动物细胞融合和单克隆抗体(用)

动物细胞融合和单克隆抗动物细胞融合和单克隆抗体体(用用)复习巩固：1.植物体细胞杂交 2.植物组织培养2010-3-262010-3-262 2植物体细胞杂交植物体细胞杂交植物细胞植物细胞A A植物细胞植物细胞B B原生质体原生质体A A原生质体原生质体B B原生质原生质体融合体融合杂种细胞杂种细胞组织培养组织培养杂种植株杂种植株去细胞壁去细胞壁纤维素酶、纤维素酶、果胶酶果胶酶化学法化学法物理法物理法诱导诱导2010-3-2631.概念：概念：动物细胞融合（动物细胞融合（cell fusion)cell fusion)，又称又称体细胞杂交（体细胞杂交（somatic hybridiazationsomatic hybridiazation），），是指两个或更多个相同或不同细胞结合形成是指两个或更多个相同或不同细胞结合形成一个细胞的过程。一个细胞的过程。一、动物细胞融合一、动物细胞融合融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。2010-3-2642 2、动物细胞融合基本原理：、动物细胞融合基本原理：与植物原生质体融合的基本原理相同，与植物原生质体融合的基本原理相同，即细胞膜的流动性即细胞膜的流动性3、诱导方式、诱导方式物理法：物理法：化学法：化学法：生物法：生物法：灭活的病毒灭活的病毒电激、振动、离心电激、振动、离心电激、振动、离心电激、振动、离心聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇（PEGPEG）例如：仙台病毒例如：仙台病毒2010-3-265灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞膜连接细胞融合，形成杂种细胞细胞融合，形成杂种细胞（细胞膜具有一定的流动性）（细胞膜具有一定的流动性）生物法：生物法：灭活的病毒灭活的病毒（丧失感染性、保留抗原结构）（丧失感染性、保留抗原结构）2010-3-266病毒促使细胞融合的主要步骤如下：病毒促使细胞融合的主要步骤如下：1.1.两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；2.2.通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，3.3.胞质互相渗透；胞质互相渗透；4.4.两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；5.5.进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。2010-3-2674、过程：动物细胞A 动物细胞B诱导，融合2个完整的杂交细胞AB有丝分裂（膜融合、诱导方法质融合、核融合）单核细胞2010-3-2685、动物、动物细胞融合技术的发展简史告诉我细胞融合技术的发展简史告诉我们：们：科学技术是不断发展的科学技术是不断发展的。那么，实现。那么，实现动物细胞融合有什么动物细胞融合有什么意义意义呢？呢？打破生殖隔离，使远缘杂交成为可能；打破生殖隔离，使远缘杂交成为可能；广泛应用广泛应用多个学科领域多个学科领域；重要用途：重要用途：制备单克隆抗体制备单克隆抗体。2010-3-2696、植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较、植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合细胞融合原理细胞融合原理细胞融合的方法细胞融合的方法诱导方法诱导方法用途用途制备单克隆抗体制备单克隆抗体获得获得杂种植株杂种植株细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞的全能性细胞的全能性去除细胞壁去除细胞壁后诱导后诱导原生质体融合原生质体融合使细胞分散后诱导使细胞分散后诱导细胞融合细胞融合物理（离心、振荡、物理（离心、振荡、电刺激）电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒2010-3-26102 2、什么是抗体？、什么是抗体？二、单克隆抗体二、单克隆抗体回顾回顾3 3、抗体的分布？、抗体的分布？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。主要分布在血清中。主要分布在血清中。1 1、什么是克隆？、什么是克隆？“克隆克隆”从英文从英文“clone”“clone”音译而来，是指从一个共音译而来，是指从一个共同祖先，通过同祖先，通过无性繁殖无性繁殖的方法产生出来的一群的方法产生出来的一群遗传特遗传特性相同性相同的的DNADNA分子，细胞或个体。在细胞水平指分子，细胞或个体。在细胞水平指动物动物细胞培养细胞培养.2010-3-2611 由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆）形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体。