综合性实验 蛋白质的分离提取、sds聚丙烯酰胺凝胶电泳及westen印迹

蛋白质的分离提取、蛋白质的分离提取、SDS-聚丙烯聚丙烯酰胺凝胶电泳及酰胺凝胶电泳及Western印迹印迹蛋白质的分离提取蛋白质的分离提取蛋白质分子在水溶液中因其表面带有一定数量的电荷及形成水化膜使其成为稳定的胶体颗粒。在某些物理或化学因素影响下，蛋白质颗粒由于失去电荷和水化膜而沉淀。中性盐、重金属盐、三氯乙酸和乙醇等都是常用的沉淀蛋白质的试剂。、蛋白质的盐析、蛋白质的盐析大量中性盐类如硫酸铵(NH4)2SO4、硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)等加入到蛋白质溶液后，可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。各种蛋白质分子的颗粒大小颗粒大小和电荷数量电荷数量不同，用不同浓度中性盐可使各种蛋白质分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白便沉淀下来。盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性，加水稀释降低盐浓度，能使沉淀的蛋白质重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用盐析法盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。、重金属盐和三氯乙酸沉淀蛋白质、重金属盐和三氯乙酸沉淀蛋白质重金属离子如Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag+等可与蛋白质分子上的羧基羧基结合生成不溶性蛋白质金属盐不溶性蛋白质金属盐而沉淀。三氯乙酸属生物碱试剂，能与蛋白质分子上的氨基结合而沉淀。它们均可引起蛋白质分子的变性和失去生物学活性。PrNH3+COO-OH-PrNH2COO-Ag+PrNH2COOAgPrNH3+COO-CCl3COOHPrNH3+-OOCCCl3COOH、乙醇沉淀蛋白质乙醇沉淀蛋白质某些可与水混合的有机溶剂如甲醇、乙醇和丙酮等，能破坏蛋白质的水化膜，降低其在溶液中的稳定性。当加入少量中性盐如NaCl等或溶液pH接近等电点时，蛋白质胶粒上的电荷被中和，加入上述有机溶剂可使蛋白质沉淀。反应在04下进行，并应立即分离沉淀物，否则蛋白质会变性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量分子量一一 目的与要求目的与要求 1.学习电泳原理和技术 2.学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术 蛋白质是两性电解质，可带正电荷也可带负电荷。带电荷的蛋白质分子在电场中向相反的电极移动，称为电泳。血清中各种蛋白质在PH 8.6的缓冲液中都带负电荷，在电场中向正极移动。移动的速度主要决定于带电荷的多少和分子的大小。电荷多、分子小，移动就快；反之就慢。因此，利用电泳时各种蛋白质分子移动的速度不同，可将血清蛋白质分成白蛋白、1、2、球蛋白等几条区带。二二 实验原理实验原理n离子型去污剂SDS（十二烷基硫酸钠）可与蛋白质相作用，破坏蛋白质分子的非共价键，使蛋白质变性，失去原有的空间构象，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物蛋白质复合物，使各种蛋白质分子相互间只保持着分子大小的差异，彼此间原有的电荷差异被消除或大大降低。当SDS被引入聚丙烯酰胺凝胶系统并进行电泳时，样品中蛋白持原有的电荷差异已不起作用，蛋白质分子在电场中的迁移速度仅仅取决人于各自分子的大小。n将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对其分子量的对数作图时，可得到一条标准曲线。此时，将未知分子量的蛋白质样品，在相同的条件下进行电泳，就可根据此蛋白质的电泳迁移率，在标准曲线上查得它的分子量。电泳技术分类电泳技术分类几种常见电泳的比较几种常见电泳的比较类型类型优点优点缺点缺点纸电泳纸电泳设备操作简单设备操作简单分辨率差，电渗分辨率差，电渗现象现象醋酸纤维薄膜电醋酸纤维薄膜电泳泳设备操作简单，样设备操作简单，样品用量少品用量少分辨率差分辨率差琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳快速，分辨率高快速，分辨率高电渗现象严重电渗现象严重聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳可调节凝胶孔径，可调节凝胶孔径，样品用量少分辨率样品用量少分辨率高，无电渗现象高，无电渗现象高浓度凝胶难剥高浓度凝胶难剥离离聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。凝胶浓度凝胶浓度(T)(T)的选择与被分离物质分子量密切相关的选择与被分离物质分子量密切相关表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)蛋 白 质 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA)104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3图2 夹心垂直板电泳槽示意图 图3 凝胶模示意图返回不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。（1 1）样品浓缩效应）样品浓缩效应(a)凝胶孔径不连续性：(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；在pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度)当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；（c)电位梯度的不连续性：(2)(2)分子筛效应分子筛效应(3)(3)电荷效应电荷效应A.样品的浓缩效应样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括原理包括：缓冲液成分及缓冲液成分及pHpH的不连续性的不连续性电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性 缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶样品样品分离胶分离胶A.样品的浓缩效应样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括应原理包括：凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应浓缩效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移动，从浓缩胶进入分离极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。胶，速度变慢，堆积浓缩。缓缓冲液冲液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶A.