点燃酒精灯点燃酒精灯注意无菌操作注意无菌操作2.2.无菌采样无菌采样细细菌菌丰丰富富增增殖殖时时期期、病病料料应应该该新新鲜鲜：取取濒濒死死动物或刚死亡的动物动物或刚死亡的动物死死亡亡动动物物采采集集病病料料夏夏天天不不宜宜迟迟于于6 68 8h h，冬冬天不迟于天不迟于2424h h。3.3.适时采样适时采样4.适当部位第二原则：一般采集正常无菌的部位第二原则：一般采集正常无菌的部位选择病料的部位可采用两个原则第一原则：第一原则：根据疾病的类型和表现采根据疾病的类型和表现采集病变最典型的部位集病变最典型的部位提示：实际工作中应灵活掌握提示：实际工作中应灵活掌握返回4.4.适当部位适当部位心包积液4.4.适当部位适当部位脑部病变肝脏病变返回 如有细菌检验条件，可在剖检后直接做病料的触片染色和细菌的分离培养。剖开体腔后，立即采集，置于无菌容器内 污染或剖开过久的被检器官：先烧烙表面，然后在烧烙的深部取一块实质脏器，放在灭菌容器内。实质脏器的采集液体病料的采集液体病料的采集若需分离血清血清，则采血后放在灭菌的容器中，摆成斜面，待血液凝固析出血清后，再将血清吸出，置于另一灭菌试管中送检。脓汁、胸水脓汁、胸水一般用灭菌的棉棒或吸管吸取放入试管内，塞好棉塞送检。血液血液可无菌操作从静脉或心脏采血，然后加抗凝剂（每1ml血液加3.8%枸橼酸钠0.1ml）。其他病料的采集其他病料的采集 被毛或羽毛被毛或羽毛要取病变明显部位，并带毛根，放平皿。皮肤皮肤要取有病变且带有一部分正常皮肤的部位。胎儿胎儿可将流产胎儿送往实验室，也可用吸管或注射器吸取胎儿胃内容物放入试管送检。肠道及内容物肠道及内容物只需选择病变最明显的部分，将其中内容物去掉，用灭菌水轻轻冲洗后放在平皿内。细菌性病料的保存和送检细菌性病料的保存和送检做好记录（畜主姓名、动物种类、地址、发病情况、欲检部位及检验项目、采集时间等）l低温保存l尽快送检返回二、病料中细菌的检查方法（六类）1、细菌的形态学检查2、细菌的分离培养3、细菌的生化试验4、动物试验5、血清学试验6、分子生物学方法n光学显微镜检查n电子显微镜检查 （一）形态学检查 细菌的形态学检查方法染色标本检查法 单染色法（如美蓝染色法、复红染色法等）单染色法（如美蓝染色法、复红染色法等）复染色法（如革兰氏染色法、抗酸染色法等）复染色法（如革兰氏染色法、抗酸染色法等）特殊染色法（鞭毛染色法、荚膜染色法、芽特殊染色法（鞭毛染色法、荚膜染色法、芽 孢染色法等）孢染色法等）不染色标本检查法（悬滴法、压滴法）（悬滴法、压滴法）1.1.不染色标本检查法不染色标本检查法A.压滴法B.悬滴法用途：主要用于细菌动力的检查用途：主要用于细菌动力的检查方法：方法：返回2.2.染色标本检查法染色标本检查法v 单染色法v 复染色法v 特殊染色法（一）形态学检查1.光镜单染色法复染色法常用方法美蓝染色法、复红染色法等革兰氏染色法、抗酸染色法等可观察的细菌特点大小、形态、排列及及荚膜和芽孢，无法确定染色特性大小、形态、排列及荚膜和芽孢、染色特性（2）染色标本检查法）染色标本检查法单单染染色色法法和和复复染染色色法法的的不不同同特特点点单染色法单染色法例：如美蓝染色法例：如美蓝染色法涂片干燥固定滴加美蓝染色液吸干、镜检美蓝染色结果复染色法又称鉴别染色法 例：革兰氏染色法葡大肠杆菌95%乙醇革兰氏碘液草酸铵结晶紫石炭酸复红水洗革兰氏染色过程 G-菌红色红色 G+菌蓝紫色革兰氏染色结果革兰氏染色结果革兰氏（？）菌革兰氏（？）菌革兰氏染色结果革兰氏染色结果混合菌的革兰氏染色结果特殊染色法 细菌的荚膜、鞭毛、芽孢用普通染色法均不易着色 普通染色时，芽孢呈“空泡”状，荚膜呈“透明圈”，鞭毛则必须用特殊染色法才能观察到返回普通染色鞭毛不着色 透射电子显微镜电子显微镜 用来观察细用来观察细菌等微生物的超菌等微生物的超微结构微结构，一般不一般不用于临床诊断用于临床诊断电子显微镜光镜和电镜下的细菌比较大肠杆菌葡萄球菌光学显微镜镜检电子显微镜镜检返回药敏试验药敏试验n 细菌分离培养对细菌病诊断的意义细菌分离培养对细菌病诊断的意义 培养基中有无细菌生长推断是否为细菌病 菌落的特征用以判断细菌种类菌落的特征用以判断细菌种类 为进一步的生化鉴定、血清学鉴定及动物试验获得纯培养（二）分离培养分离培养方法v 通常用平板培养基对细菌进行分离培养，根据细菌通常用平板培养基对细菌进行分离培养，根据细菌的培养特性选择适合目标菌生长培养基。