1 1、单克隆抗体概念、单克隆抗体概念:2010-3-2612该法制备抗体的特点：该法制备抗体的特点：产量低、纯度低产量低、纯度低，且抗体的且抗体的特异性差、灵敏度低特异性差、灵敏度低。自主阅读自主阅读P52P52：抗体的传统生产方法抗体的传统生产方法及缺陷是什么？及缺陷是什么？思思 考：如何大量获取某种特定抗体？考：如何大量获取某种特定抗体？2010-3-2613B B淋巴细胞特点：淋巴细胞特点：.每一个每一个B B淋巴细胞只能产生一种抗体。淋巴细胞只能产生一种抗体。.B.B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。.动物体内的动物体内的B B淋巴细胞可以产生百万种以上淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。疫作用。2010-3-2614怎样才能大量生产单克隆抗体？怎样才能大量生产单克隆抗体？提示提示1 1：仅用细胞培养技术可行吗？：仅用细胞培养技术可行吗？提示提示2 2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？提示提示3 3：有什么方法能使：有什么方法能使B B细胞产生抗体的能细胞产生抗体的能 力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？2010-3-26152 2、单克隆抗体的制备过程、单克隆抗体的制备过程 自学与思考：自学与思考：自学与思考：自学与思考：1 1）在从小鼠体内取）在从小鼠体内取）在从小鼠体内取）在从小鼠体内取B B淋巴细胞前应对小鼠作何种处理？淋巴细胞前应对小鼠作何种处理？淋巴细胞前应对小鼠作何种处理？淋巴细胞前应对小鼠作何种处理？为什么要这样处理？为什么要这样处理？为什么要这样处理？为什么要这样处理？2 2）从小鼠何处获取）从小鼠何处获取）从小鼠何处获取）从小鼠何处获取B B淋巴细胞？淋巴细胞？淋巴细胞？淋巴细胞？3 3）如只考虑两两融合，可能出现哪些融合类型细胞？）如只考虑两两融合，可能出现哪些融合类型细胞？）如只考虑两两融合，可能出现哪些融合类型细胞？）如只考虑两两融合，可能出现哪些融合类型细胞？4 4）是否所有杂交瘤细胞都能产生某一特定抗体？）是否所有杂交瘤细胞都能产生某一特定抗体？）是否所有杂交瘤细胞都能产生某一特定抗体？）是否所有杂交瘤细胞都能产生某一特定抗体？5 5）由特定的）由特定的）由特定的）由特定的B B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合成的杂交淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合成的杂交淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合成的杂交淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合成的杂交 瘤细胞具有什么特点？瘤细胞具有什么特点？瘤细胞具有什么特点？瘤细胞具有什么特点？6 6）最后可以通过哪些途径大量获取抗体？）最后可以通过哪些途径大量获取抗体？）最后可以通过哪些途径大量获取抗体？）最后可以通过哪些途径大量获取抗体？2010-3-2616B B淋巴细胞淋巴细胞注射特定注射特定抗原蛋白抗原蛋白骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞融合融合（只考虑两两融合）（只考虑两两融合）培养液中细胞有几培养液中细胞有几种类型？融合细胞种类型？融合细胞几种几种类型类型？骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞B B淋巴细胞淋巴细胞-B-B淋巴细胞淋巴细胞B B淋巴细胞淋巴细胞-骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞多种多种杂交细胞杂交细胞在具有筛选作用的培养基上培养在具有筛选作用的培养基上培养专一抗体检验阳性专一抗体检验阳性克隆上述杂交细胞克隆上述杂交细胞分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，检验阳性细胞检验阳性细胞单克隆抗体单克隆抗体注射到小鼠体内注射到小鼠体内体外培养体外培养第第第第1 1 1 1次筛选目的：得到杂次筛选目的：得到杂次筛选目的：得到杂次筛选目的：得到杂交瘤细胞（多种）。交瘤细胞（多种）。交瘤细胞（多种）。交瘤细胞（多种）。第第第第2 2 2 2次筛选目的：在杂交次筛选目的：在杂交次筛选目的：在杂交次筛选目的：在杂交瘤细胞中筛选出能产生所瘤细胞中筛选出能产生所瘤细胞中筛选出能产生所瘤细胞中筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。需抗体的杂交瘤细胞。需抗体的杂交瘤细胞。需抗体的杂交瘤细胞。该细胞继承该细胞继承双亲细胞双亲细胞的遗传特性，既能的遗传特性，既能产生专产生专一抗体一抗体又能又能无限增殖无限增殖。杂交瘤细胞有何特点？杂交瘤细胞有何特点？