样品的浓缩效应样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括应原理包括：凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应浓缩效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移动，从浓缩胶进入分离极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。胶，速度变慢，堆积浓缩。缓缓冲液冲液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶A.样品的浓缩效应样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括应原理包括：凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应浓缩效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移动，从浓缩胶进入分离极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。胶，速度变慢，堆积浓缩。缓缓冲液冲液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶A.样品的浓缩效应样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括应原理包括：凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应浓缩效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移动，从浓缩胶进入分离极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。胶，速度变慢，堆积浓缩。缓缓冲液冲液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶B.B.电荷效应电荷效应蛋白质样品进入分离胶后蛋白质样品进入分离胶后 pHpH增大增大(pH 8.9)(pH 8.9)，GlyGly解离解离度增大，不存在快、慢离子度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电之分，蛋白质样品在均一电场强度和场强度和pHpH条件下泳动。条件下泳动。由于各种蛋白质由于各种蛋白质pI不同，所不同，所载有效电荷不同，因此质点载有效电荷不同，因此质点的的 有效迁移率不同，形成不有效迁移率不同，形成不同区带。同区带。缓缓冲液冲液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶C.C.分子筛效应分子筛效应分离胶的孔径小，各分分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出所受阻力不同，表现出不同的不同的 泳动速度，即分泳动速度，即分子筛作用。分子量小，子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度形状为球形的泳动速度最快。最快。缓缓冲液冲液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。三三 操作步骤操作步骤 贮液及凝胶溶液的配制贮液及凝胶溶液的配制贮液及凝胶溶液的配制方法如下表。贮液及凝胶溶液的配制方法如下表。贮液及凝胶溶液的配制贮液及凝胶溶液的配制贮 液20mL凝胶溶液混合比 5%凝胶 10%凝胶I Acr 30g凝胶贮液 Bis 0.8g 加蒸馏水到100ml凝胶缓冲液 SDS 0.2g 加0.2mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液至 100mlTEMED 蒸馏水100g/L过硫酸铵 过硫酸铵1g 加蒸馏水至10ml3.33ml10ml35 l4.57ml以上溶液混合后抽气10min0.1ml6.67ml10ml35 l1.23ml0.1ml 操作方法操作方法1.安装夹心式垂直板电泳槽 (1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。(2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。(3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。(4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。(5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。SDS-PAGE分离蛋白质1.安装膜具装封胶条，注意封胶条平面朝下，不能有裂口盖上凹玻璃将凹玻璃冲外装进槽里将楔子插进，将底部插紧 2.制备凝胶板制备凝胶板 将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1 cm。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约34 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。将上、下贮槽的蒸馏水倒去，将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)，距短玻璃上缘0.5 cm处，轻轻加入样品槽模板.在上、下贮槽中加入蒸馏水，但不能超过短玻璃板上缘。静置电泳槽，10 min左右，上胶即可聚合，再放置10-20 min，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5 cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。n 配制凝胶溶液配制凝胶溶液n灌胶，加到顶部，来回倾斜去气泡灌胶，加到顶部，来回倾斜去气泡插入梳子胶凝后用夹子将玻璃夹出用夹子夹紧玻璃将封胶条轻轻撕掉旋转180度，凹玻璃向里将玻璃放进槽内加缓冲液样品制备样品制备n一般是蛋白质溶解在含10g/L SDS、10g/L巯基乙醇的0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液中，在100加热25min。蛋白质的最后浓度一般为0.051g/L。n也可以将上述溶液在37保温2h而不是100加热。一般说来，两种处理的效果都一样。但如蛋白质样品中混有少量蛋白水解酶，37处理就会引起样品水解，使测定失败，而100加热3min一般都能使蛋白酶失活，得到满意的结果。也有少数例外的情况，需要采用特殊的样品处理方法。样品的处理及加样样品的处理及加样 将样品按0.51 mg/mL加样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子(不要塞紧，以免加热时迸出)，在100沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。用微量进样器取10 l上述混合液，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。加 样5.