的培养特性选择适合目标菌生长培养基。相同条件培养的相同培养基上，不同细菌的菌落大小、形态、色泽、表面特征、边缘状态、隆起度、透明度等特征不同。有的细菌在鲜血琼脂平板上形成溶血环有的细菌在鲜血琼脂平板上形成溶血环v 也可采用选择培养基或鉴别培养基，以起到抑制杂也可采用选择培养基或鉴别培养基，以起到抑制杂菌或快速鉴别的效果，比如菌或快速鉴别的效果，比如肠道杆菌科可选择麦康凯琼肠道杆菌科可选择麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂脂、伊红美蓝琼脂等。等。分离培养结果不同细菌的菌落大小、形态、色泽、表面特征、边缘状态、不同细菌的菌落大小、形态、色泽、表面特征、边缘状态、隆起度、透明度等特征不同隆起度、透明度等特征不同分离培养结果分离培养结果有的细菌在鲜血培养基上有有的细菌在鲜血培养基上有-溶血现象溶血现象返回鉴别培养基鉴别培养基结果伊红美蓝琼脂、麦康凯培养基大肠杆菌菌落伊红美蓝琼脂、麦康凯培养基大肠杆菌菌落返回（三）细菌的生化试验n糖类分解试验糖类分解试验n糖分解（发酵）试验、甲基红试验、V-P试验等n蛋白质类分解试验蛋白质类分解试验n硫化氢试验、靛基质试验等n其他类型试验其他类型试验n触酶试验、尿素酶试验等n 根据细菌对不同底物的利用情况不根据细菌对不同底物的利用情况不同鉴别细菌的一系列试验同鉴别细菌的一系列试验细菌的生化试验糖类分解试验糖发酵试验MR试验VP试验细菌的生化试验蛋白质类分解试验靛基质试验硫化氢试验细菌的生化试验细菌的生化试验检验时，根据可疑细菌的生化特性选检验时，根据可疑细菌的生化特性选择特定的一组生化试验，将结果与标择特定的一组生化试验，将结果与标准进行对比，以确定病原菌的种类准进行对比，以确定病原菌的种类例：不同种沙门氏菌生化鉴定例：不同种沙门氏菌生化鉴定注意：进行生化试验的细菌必须是纯培养物注意：进行生化试验的细菌必须是纯培养物生化试验鸡白痢沙门氏菌鸡伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌返回（四）动物试验n将分离鉴定的细菌液接种到动物体内，观察动物将分离鉴定的细菌液接种到动物体内，观察动物发病情况，进一步确认病原发病情况，进一步确认病原n或者将可疑病料处理液接种敏感动物，以观察典或者将可疑病料处理液接种敏感动物，以观察典型表现型表现（四）动物试验 常用的接种途径灌口肌肉注射腹腔注射皮下注射脑内接种静脉注射返回 抗原+抗体 抗原抗体复合物 可见反应用已知抗体检测动物体内的病原菌用已知抗体检测动物体内的病原菌用已知的病原菌抗原检测动物血清中的抗体用已知的病原菌抗原检测动物血清中的抗体 临床诊断中，可用于细菌的血清分型、快速诊断或大群检疫。例：鸡白痢的检疫（五）血清学试验鸡白痢检疫全血平板凝集试验1、加一滴抗原2、加一滴鸡的全血3、将抗原和血液混匀4、静置2min,观察结果（五）血清学试验 举例（鸡白痢检疫）返回（六）分子生物学方法 分子生物学技术对病原菌的快速诊断和不能人工分子生物学技术对病原菌的快速诊断和不能人工培养的细菌的探索发挥巨大的作用。培养的细菌的探索发挥巨大的作用。PCR技术、核酸分子杂交技术等GO二、细菌病实验室检查总结二、细菌病实验室检查总结 病料采病料采集集 动物剖检动物剖检分离培养分离培养触片染色触片染色鉴别染色鉴别染色纯培养纯培养生化鉴定生化鉴定动物试验动物试验血清学鉴定血清学鉴定分子生物分子生物学检测学检测举例大肠杆菌病大肠杆菌病的实验室诊断大肠杆菌病实验室诊断 1.剖检（采集病料）2.纤维素渗出物的涂片染色3.分离培养（普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板）4.培养物涂片培养物涂片G G染色染色5.5.生化试验生化试验6.6.动物试验动物试验6.用单因子血清鉴定血清型THANKS大肠杆菌病大肠杆菌病纤维渗出物纤维渗出物中的细菌中的细菌返回大肠杆菌在麦康凯麦康凯和伊红美蓝琼脂平板上形成的菌落返回大肠杆菌大肠杆菌培养物涂片培养物涂片G G染色染色返回大肠杆菌生化特性大肠杆菌生化特性返回THANK YOU!