特异性强，灵敏度高特异性强，灵敏度高2010-3-2617比较项目比较项目 第一次筛选第一次筛选第二次筛选第二次筛选原理原理在选择性培养基中添在选择性培养基中添加某种药物，未融合加某种药物，未融合的亲本细胞和融合的的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长杂种细胞才能生长抗原抗原抗体的抗体的特异性结合特异性结合目标目标杂交瘤细胞杂交瘤细胞既能无限增殖，既能无限增殖，又能产生特异又能产生特异性抗体的杂交性抗体的杂交瘤细胞瘤细胞2010-3-26183.3.单克隆抗体的应用：单克隆抗体的应用：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质，并与作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质，并与 一定抗原特异性结合。一定抗原特异性结合。优点：优点：准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速用于用于运载药物：制成运载药物：制成“生物导弹生物导弹”治疗疾病：主要用于癌症治疗治疗疾病：主要用于癌症治疗2010-3-26192010-3-2620两个过程两个过程动物细胞融合过程动物细胞融合过程单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程三个三个“一一”一个诱导细胞融合的新方法一个诱导细胞融合的新方法一个新细胞一个新细胞一个优势一个优势课堂课堂小结小结灭活的病毒灭活的病毒杂交瘤细胞杂交瘤细胞单克隆抗体特异性单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势强、灵敏度高的优势2010-3-2621形成杂种细胞形成杂种细胞获得杂种植株获得杂种植株结果结果物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒物理（离心、振物理（离心、振荡、电刺激）荡、电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）诱导方法诱导方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、植物细胞全能性植物细胞全能性原原 理理动物细胞融合动物细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交比较项目比较项目1 1、植物、动物细胞融合的比较、植物、动物细胞融合的比较课堂课堂小结小结融合前处理融合前处理用纤维素酶、用纤维素酶、果胶酶去壁果胶酶去壁用胰蛋白酶用胰蛋白酶使细胞分散使细胞分散2010-3-26222 2、单克隆抗体制备过程、单克隆抗体制备过程B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞诱导诱导融合融合B-BB-B细胞细胞B-B-瘤细胞瘤细胞瘤瘤-瘤细胞瘤细胞选择培养选择培养杂交瘤细胞杂交瘤细胞（B-B-瘤细胞）瘤细胞）克隆化培养克隆化培养抗体检测抗体检测产生所需产生所需抗体的杂抗体的杂交瘤细胞交瘤细胞体外培养体外培养小鼠腹腔内增殖小鼠腹腔内增殖单克隆抗体单克隆抗体2010-3-2623B B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔A AC C 1.1.右图为某同学根据杂交瘤技术的右图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌抗体方法，设计的生产破伤风杆菌抗体的实验方案的实验方案制备单克隆抗体制备单克隆抗体不能，没有将抗原注入小鼠体内，无法不能，没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生单一抗体的获得产生单一抗体的B B淋巴细胞。淋巴细胞。(1).(1).该实验方案的目的是：该实验方案的目的是：_(2).(2).该方案能达到预期效果该方案能达到预期效果吗？为什么？吗？为什么？2010-3-2624B B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔A AC C (3)A(3)A是从小鼠的脾脏中取是从小鼠的脾脏中取得得_ _ 该细胞能该细胞能够产生够产生_ _。(4)(4)图中图中B B为为_过程，过程，常用常用_作为诱导剂，该细胞继承作为诱导剂，该细胞继承_的遗传特性，的遗传特性，既能既能_ ,_ ,又能又能_。B B淋巴细胞淋巴细胞抗体抗体细胞融合细胞融合灭活的病毒灭活的病毒双亲细胞双亲细胞产生专一抗体产生专一抗体无限增殖无限增殖2010-3-2625B B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔A AC C （5 5）_ _ 技术是单克隆抗体的技术技术是单克隆抗体的技术支持。支持。动物细胞培养动物细胞培养（6 6）单克隆抗体的特点）单克隆抗体的特点 _，并，并可大量制备。可大量制备。特异性强，灵敏度高特异性强，灵敏度高2010-3-2626