电泳电泳 将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，接通冷却水，打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源及冷却水。6.染色与脱色染色与脱色电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。加入染色液染色1-2 h，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。剥 胶7.结果处理量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR:相对迁移率mR=蛋白质样品距加样端迁移距离(cm)溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)样品溶解液：0.01mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液，内含1%SDS，1%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝。用来溶解标准蛋白质及待测蛋白质样品。配制方法如下：SDS 100mg 巯基乙醇 0.1ml 甘油 1ml 溴酚蓝 2mg 0.2mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液 0.5ml 加蒸馏水至总体积 10ml电极缓冲液：0.1%SDS，0.1mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液。配制方法：取1gSDS，加入500ml 0.2mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml。染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250，加入50%甲醇水溶液454ml和冰乙酸46ml。脱色液：75ml冰乙酸，875ml蒸馏水与50ml甲醇混合。蛋白质印迹分析技术蛋白质印迹分析技术(Western Blotting)(Western Blotting)一、目的要求一、目的要求 应用蛋白质印迹分析技术，分析经SDS-PAGE电泳分离并转移到硝酸纤维素薄膜上的细胞特定蛋白成分。二、实验原理二、实验原理n SDS-PAGE分离后的蛋白质样品，经电转移固定在固相支持物（如：硝酸纤维素薄膜）上，固相支持物以非共价键形式吸附蛋白质。n然后，以固相支持物上的蛋白质作为抗原，与相应的抗体，即第一抗体起免疫反应，再与酶、同位素或其它标记物标记的以第一抗体为抗原的第二抗体起反应，采用底物显色或放射自显影等方法即可观察分析电泳分离的特异蛋白质成分。标记的二抗一抗蛋白膜免疫印迹实验包括免疫印迹实验包括5个步骤：个步骤：1、固定固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并从胶上转移到硝酸纤维素（Nitrocellulose，简称NC）簿膜上。2、封闭封闭：用牛血清白蛋白或脱脂奶粉封闭膜，主要目的是为了减少特异抗体对膜上其它部位的非特异性吸附。3、第一抗体结合第一抗体结合：是特异性的。4、第二抗体结合第二抗体结合：对于第一抗体是特异性的并作为指示物。5、被适当保温后的酶标记蛋白质条带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。Western blot三、操作步骤三、操作步骤先从玻璃板内取出凝胶，将凝胶在电转移缓冲液浸泡一下（先把Whatman 3MM滤纸及硝酸纤维素薄膜在电转移缓冲液浸泡10分钟），按照下图所示夹心方法把Whatman 3MM滤纸、凝胶、硝酸纤维素薄膜、石墨板依顺序放好，操作时注意驱赶气泡。电转移条件为常温1Am/cm2 恒流约1.5 hr。15层滤纸凝胶15层滤纸NC膜石墨板石墨板（1）蛋白质电泳常用SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质Tris-Tricine胶中电泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离效果。戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜1530min，如果是PVDF膜，必须先用甲醇激活后浸泡。方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极。排去滤纸、胶和膜间的气泡。电转时间：100V 1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活 选择转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率。膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置。（2）转膜）转膜（3）封闭）封闭用5脱脂奶粉或3BSA （含（含0.1Tween20 TBS或或PBS配制）配制）时间：室温2h或4C过夜（4）显色或显影）显色或显影显色 辣根过氧化物酶：底物为DAB 碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT化学发光显影化学发光显影 最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品）注意：化学发光前将膜用不含注意：化学发光前将膜用不含Tween20的的TBS或或PBS洗涤一次洗涤一次 曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定化学发光后的硝酸纤维素膜用Stripping Buffer洗涤后（洗涤Buffer:62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2SDS和100mm的 2ME）用不同的一抗进行杂交，检测其它蛋白的表达情况。一张膜可以重复使用34次。碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交（5）膜的再利用）膜的再利用（四）免疫学检测（四）免疫学检测 1、将转移好的硝酸纤维素薄膜于ddH20中浸洗数次，取1毫升10倍浓度的丽春红S溶液，加9毫升的ddH2O混匀，于一相当于膜大小的染色皿中，小心将薄膜转移于染色皿内，其内轻摇动染色液，染色3-10 min。然后倒弃染色液，加入少许ddH2O漂洗数次，用铅笔标出分子量标准蛋白条带与阳性对照条带。2、用ddH2O漂洗后，将硝酸纤维素薄膜置于封闭缓冲液，室温封闭:37反应约0.5 hr，以封闭未吸附蛋白的部位。3、取出膜，将硝酸纤维素薄膜与用封闭缓冲液适当稀释的第一抗体37反应约0.5 hr，其间不停地在摇床上晃动。4、取出膜，将硝酸纤维素薄膜在清洗缓冲液中晃动清洗30分钟，每5 min换一次清洗缓冲液，5、取出膜，将硝酸纤维素薄膜与用封闭缓冲液适当稀释的酶标记第二抗体37反应约0.5 hr，其间不停地在摇床上晃动。6、用50mM Tris-HCl pH6.8清洗3次。7、加入DAB溶液，显色510min，出现棕色带者为阳性，用自来水冲洗以终止酶的反应。保存硝酸纤维素薄膜或拍照作记录。四、结果四、结果如果所检测特异性蛋白存在，则会出现相应条带。五、应用意义五、应用意义Western blotting是用于分离蛋白质的一种成熟的方法，它广泛应用于蛋白质特征和结构的研究。